SIRT1、P16和Ki67與HPV感染交互作用在宮頸病變中的應(yīng)用分析

王興民,龐朗,劉斌,呂健勇,傅錦堅(jiān)

（柳州市婦幼保健院1.病理科；2.預(yù)防保健科，廣西柳州545001）

宮頸癌是全球范圍內(nèi)女性人群中排行第4位的常見(jiàn)惡性腫瘤,人乳頭瘤病毒(HPV)的感染是常見(jiàn)的致病因素之一[1]。某些HPV類型,尤其是高危HPV(HR?HPV)16和18,可能導(dǎo)致子宮頸的持續(xù)感染,引起不可逆的變化,導(dǎo)致原位癌,最終向浸潤(rùn)性子宮頸癌發(fā)展[2]。目前篩查宮頸癌的主要手段是宮頸細(xì)胞學(xué)和HPV檢測(cè)相結(jié)合的方法,但由于兩種檢測(cè)手段的特異性不高,且因?yàn)榧?xì)胞學(xué)檢查的敏感性相對(duì)較低,許多HPV陽(yáng)性者需要重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)隨訪。因此,臨床上需要更有效的標(biāo)記物以對(duì)細(xì)胞學(xué)正常但HPV DNA檢測(cè)陽(yáng)性者進(jìn)行進(jìn)一步的篩選,以期早期鑒定出有宮頸病變的婦女。已有研究顯示,沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是NAD+依賴的蛋白去乙?；?屬于Sirtuin家族,其SIRT1與子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌和子宮頸癌等女性生殖器官腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3?6]。而P16/Ki?67雙染色細(xì)胞學(xué)正在成為一種替代的生物標(biāo)志物,顯示出總體的高度敏感性和特異性,可用于鑒定高級(jí)的宮頸病變[7]。因此本研究通過(guò)檢測(cè)HPV DNA、SIRT1、P16和Ki67,以闡明上述因子在宮頸病變進(jìn)展中的檢出陽(yáng)性率和病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年1月-2018年12月在我院經(jīng)手術(shù)治療或?qū)m頸活檢的116名患者作為研究對(duì)象。研究對(duì)象入組前,由臨床醫(yī)師詢問(wèn)研究對(duì)象并填寫《知情同意書》方可入組。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)20140013。

1.2 病理診斷與分組

病理醫(yī)師對(duì)臨床醫(yī)師送檢的宮頸組織進(jìn)行診斷,并結(jié)合免疫組化P16、Ki?67檢測(cè)情況分組將研究對(duì)象分為5組:炎癥組、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(LSIL)、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(HSIL)和宮頸鱗癌組。宮頸上皮病變細(xì)胞學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照文獻(xiàn)提及的方法進(jìn)行[8],宮頸病變組織學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)按(2014年女性生殖器官腫瘤WHO分類)列明的要求進(jìn)行[9]。排除有合并其他癌癥病變者、心腎功能不全者和進(jìn)行放化療手術(shù)者。經(jīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)后,共納入宮頸炎患者20人、LSIL32人、HSIL44人和宮頸鱗癌20人。

1.3 HPV DNA檢測(cè)方法

根據(jù)我院遺傳優(yōu)生科報(bào)道的檢測(cè)方法[10],對(duì)116名研究對(duì)象的宮頸細(xì)胞樣本進(jìn)行HPV DNA檢測(cè),陽(yáng)性者統(tǒng)一標(biāo)注為陽(yáng)性。

1.4 免疫組化檢測(cè)SIRT1、P16和Ki67

免疫組化染色使用羅氏免疫組化儀(Benmark XT);SIRT1的檢測(cè)方法參照本室報(bào)道[11]的方法進(jìn)行,抗體購(gòu)自ABcam公司的SIRT1羊抗人抗體;P16和Ki?67的免疫組化檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)提及的方法[8]進(jìn)行,試劑分別購(gòu)自福建邁新生物公司和羅氏生物公司。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM23.0軟件、SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)/確切概率法分析4種因子的表達(dá)情況,logistic回歸模型分析腫瘤蛋白標(biāo)志物與HPV感染交互作用在宮頸病變發(fā)展中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的基本特征

