定點(diǎn)突變鑒定Myxococcus sp.V11麥芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心

陳允妲，李雪亮，吳映函，趙曉艷，吳曉玉，王 飛*，陳金印

（1.江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省果蔬保鮮與質(zhì)量安全創(chuàng)新中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】海藻糖（Trehalose），又名蕈糖，是由2 個(gè)吡喃環(huán)葡萄糖分子以a，a-1，1 鍵連接而成的雙糖，化學(xué)名為a-D-吡喃葡糖基a-D-吡喃葡糖苷[1-2]。海藻糖作為一種天然糖類，它在自然界的動(dòng)植物和微生物中廣泛存在，對(duì)生物有抗脫水、抗冷凍保護(hù)和抗高滲保護(hù)等多種作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用淀粉為底物直接生產(chǎn)海藻糖涉及2種酶，麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyltrehalose synthase，MTSase，由TreY 基因編碼）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase，由TreZ 基因編碼）[3]，作用途徑（TreY-TreZ）如下：麥芽寡糖在MTSase作用下通過(guò)轉(zhuǎn)糖苷作用，將起始的2個(gè)葡萄糖之間的a，a-1，4 鍵扭轉(zhuǎn)成為a，a-1，1 鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖，繼而在MTHase 水解作用下，將起始的海藻糖從麥芽寡糖基上水解下來(lái)，形成麥芽寡糖（比初始底物少2 個(gè)葡萄糖基）和1 分子的海藻糖[4]。α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）是一種水解淀粉α-1，4-葡萄糖苷鍵，生成低聚麥芽糖和葡萄糖的糖苷水解酶類，在食品發(fā)酵、制藥等領(lǐng)域廣泛利用。在根據(jù)蛋白質(zhì)的序列同源性分類的CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)中，GH13家族被認(rèn)為是最主要的α-淀粉酶家族，具有4-7個(gè)保守的序列區(qū)，包括了Asp-Glu-Asp 的催化三聯(lián)體和重要的底物結(jié)合位點(diǎn)[5]，而這些特征在MTHase中也同時(shí)具有[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)驗(yàn)室分離篩選到的一株粘細(xì)菌Myxo?coccussp.V11在子實(shí)體形成階段，細(xì)胞內(nèi)可積累10倍于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞階段的海藻糖，通過(guò)基因組掃描發(fā)現(xiàn)存在著一個(gè)TreY-TreZ 合成途徑，分別由orf6342 和orf3024 編碼，將orf3024（TreZ，mthase）異源表達(dá)后發(fā)現(xiàn)不能以麥芽寡糖基海藻糖水解為底物，而是具有淀粉水解活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文通過(guò)對(duì)推測(cè)的幾個(gè)活性中心位點(diǎn)進(jìn)行突變，來(lái)考察其功能。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E.coliDH5α（pET-29a-mthase）克隆菌株（含麥芽糖基海藻糖水解酶mthase基因），E.coliBL21（pET-29a-mthase）表達(dá)菌株，克隆菌株E.coliDH5α，表達(dá)宿主菌株E.coliBL21（DE3）均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

CaCl2，NaOH，Tris，HCl，EDTA，SDS，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。瓊脂糖凝膠、考馬斯亮藍(lán)G250，牛血清蛋白，卡那霉素（Km）購(gòu)于上海生工。質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自TransGen Biotech 公司；質(zhì)粒提取回收試劑盒購(gòu)自北京派泰克生物技術(shù)有限公司。引物合成及核酸測(cè)序委托湖南擎科生物科技有限公司。

LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH 7.0～7.2。

1.2 儀器

PCR 擴(kuò)增儀（Biometre T1）、Beckman臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22R）、DYCP-31DN水平核酸電泳儀、Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳儀等。

1.3 引物

定點(diǎn)突變引物序列見(jiàn)表1。

表1 MTHase定點(diǎn)突變PCR擴(kuò)增所用引物Tab.1 Primers used for PCR amplification of MTHase directed mutation

1.4 氨基酸序列分析及突變位點(diǎn)的選擇

將菌株V11 所產(chǎn)MTHase 氨基酸序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，與已報(bào)道的MTHase 進(jìn)行比對(duì)，下載相似度高的序列。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，BioEdit 7.0進(jìn)行序列比對(duì)，分析保守氨基酸序列和活性中心氨基酸殘基。以Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)在線建模。

1.5 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變

以提取的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行重疊延伸PCR 擴(kuò)增，PCR 體系為2× TransStart FastPfu PCR SuperMix 12.5μL，正向引物1.0μL，反向引物1.0μL，質(zhì)粒DNA 1.0μL，ddH2O 9.5μL。

PCR 程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2～5 min，95 ℃變性，55 ℃退火，72 ℃10 min，30 個(gè)循環(huán)，然后用0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

