2015-2019年分離的SA菌株臨床分布、藥敏檢測(cè)及基因分型特征分析

張迪，張春麗，牛雷，樓小偉，邱紅

（1.中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)檢驗(yàn)科，江蘇南京210002；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210002）

金黃色葡萄球菌（SA）是醫(yī)院感染常見(jiàn)致病菌，以急性、化膿性為主要感染特征，其臨床分離株中有多種毒素及侵襲性酶類(lèi)，致病力極強(qiáng)，可導(dǎo)致局部皮膚軟組織化膿性感染、肺炎、心包炎、腸炎、敗血癥等多種嚴(yán)重感染類(lèi)型，增加住院患者病死率[1?2]。近些年來(lái)，隨著抗生素的不合理應(yīng)用，以及中心靜脈置管、透析、介入手術(shù)等侵入性操作應(yīng)用對(duì)機(jī)體防御機(jī)制的影響，SA感染及耐藥菌株檢出率均呈上升趨勢(shì)，給醫(yī)院感染控制帶來(lái)重大挑戰(zhàn)[3]。本研究調(diào)查了本院2015-2019年共1 048株SA菌株，通過(guò)了解其臨床分布特征、耐藥性以及耐藥基因情況，旨在為醫(yī)院進(jìn)行針對(duì)性感染防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院秦淮醫(yī)療區(qū)2015-2019年從各類(lèi)臨床標(biāo)本中分離出的1 048株SA菌株，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。標(biāo)本來(lái)源于患者創(chuàng)傷分泌物、痰液、血液、中段尿、導(dǎo)管、引流液及其他如腔積液（胸水、腹水、盆腔積液等）、灌洗液、穿刺液、乳汁、膽汁等等，申請(qǐng)檢查科室包括重癥醫(yī)學(xué)科（ICU）、骨科、燒傷整形科、神經(jīng)外科、呼吸科等多個(gè)科室。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)

SA標(biāo)本采集、分離參照第3版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作流程》，試驗(yàn)菌株采用哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取單個(gè)菌落，通過(guò)革蘭染色及觸酶試驗(yàn)證實(shí)，采取傳統(tǒng)劃線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基分離純化，細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)采用法國(guó)梅里埃公司VI?TEK 2 Compact全自動(dòng)微生物生化藥敏分析系統(tǒng)，革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡（GP）、革蘭陽(yáng)菌藥敏卡（GP67），質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。鑒定后的菌株于-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 耐藥基因檢測(cè)

金黃色葡萄球菌DNA提?。河?8～40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇保存菌株，移植到6 mL LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)16 h；對(duì)所有接受苯唑西林藥敏試驗(yàn)菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，挑選培養(yǎng)基單個(gè)茁壯菌落，加入離心管（內(nèi)含250μL雙蒸水）充分混勻，再加入溶葡萄球菌素、蛋白酶K，于37℃條件下反應(yīng)1 h，再加熱煮沸15 min，離心3 min（離心半徑8.7 cm、轉(zhuǎn)速10 000 r/min），轉(zhuǎn)移上清液到離心管，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA提取，于-20℃條件下保存。設(shè)計(jì)耐藥基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增引物序列，引物均由北京索萊寶科技有限公司合成（引物序列見(jiàn)表1），PCR儀為美國(guó)伯樂(lè)公司T100梯度PCR儀。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：上下游引物各1μL，三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）3.2μL，10×buffer緩沖液2μL，無(wú)菌蒸餾水5μL，MgCl 4μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，液狀石蠟1滴，加入PCR擴(kuò)增模板DNA 2μL，混勻后行PCR擴(kuò)增。循環(huán)體條件：94℃下預(yù)熱3 min，94℃下變性10 min，53℃退火20 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最72℃延伸5 min。產(chǎn)物分析：預(yù)先制備1.0%瓊脂糖凝膠，取4μL耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加2μL溴酚藍(lán)混勻，于100 V電壓下電泳50 min，經(jīng)凝膠成像儀記錄耐藥基因PCR凝膠電泳圖譜。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL表格對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用n(%)描述，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SA的標(biāo)本分布及構(gòu)成比

見(jiàn)表2。由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，本院2015-2019年分離出的1 048株SA菌株，標(biāo)本分布前3位分別是創(chuàng)面分泌物標(biāo)本、痰液標(biāo)本、血液標(biāo)本，分別占總標(biāo)本比例45.71%、29.10%、8.02%。

2.2 SA的科室分布及構(gòu)成比

見(jiàn)表3。1 048株SA菌株，科室分布前3位分別是骨科、ICU、燒傷整形科，分別占總科室分布比例19.75%、10.78%、9.73%。

表1 SA耐藥基因引物序列Table 1 Primer sequence of SA resistance gene

表2 2015-2019年分離出的1 048株SA標(biāo)本分布及構(gòu)成比Table 2 Sample distribution and constituent ratio of SA strains[n(%)]