納入的116名研究對(duì)象年齡21～68歲,平均年齡(38.5±5.1)歲。宮頸炎組、LSIL組、HSIL組和宮頸鱗癌組研究對(duì)象的年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 不同程度宮頸病變患者HPV檢出率和SIRT1、P16和Ki67表達(dá)陽(yáng)性率

SIRT1在宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽(yáng)性率分別為40.0%、68.8%、68.2%和100.0%;P16在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽(yáng)性率分別為0.0%、43.8%、95.5%和100.0%;Ki67在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的陽(yáng)性指數(shù)分別為0.0%、87.5%、100.0%和100.0%。HPV的檢出率在宮頸炎癥、LSIL、HSIL和宮頸癌患者組織的檢出率分別為10.0%、68.8%、50.0%和70.0%。結(jié)果提示隨著疾病的發(fā)生進(jìn)展,HPV陽(yáng)性檢出率、SIRT1、P16和Ki67腫瘤蛋白標(biāo)志物的陽(yáng)性率逐漸增高(所有P值均＜0.01),見(jiàn)表1。

2.3 病毒?腫瘤蛋白交互作用在宮頸上皮內(nèi)瘤變惡化過(guò)程中的作用

Logistic回歸模型顯示HPV分別與SIRT1和Ki67存在病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用，導(dǎo)致LSIL向HSIL發(fā)展過(guò)程中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加（P值分別為0.007、0.007）。SIRT1、P16和Ki67之間的交互作用也在宮頸上皮內(nèi)瘤變惡化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用（P值分別為0.001、＜0.001和＜0.001），見(jiàn)表2。

2.4 病毒?腫瘤蛋白交互作用在HSIL向?qū)m頸癌惡化過(guò)程中的作用

Logistic回歸模型分析HPV與SIRT1、P16和Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達(dá)交互作用，以及蛋白?蛋白交互作用，結(jié)果顯示SIRT1?HPV和HPV?Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用是HSIL向子宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素（P值均為0.045），見(jiàn)表3。

表1 宮頸病變患者HPV檢出率和SIRT1、P16和Ki67表達(dá)陽(yáng)性率Table 1 Positive rate of HPV and expression of SIRT1,P16 and Ki67in women with cervical lesions[n(%)]

表2 宮頸上皮內(nèi)瘤變惡化過(guò)程中病毒?腫瘤蛋白交互作用Table 2 Interactions of virus?tumor protein expression in the progression of cervical intraepithelial neoplasia

表3 HSIL向?qū)m頸癌惡化過(guò)程中病毒?腫瘤蛋白交互作用Table 3 Interactions of virus?tumor protein expression in the progression of HSIL to cervical cancer

3 討論

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科生殖道惡性腫瘤，從宮頸病變到宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合的結(jié)果，其中研究較多的是HPV感染。HPV感染是宮頸癌及其癌前病變的主要原因之一，因而目前已有大量的研究將檢測(cè)HPV DNA作為宮頸癌的篩查工具之一［12］。本研究結(jié)果顯示，HPV DNA的陽(yáng)性檢出率從慢性宮頸炎的10%上升到宮頸癌的70%，隨著宮頸病變的程度增加，HPV陽(yáng)性檢出率增加，表明HPV的感染與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，在宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）II～I(xiàn)II和宮頸癌患者中，HPV感染率可達(dá)到92.9%和96.5%［13］，這證實(shí)了HPV感染的嚴(yán)重程度與宮頸病變程度高度相關(guān)。

但也有研究報(bào)道，有些患者HPV感染僅為一過(guò)性的，有些HPV感染卻呈進(jìn)展性惡化，研究者發(fā)現(xiàn)從宮頸炎癥到低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變?cè)龠M(jìn)展至高級(jí)別上皮內(nèi)瘤病變甚至是宮頸癌變過(guò)程中，HPV的持續(xù)感染亦發(fā)生了一些轉(zhuǎn)變，包括了將病毒附加體整合到宿主細(xì)胞基因組中，以及兩種病毒癌蛋白HPV E6和HPV E7的表達(dá)增強(qiáng)［14］。此外，一些能夠調(diào)控HPV病毒癌蛋白表達(dá)的基因，也被證明在宮頸病變的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，其中研究較多的是SIRT1。

