星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選小兒益肺健脾煎膏劑提取工藝研究

韋艷萍 譚梔恩 陀海燕 曾佩琴 劉雅婷 覃柳馨 易 蔚 陳衛(wèi)衛(wèi),2,3

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2.廣西中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西壯瑤藥重點實驗室，廣西南寧 530001

小兒益肺健脾煎膏劑出自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，具有健脾益氣、消食化積、調(diào)和營衛(wèi)、斂汗生津的功效，主要用于治療小兒肺脾氣虛、免疫力低下、自汗、腹脹厭食、便溏等病癥，效果良好。該方由陳皮、太子參、白術(shù)、山藥、蓮子肉、桂枝、炒山楂、炒雞內(nèi)金、炒麥芽、桔梗、浮小麥等組成，臨床以湯劑入藥，存在臨用需煎煮、服用劑量大、患者順應(yīng)性差、易霉變、攜帶儲存不便等缺點，為使其攜帶、服用方便且能達(dá)到較高的利用率，將湯劑改為煎膏劑。煎膏劑有效物質(zhì)浸出量較多，利用率高，可服用較長時間，吸收快，服用方便，較易貯存，益于滋補，適用于慢性病和久病體虛者。陳皮、太子參、白術(shù)為君藥，具有平補脾胃之氣、健脾益肺的功效[1-4]；臣藥以山藥、蓮子肉助君藥健脾益氣，輔白術(shù)以健脾滲濕，桂枝溫養(yǎng)脾胃、調(diào)和營衛(wèi)；佐以炒山楂、炒雞內(nèi)金、炒麥芽消食化積，使上下氣機貫通則脾胃運化健旺，腹脹厭食可除；桔梗宣肺利氣、載藥上行、培土生金，浮小麥固澀斂汗，共為佐使之用。君藥陳皮中的橙皮苷能夠增強機體免疫功能[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究[5-7]顯示，太子參中苷類及多糖類等成分能夠提高機體免疫功能，白術(shù)多糖與白術(shù)揮發(fā)油均有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[8-11]。以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，運用現(xiàn)代制劑技術(shù)，對處方藥材有效成分提取精制，制成小兒益肺健脾煎膏劑，夠調(diào)節(jié)身體機能，起到健脾益氣的效果，提高小兒免疫力，滿足小兒健康成長需求，具有廣闊的開發(fā)空間和潛在的市場前景，值得深入研究與開發(fā)。

結(jié)合工業(yè)化大生產(chǎn)特點及實際科研情況，將橙皮苷含量和干膏率的總評“歸一值”（OD）值作為評價指標(biāo)，按照單因素試驗和二因素五水平星點設(shè)計進行提取工藝實驗優(yōu)選小兒益肺健脾煎膏劑提取工藝，為該制劑的后續(xù)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters 2695，美國Waters 科技有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9420MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備）；Thermo 離心機（TGL-16G，賽默飛世爾科技公司）；電子天平（JM-A5002，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；超純水器（UPC-II-10T，四川優(yōu)普超純科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-12，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；電子調(diào)溫電熱套（98-1-B，天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：110721-201617）；甲醇（色譜純，美國Fisher 公司，批號：178500）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司，批號：175165）；磷酸（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；批號：20161202）；水為超純水；藥材購自廣西仙茱中藥科技有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級實驗師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》[12]2015 年版一部要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定橙皮苷含量

2.1.1 色譜條件

采用反相色譜柱Inertsil ODS-3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%磷酸溶液（C）作為流動相，梯度洗脫0～30 min（A：10%～30%，B：10%～30%，C：10%～40%），流速為1 mL/min，檢測波長為283 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱定適量橙皮苷對照品，加80%甲醇制成含0.80 mg/mL 的橙皮苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取處方量藥材，加入9 倍水，煎煮法提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，定容。取適量溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.4 陰性干擾溶液的制備

稱取除陳皮外的所有藥材，按“2.1.3”項下方法制備陰性干擾溶液。

2.1.5 測定法

分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性干擾溶液，進樣量為10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6 方法學(xué)考察