RCR 產(chǎn)物經(jīng)DMT 酶（改良型的DpnI 限制性核酸內(nèi)切酶）消化非突變型質(zhì)粒模板后，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞[7-9]。陽(yáng)性克隆經(jīng)電泳檢測(cè)，大小無(wú)誤后，送樣品至祥音生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建突變表達(dá)菌株。

1.6 重組酶表達(dá)純化

野生型和突變型的表達(dá)菌株接種至400 mL LB液體培養(yǎng)基（含有80 mg/L Kan），37 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入80μL 0.5 mmol/L IPTG，16 ℃誘導(dǎo)24 h。

將培養(yǎng)好的菌液12 000 r/min 離心5 min 收集菌體，用20 mL Tris-HCl 緩沖液（pH7.0，20 mmol/L）重懸洗滌菌體。12 000 r/min 離心5 min 后再以10 mL Tris-HCl 緩沖液重懸，超聲破碎。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清即為粗酶液。Ni2+-NTA 親和層析柱預(yù)處理后將粗酶液上樣，冰浴30 min。20 mL Tris-HCl 緩沖液（pH7.0，20 mmol/L）穿過(guò)，以含200 mmol/L 咪唑的20 mL Tris-HCl 緩沖液（pH7.0，20 mmol/L）洗脫，SDS-PAGE 電泳檢測(cè)表達(dá)情況[10]。洗脫液在4 ℃下以截留分子量10 ku 的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）緩沖液中透析過(guò)夜去除咪唑。蛋白含量測(cè)定采用Bradford法[11]。

1.7 酶活測(cè)定方法

在含有底物玉米淀粉（0.03%，m/v）的Tris-HCl 緩沖液（20 mmol/L，pH6.5）中加入適量純酶，40 ℃水浴反應(yīng)3 h，用DNS 法測(cè)量，計(jì)算酶活。比較野生型（WT）和突變型（D256A，E291A，D386A 的單位酶活力）。酶活力定義：在40 ℃反應(yīng)體系下，每分鐘催化生成1μmoL 麥芽糖所需要的蛋白質(zhì)含量（mg）1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTHase的突變位點(diǎn)的選擇

將菌株V11 所產(chǎn)MTHase 氨基酸序列提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，與已報(bào)道的MTHase 進(jìn)行比對(duì)，下載相似度高的序列，利用MEGA 6.0軟件，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Myxococcus sp.V11 MTHase系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of MTHaseof Myxococcus sp.V11

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明Myxococcussp.V11 所產(chǎn)MTHase 與已報(bào)道的Deinococcus radiodurans所產(chǎn)麥芽寡糖基海藻糖水解酶（Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase，DR0464）相似度最高，但僅為49.23%，與已報(bào)道的淀粉酶相似度則有較大差異。

將Myxococcussp.V11 所產(chǎn)MTHase 與已解析的麥芽寡糖基海藻糖水解酶：來(lái)源于Deinococcus radio?durans（2BHU）[12]，來(lái)源于Saccharolobus solfataricus（1EH9）[13]，來(lái)源于Salmonella enterica（3M07）[13]氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。麥芽寡糖基海藻糖水解酶具有幾個(gè)嚴(yán)格保守的區(qū)域：GTFTPEG、WGYDG、ED、GLXVXLDXVXNHXGPXGNY、DGXRXDA、IQNHDQ。三聯(lián)體活性中心（Asp256-Glu291-Asp386）[14]均位于保守區(qū)域之內(nèi)。因此，擬將活性中心的3個(gè)氨基酸統(tǒng)一突變成沒(méi)有側(cè)鏈的Ala，通過(guò)觀測(cè)其催化活性的變化來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 MTHase與其它TreZ氨基酸序列的比較Fig.2 Comparison of amino acid sequences of different Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolases

2.2 MTHase基因的定點(diǎn)突變

以表達(dá)載體pET-29a-mthase為模板，按表1 所設(shè)計(jì)的D256A、E291A、D386A 引物，按定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增突變質(zhì)粒，重疊延伸PCR 產(chǎn)物凝膠回收后與DMT 在37 ℃下孵育1 h，熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，陽(yáng)性克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。以pET29a 空載和pET29a-mthase（WT）為對(duì)照，0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖3）。重組質(zhì)粒大小為7 kb 左右，其超螺旋大小位于5 kb 左右。將大小無(wú)誤的質(zhì)粒送至湖南擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的突變質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3），構(gòu)建表達(dá)菌株。

圖3 重組質(zhì)粒電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of site-directed mutagenesis mthase by overlapping PCR.