SIRT1是HPV16 DNA復(fù)制復(fù)合體的一部分，并由HPV病毒蛋白E1和E2帶入病毒基因組［15］。另HPV E7選擇性誘導(dǎo)SIRT1蛋白水平升高，在通過(guò)整合的HPV病毒基因組自然表達(dá)HPV E7的SiHa細(xì)胞中，沉默E7可導(dǎo)致SIRT1蛋白減少［16］。上述研究情況顯示HPV E7可正調(diào)控SIRT1蛋白水平；亦即HPV病毒和SIRT1之間存在交互作用。本研究結(jié)果亦表明，隨著宮頸病變發(fā)生發(fā)展，除了HPV DNA陽(yáng)性檢出率增加外，SIRT1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率和陽(yáng)性水平均增加，且SIRT1?HPV的交互作用不僅僅存在于從LSIL到HSIL惡化進(jìn)程，也存在于HSIL轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌的進(jìn)程中，提示SIRT1與HPV病毒在宮頸病變發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

P16是一種腫瘤抑制因子，可抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6，從而阻止正常細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S期。當(dāng)宮頸細(xì)胞通過(guò)HR HPV感染轉(zhuǎn)化時(shí)，HPV病毒致癌蛋白E6和E7失調(diào)，可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）蛋白的功能失活［17］。Rb蛋白失活后，轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放，導(dǎo)致P16在宮頸細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)［17］。因此P16的過(guò)度表達(dá)可以提示癌前宮頸病變和宮頸癌。一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，宮頸病變程度由輕度向重度發(fā)展時(shí)，P16陽(yáng)性表達(dá)率在CINI、CINII和CINIII中可分別達(dá)到38%、68%和82%［18］。上述的機(jī)制也許可以解釋宮頸細(xì)胞從LSIL到HSIL過(guò)程中P16和HPV之間存在交互作用，可導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變惡化。與本研究結(jié)果相似，HPV16和/或18型DNA負(fù)荷與P16/Ki?67染色的結(jié)合提高了CINI和CINII病變檢測(cè)的敏感性［19］，表明聯(lián)合HPV DNA與P16免疫組化檢測(cè)，可提高宮頸病變惡化程度檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

Ki67細(xì)胞增殖抗原已在某些研究中提及，由于Ki67在增生性病變中的表達(dá)增加，因此被研究者推薦作為評(píng)估腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物之一［20］。該研究提示，在HPV DNA陽(yáng)性的宮頸上皮內(nèi)瘤變中，Ki67的免疫陽(yáng)性反應(yīng)代表了病變細(xì)胞的增殖活性。這種抗原在識(shí)別CIN鄰近的病變時(shí)具有實(shí)用性，因?yàn)椴±砉ぷ髡呖筛鶕?jù)Ki67的表達(dá)程度，將宮頸上皮內(nèi)瘤變與良性病變（例如萎縮性鱗狀上皮、未成熟的鱗狀化生或過(guò)渡上皮）中的低表達(dá)區(qū)分開(kāi)來(lái)。上述研究結(jié)果提示了Ki67的表達(dá)程度與HPV DNA陽(yáng)性檢出率具有相關(guān)性，且隨著疾病病變程度增加而增加。在本項(xiàng)研究中，隨著疾病的發(fā)生進(jìn)展，Ki67的陽(yáng)性指數(shù)逐漸增高，且Ki67表達(dá)水平隨著宮頸病變程度加重而相應(yīng)增加，這與已有研究結(jié)果相似，該研究結(jié)果表明，在組織病理學(xué)診斷中，發(fā)現(xiàn)Ki67表達(dá)陽(yáng)性率與HSIL的相關(guān)性更高，達(dá)到80%［20］。

基于上述的HPV檢測(cè)與Ki67和P16免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)合，本研究發(fā)現(xiàn)HPV分別與SIRT1和Ki67存在病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用的患者可被確定為HSIL發(fā)病的高危病例，此外宮頸樣本中檢出SIRT1?HPV和HPV?Ki67的病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用是宮頸癌發(fā)病的高危因素。上述情況顯示HPV DNA陽(yáng)性、P16、Ki67表達(dá)、以及病毒?腫瘤蛋白表達(dá)的交互作用與宮頸病變的嚴(yán)重程度有關(guān)，臨床工作者可通過(guò)宮頸病變的組織病理學(xué)診斷和宮頸樣本的HPV檢測(cè)結(jié)果，用于預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行早期干預(yù)或確定隨訪策略的有用生物標(biāo)志物。