2.1.6.1 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液8、10、12、14、16、18 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定。以對照品進樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得回歸方程Y=1277.527 88 X+7.284 272 9（r=0.99996），結(jié)果表明橙皮苷進樣量在0.8000～1.8000 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.6.2 精密度試驗 按“2.1.1”項下色譜條件，精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液，重復(fù)進樣6 次，測定峰面積，RSD 為1.37%，表明儀器的精密度良好。見表1。

表1 精密度試驗（n=6）

2.1.6.3 重復(fù)性試驗 稱取同一批藥材6 份，按“2.1.3”項下制備樣品溶液，測定橙皮苷峰面積，RSD 為1.24%，表明測定方法的重復(fù)性良好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）

2.1.6.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，在0、4、12、24、36、48 h 進樣，測定橙皮苷峰面積，RSD 為1.86%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n=6）

2.1.6.5 回收率試驗 精密稱定同一批藥材9 份，按樣品中成分80%、100%、120%的比例加入對照品各3 份，按“2.1.3”項下供試品溶液，測定橙皮苷含量，平均回收率分別為97.02%、97.58%、98.18%，RSD 分別為2.09%、1.86%、1.83%。加樣回收率（%）=（測得量-原有量）/加入量×100%。見表4。

表4 加樣回結(jié)果（n=9）

2.1.7 樣品含量測定

精密稱取3 批藥材，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，測定峰面積，計算得出橙皮苷的平均含量為321.432 mg/g，RSD 值為1.88%。見表5。

表5 含量測定結(jié)果（n=3）

2.2 干膏率的測定

精密吸取定容后的供試品溶液20 mL，置恒重蒸發(fā)皿，水浴蒸干后，105℃下干燥5 h，置干燥器冷卻至室溫，迅速精密稱定，干燥1 h，至連續(xù)兩次重量差異≤5 mg，計算干膏率（%）[13-14]。干膏率=（干膏重量/取樣體積）×（藥液體積/藥材重量）×100%。

2.3 藥材吸水率的考察

稱取同批藥材6 份，加10 倍量水浸泡0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 濾凈水稱重[15]，吸水率%=（濕藥材重量-干藥材總重量）/干藥材總重量×100%。見表6。

表6 吸水率考察結(jié)果（%，n=6）

3 單因素試驗與結(jié)果

基于原方提取工藝、成本考慮，選擇水提取。綜合考慮能源損耗、后續(xù)放大生產(chǎn)的合理性、提取次數(shù)的非連續(xù)性，提取兩次。綜合預(yù)實驗結(jié)果及文獻(xiàn)報導(dǎo)對橙皮苷含量、干膏率測定影響較大的加水倍數(shù)和提取時間[16-18]兩個因素水平的合理取值范圍進行考察。

3.1 提取時間的考察

稱取藥材7 份，分別加10 倍量水，煎煮兩次，每次60、90、120、150、180、210、240 min，濾過，合并濾液，定容，離心，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過。按“2.1.1”項下色譜條件與“2.2”項下方法測定橙皮苷含量和干膏率。由表7 可知，橙皮苷含量和干膏率隨提取時間增加而增加，240 min 時橙皮苷含量略有下降，干膏率無明顯變化。故提取時間范圍選為90～240 min。

表7 提取時間考察結(jié)果

3.2 加水倍數(shù)的考察

稱取7 份藥材，分別加入6、9、12、15、18、21、24 倍水，煎煮2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，定容，離心，微孔濾膜過濾，按“2.1.1”項下色譜條件與“2.2”項下方法測定橙皮苷含量和干膏率。由表8 可知，橙皮苷含量和干膏率均隨加水倍數(shù)增大而升高，加水倍數(shù)為21 倍時，干膏率不再明顯增加，故加水倍數(shù)范圍為9～24 倍。

表8 加水倍數(shù)考察結(jié)果

4 提取工藝優(yōu)選

4.1 試驗設(shè)計

基于單因素試驗結(jié)果及實際生產(chǎn)經(jīng)驗，提取2 次，將加水倍數(shù)、提取時間作為考察因素，按星點設(shè)計原理，進行二因素五水平試驗。見表9。