2.3 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將野生型和突變型MTHase進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體后，超聲波破碎，12 000 r/min離心20 min 后，上清液以Ni2+-NTA 進(jìn)行純化（圖4）。

圖4 突變型和野生型MTHase的SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)Fig.4 Analysis of the expression of the mutant enzymes on SDS-PAGE

SDS-PAGE 結(jié)果顯示野生型海藻糖水解酶的蛋白質(zhì)量約為68 ku，野生型WT和突變型D256A、D386A 都能夠可溶性大量表達(dá)，但突變型E291A 表達(dá)量卻非常低，并且也沒(méi)有大量形成包涵體，這一氨基酸位點(diǎn)的改變對(duì)表達(dá)的影響機(jī)制尚不清楚。

2.4 突變酶的催化活性

對(duì)純化所得重組酶洗脫液進(jìn)行蛋白定量后，取1.11 mg重組酶，加入終濃度為0.03%底物淀粉后，在pH6.5、40 ℃水浴中反應(yīng)3 h，以DNS 顯色，測(cè)定酶活。結(jié)果顯示突變型D256A、D386A 和E291A的活性均喪失，只有野生型能夠測(cè)出酶活（圖5）。

圖5 野生型與突變體酶活對(duì)比Fig.5 Compared with activity of mutant recombinant MTHase and wild-type

2.5 MTHase同源建模

菌株Myxococcussp.V11 所產(chǎn)MTHase 與2BHU 相似度達(dá)49%，可以通過(guò)同源建模的方式來(lái)推測(cè)其三維結(jié)構(gòu)。以2BHU為模板，在Swiss-Model進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)圖6。

MTHase 分子呈橢圓形，由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（圖6a），催化結(jié)構(gòu)域Domain A（Ala95-Asp316，Gln372-Ser512）形成一個(gè)典型的（α/β）8桶狀結(jié)構(gòu)（圖6b），這一結(jié)構(gòu)是糖苷水解酶GH13家族的典型特征[15]。這一家族的糖苷酶包括α-淀粉酶、支鏈淀粉酶、環(huán)麥芽糊精酶、6-磷酸海藻糖水解酶、α-葡萄糖苷酶、海藻糖合酶、淀粉和蔗糖磷酸化酶等[16]。Domain A 的中間形成一個(gè)裂口，活性中心位于口袋之內(nèi)；N 端結(jié)構(gòu)域（Domain B）主要為β-折疊結(jié)構(gòu)（圖6b），Domain C 的差異性則被認(rèn)為與底物特異性相關(guān)。催化三聯(lián)體Asp256-Glu291-Asp386 位于靠近Domain C 的位置（圖6c），其中Glu291 提供質(zhì)子用于水解糖苷鍵，Asp256 為親核試劑，Asp386 起著穩(wěn)定構(gòu)象的作用。圖6c 顯示MTHase 的Asp386（紅色）與2BHU 的Asp400（藍(lán)色）構(gòu)象略有差異，這一改變是否對(duì)活性有影響尚待驗(yàn)證。

圖6 MTHase的三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 3D structure of MTHase and 2BHU

3 結(jié)論與討論

麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase和淀粉酶amylase同屬于GH13糖苷酶家族，后者隨機(jī)切割淀粉分子內(nèi)部的α-1，4 糖苷鍵，前者則對(duì)存在于海藻糖分子之后的α-1，4 糖苷鍵有更強(qiáng)作用。通常情況下，MTHase 也具有淀粉水解功能，雙功能催化中心可能共用，但有些糖苷酶如海藻糖合酶的活性中心由不同的結(jié)構(gòu)域組成。

本文通過(guò)定點(diǎn)突變的方法對(duì)預(yù)測(cè)的菌株Myxococcussp.V11所產(chǎn)MTHase活性中心的3個(gè)氨基酸殘基Asp256-Glu291-Asp386進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)這3個(gè)位點(diǎn)氨基酸的改變直接導(dǎo)致淀粉酶活力的喪失，突變重組酶以底物海藻糖－麥芽糖基進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，同樣也沒(méi)有測(cè)到酶活。表明MTHase的催化中心正是由Asp256-Glu291-Asp386所構(gòu)成。

學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為GH13 家族糖苷酶對(duì)不同底物的適應(yīng)性主要與底物結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)有關(guān)[17-21]，MTHase 與底物分子麥芽糖基海藻糖的第1 個(gè)葡萄糖苷連接的氨基酸分別為Gly197，Pro198，Gly200，Asn201，Tyr202，Trp210 均與2BHU 一致（圖6d）；第2 個(gè)葡萄糖苷連接的氨基酸Asp316，Asp317，His320，Tyr337，Arg366，Asn390 也與2BHU 一致，唯一的區(qū)別是2BHU 里的Glu376 在MTHase 中被替換成了Leu362（圖6e）；與第3個(gè)葡萄糖苷連接的氨基酸Trp219，Arg452，Glu455也與2BHU一致，不同的是2BHU里的Phe452 在MTHase 中被Tyr436 所替換（圖6f）。導(dǎo)致MTHase 的活性表現(xiàn)為淀粉酶活性的原因是否由于Glu362Leu和Phe436Tyr所致尚待進(jìn)一步研究。