2.3 SA的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表4。在被檢測(cè)的16種抗菌藥物中，萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素敏感率最高，整體敏感率為100%；其次為利奈唑胺、喹奴普汀/達(dá)福普汀、呋喃妥因，整體敏感率分別達(dá)99.74%、98.85%、98.20%；敏感率最差的為芐青霉素，整體敏感率僅6.89%；再者為紅霉素、氯林霉素、苯唑西林，整體敏感率分別為39.89%、50.19%、50.58%。統(tǒng)計(jì)分析顯示，四環(huán)素（χ2=52.715，P＜0.001）、左氧氟沙星（χ2=61.207，P＜0.001）、慶大霉素（χ2=92.266，P＜0.001）、氯林霉素（χ2=22.104，P＜0.001）、環(huán) 丙 沙 星（χ2=54.856，P＜0.001）、紅霉素（χ2=48.047，P＜0.001）、苯唑西林（χ2=26.136，P＜0.001）、莫西沙星（χ2=32.362，P＜0.001）各年度SA菌株敏感率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各年度敏感率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 2015-2019年分離出的1 048株SA科室分布及構(gòu)成比Table 3 Department distribution and constituent ratio of SA strains[n(%)]

表4 2015-2019年分離出的1 048株SA藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Drug sensitivity of SA strains[n(%)]

2.4 SA的耐藥基因分布

見(jiàn)表5。共1 042株SA接受耐藥基因檢測(cè)，耐藥基因mecA、er mA、ermB、ermC、aac（6′）/a ph（2″）、qa?cA整體檢出率分別為16.51%（172/1 042）、9.98%（104/1 042）、18.81%（196/1 042）、8.45%（88/1 042）、10.46%（109/1 042）、14.88%（155/1 042）；根據(jù)是否對(duì)苯唑西林敏感，分為苯唑西林敏感金黃色葡萄球菌（OSSA）組（n=527）與耐苯唑西林金黃色葡萄球菌（ORSA）組（n=515），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，OSSA組mecA、ermA、aac（6′）/a ph（2″）、qac A檢出率均顯著低于ORSA組（χ2=191.864，73.946，72.746，106.455，P＜0.001），ermB檢出率均顯著高于ORSA組（χ2=164.418，P＜0.001），兩組ermC檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.788，P=0.095）。

表5 2015-2019年分離出的1 042株SA耐藥基因分布Table 5 Distribution of drug resistance genes in SA strains[n(%)]

3 討論

感染性疾病是全球引起人類(lèi)死亡的重要原因，其中SA是當(dāng)前院內(nèi)感染革蘭陽(yáng)性菌中居首的病原菌，其強(qiáng)致病性特點(diǎn)使得其從醫(yī)院感染擴(kuò)散到社區(qū)獲得性感染，最終造成多種類(lèi)型嚴(yán)重感染，威脅公共衛(wèi)生，其感染防控顯得尤為重要[4?5]。

本研究從本院2015-2019年分離出的1 048株SA菌株中，主要來(lái)自患者創(chuàng)面分泌物、痰液、血液，占總標(biāo)本比例分別為45.71%、29.10%、8.02%，這與SA普遍存在于人體皮膚、鼻咽部，容易侵襲創(chuàng)面、皮膚軟組織及呼吸道有關(guān)。樊芙蓉等[6]報(bào)道的632株SA，也主要來(lái)源于分泌物（49.4%）、痰液（39.4%）及血液（3.8%），與本研究類(lèi)似。從臨床科室分布顯示，本院SA菌株多見(jiàn)于骨科、ICU、燒傷整形科，可能因?yàn)檫@些科室均為本院重點(diǎn)科室，患者基數(shù)大，且科室收治的患者疾病類(lèi)型也與感染有關(guān)，如骨科以開(kāi)放性骨折、手外傷、關(guān)節(jié)感染、肢體外傷等患者多見(jiàn)，容易合并創(chuàng)面感染；燒傷整形科患者則因皮膚受損、手術(shù)削痂植皮等，術(shù)前、術(shù)后創(chuàng)面感染風(fēng)險(xiǎn)均較大，故創(chuàng)面分泌物中容易檢出SA；而ICU機(jī)械通氣、深靜脈置管等侵入性操作患者多，加之患者普遍病情危重、免疫力低下，因此肺部感染、血行感染十分常見(jiàn)，故患者痰液、血液中相對(duì)易檢出SA。既往也有研究認(rèn)為皮膚科、呼吸內(nèi)科、兒科等是SA感染主要分布科室[7]，與本研究報(bào)道不同，這可能與各醫(yī)院專(zhuān)科特色等不同有關(guān)。