表9 因素與水平表

4.2 星點設(shè)計實驗安排及結(jié)果

采用Hassan 方法標(biāo)準(zhǔn)化的將本實驗評價指標(biāo)（橙皮苷含量和干膏率）取值越大越好分別轉(zhuǎn)化為0～1 間的OD 值，按OD=（d1×d2…dk）1/k（k 為指標(biāo)數(shù)），轉(zhuǎn)換公式為di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）[19-20]。見表10。

表10 星點設(shè)計實驗安排及結(jié)果

4.3 模擬擬合

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 進行數(shù)據(jù)分析，以O(shè)D 值對兩因素進行多元線性回歸，多元擬合方程為Y=-1.138 35+0.049 458X1+5.481 28×10-3X2（r=0.8823，P ＜0.01），表明OD 值與兩個影響因素之間線性相關(guān)較差，回歸擬合度不佳，預(yù)測性不好，該模型不合適，故采用多元二次項擬合分析。二次項擬合方程為Y=-3.374 60+0.186 70X1+0.020 304X2-1.78142×10-4X1X2-3.268 25×10-3X12-3.600 96×10-5X22（r ＝0.9724，P ＜0.01）。表明非線性r 值較高，擬合效果較好。

4.4 方差分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，由表11 可知，多元二次項回歸方程失擬檢驗無顯著性，未知因素對試驗結(jié)果影響很小。模型具有高度顯著性，該方程與實際情況擬合較好，很好地反映了此模型的可靠性。除X1X2回歸系數(shù)不顯著外，其他均達(dá)到顯著水平。

4.4 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，得到三維效應(yīng)曲面圖和等高線圖，由圖3～4可知加21 倍量水、提取212 min 時，預(yù)測總評OD 值為1.001 61。結(jié)合實驗操作及實際工業(yè)大生產(chǎn)情況，最佳工藝條件確定為加21 倍量水，提取2 次，每次212 min。

表11 方差分析結(jié)果

圖3 加水倍數(shù)和提取時間對總評OD 影響的三維效應(yīng)面圖

圖4 加水倍數(shù)和提取時間對總評OD 影響的二維等高圖

4.5 驗證試驗

依上述最優(yōu)工藝進行實驗。實測OD 值為0.836 30，較方程預(yù)測值，偏差率[21，23]為-16.531%。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。見表12。

5 討論

參考《中華人民共和國藥典》[12]2015 年版陳皮藥材含量測定方法，考察流動相（甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸）全梯度洗脫，結(jié)果甲醇-0.1%磷酸分離時間較長，乙腈-0.1%磷酸分離度不穩(wěn)定，優(yōu)化甲醇-乙腈-0.1%磷酸，橙皮苷含量測定分離效果好?？疾觳煌鶞兀?5℃、30℃、35℃）的分離效果，35℃時，分離時間較快、效果好。

研究表明[5-7]，太子參有效成分多糖能增強免疫功能，但含量較低且測定方法繁瑣，可操作性差。白術(shù)有效成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ具有健脾作用[24-25]，但其含量較低及原料含量差異大，品質(zhì)難以把控，故不考慮作為檢測指標(biāo)。君藥陳皮有效成分橙皮苷能夠調(diào)節(jié)免疫功能，從而起到健脾作用[1-3]，故將君藥陳皮中橙皮苷含量作為檢測指標(biāo)，太子參與白術(shù)作為定性檢測，把控制劑質(zhì)量。

正交設(shè)計法、均勻設(shè)計法作為國內(nèi)比較成熟的試驗設(shè)計優(yōu)化方法，簡單易行，結(jié)果易得，但精度不夠。星點設(shè)計-效應(yīng)面法更全面，試驗次數(shù)較少，試驗精度高，并適用于多因素、多水平試驗、數(shù)據(jù)處理簡便。試驗結(jié)果由軟件直接讀出，并進行預(yù)測，減少主觀因素的影響[26-27]。因此，本實驗采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化小兒健脾益肺煎膏劑提取工藝，實際值與預(yù)測值偏差在合理范圍內(nèi)，表明此方法預(yù)測效果良好、可靠。

表12 驗證試驗結(jié)果