細(xì)菌耐藥性直接關(guān)乎臨床抗感染治療成敗，SA作為常見(jiàn)致病菌，在臨床抗感染進(jìn)程中容易顯現(xiàn)耐藥性。自20世紀(jì)40年代青霉素問(wèn)世，SA所致感染性疾病得到了一定控制，但部分SA可產(chǎn)生青霉素酶，水解β?內(nèi)酰胺環(huán)，對(duì)青霉素展現(xiàn)出耐藥性，而這一特征隨著青霉素廣泛應(yīng)用日益突出，到目前能通過(guò)青霉素控制SA感染者已極少[8]。本研究對(duì)累計(jì)784株SA進(jìn)行芐青霉素藥敏檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)整體敏感率僅6.89%，這與盧錦沛等[9]報(bào)道的SA對(duì)青霉素耐藥率達(dá)94.12%結(jié)果類(lèi)似。紅霉素、氯林霉素、苯唑西林是耐青霉素SA成本較低的備用抗菌藥物，本研究結(jié)果顯示，SA對(duì)上述3種藥物敏感率分別為39.89%、50.19%、50.58%，敏感性也較差，這提示臨床選用這些藥物時(shí)需依賴藥敏試驗(yàn)結(jié)果。本研究顯示，在被檢測(cè)抗菌藥物中，萬(wàn)古霉素、替加環(huán)素敏感率最高，均為100%；利奈唑胺、喹奴普汀/達(dá)福普汀、呋喃妥因次之，整體敏感率分別達(dá)99.74%、98.85%、98.20%，但這些藥物雖抗SA作用強(qiáng)，但往往成本較高，且濫用會(huì)增強(qiáng)SA耐藥性變遷風(fēng)險(xiǎn)，因此不提倡優(yōu)先應(yīng)用[10]。另外，本研究中SA對(duì)四環(huán)素、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、莫西沙星、慶大霉素等抗菌藥物敏感性70%～90%之間，提示可作為SA的經(jīng)驗(yàn)治療。此外，統(tǒng)計(jì)分析顯示，不少藥物各年度敏感率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分藥物如四環(huán)素、左氧氟沙星、慶大霉素、氯林霉素等各年度敏感率雖表現(xiàn)出了一定波動(dòng)，但并無(wú)敏感率明顯下降趨勢(shì)，說(shuō)明本院SA并無(wú)明顯耐藥性變遷。

SA存在多種耐藥機(jī)制，其中菌株染色體上有mec A基因時(shí)，可編碼青霉素結(jié)合蛋白PBP2a合成，使用β?內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素時(shí)，該結(jié)合蛋白無(wú)法被抑制，可正常發(fā)揮作用，使得SA得以存活，這是SA對(duì)耐藥性對(duì)β?內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的主要原因[11]。er m基因是SA對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)/林可霉胺類(lèi)/鏈陽(yáng)菌素B（MLSB）類(lèi)抗生素耐藥的重要原因，與erm基因編碼紅霉素核糖體甲基化酶產(chǎn)生，使得抗生素與SA核糖體結(jié)合下降有關(guān)，主要有er mA、ermB、er mC 3種基因，其中ermA主要分布在ORSA中，而OSSA主要攜帶er mB基因[12]。aac（6′）/a ph（2″）是SA對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥的重要原因，耐藥機(jī)制與基因編碼氨基糖苷類(lèi)藥物修飾酶有關(guān)[13]。本研究顯示，耐藥基因mec A、ermA、ermB、ermC、aac（6′）/a ph（2″）、整體檢出率分別為16.51%、9.98%、18.81%、8.45%、10.46%，此結(jié)果有助于臨床強(qiáng)化SA耐藥性檢測(cè)并指導(dǎo)相關(guān)抗菌藥應(yīng)用，其中OSSA組耐藥基因mecA、ermA、aac（6′）/a ph（2″）檢出率均顯著低于ORSA組，ermB檢出率均高于ORSA組，與既往報(bào)道[14]一致。同抗生素類(lèi)似，消毒劑不規(guī)范、大量應(yīng)用也可導(dǎo)致SA產(chǎn)生選擇性壓力，表現(xiàn)出消毒劑抗性，其中qacA耐藥基因是SA發(fā)生消毒劑耐藥的主要原因，SA獲得qacA基因后對(duì)胺類(lèi)如苯扎溴銨、胍類(lèi)如乙酸氯已定等消毒劑出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致臨床消毒滅菌無(wú)效，增加SA感染風(fēng)險(xiǎn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)qac A耐藥基因檢出率為14.88%，且ORSA組更高，這一結(jié)果可為臨床SA感染患者消毒劑選擇提供參考。

綜上所述，創(chuàng)面分泌物、痰液及血液標(biāo)本中SA分離率高，可結(jié)合患者情況作為SA檢測(cè)優(yōu)先選擇標(biāo)本，同時(shí)加強(qiáng)藥敏試驗(yàn)、聯(lián)合耐藥基因檢測(cè)，有助于強(qiáng)化臨床耐藥性監(jiān)測(cè)及抗生素應(yīng)用指導(dǎo)。