別旁茶總苷抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接研究

王曉玉，張飛宇，劉莉，何新月，王鳳云

（1.廣東藥科大學(xué)健康學(xué)院，廣東廣州510310；2.廣東省光與健康工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510310；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性易發(fā)的非特異性炎性腸道疾病[1?2]，其發(fā)病率近5年來急劇上升，醫(yī)療費(fèi)用高，且會(huì)增加結(jié)直腸癌死亡的風(fēng)險(xiǎn)，已成為一種全球性疾病[3?5]。水楊酸抑制劑、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等為UC治療的常規(guī)藥物，在一定程度上可緩解及改善UC的癥狀，但服藥周期長、療效欠佳，藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重，且停藥后易復(fù)發(fā)，在臨床應(yīng)用上有一定局限[6-7]。而傳統(tǒng)民族藥在治療慢性病上發(fā)揮重要作用，且相對(duì)西藥副作用小[8?11]，比較適合新藥研究開發(fā)。

別旁茶（瑤藥名），也稱扭肚藤、斷骨草、豬肚勒花等，為木犀科素馨屬植物扭肚藤Jas minum elon gatum(Bergius)Wiid.的干燥嫩莖及葉，是民族醫(yī)藥瑤醫(yī)瑤藥中常用的藥物[12]。其性微苦、涼，功效清熱解毒、利濕消滯，用于治療急性胃腸炎、消化不良、痢疾等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其復(fù)方制劑復(fù)方扭肚藤膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性腹瀉的治療有良好效果[13]。別旁茶更是作為中成藥腹可安的主藥，在臨床中廣泛應(yīng)用于腹痛、腹瀉、嘔吐等消化系統(tǒng)疾病的治療，并且對(duì)腸易激綜合征患者有較好的治療作用[14]。因?yàn)槠浜袞|莨菪素成分可鎮(zhèn)靜消炎[15]，提取物還可以顯著改善結(jié)腸組織學(xué)損傷，抑制炎癥[16]。前期研究使用超高效液相色譜?飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC/Q?TOF?MS法）鑒定別旁茶29種化合物中26種均為苷類[17]。本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方法系統(tǒng)研究BPC治療UC的活性成分及其作用靶點(diǎn)，為民族藥別旁茶的深度開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 別旁茶苷活性成分的獲取與收集

運(yùn)用Pubchem數(shù)據(jù)庫（pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov）篩選11種環(huán)烯醚萜苷類化合物[17]并結(jié)合使用Swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstar?getprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，以P＞0.05進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)篩選。將最終獲得化合物的蛋白靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中的ID map?ping進(jìn)行官方名稱校正。

1.2 疾病靶點(diǎn)與有效化合物靶點(diǎn)的篩選與收集

通過Genecard數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://disgenet.org/)搜集UC相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將疾病靶點(diǎn)與化合物靶點(diǎn)取其兩者共同交集，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“成分—靶點(diǎn)—疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.3 疾病與藥物的差異基因分析

將獲得的共同靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫（https://string?db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，之后導(dǎo)入Cyto?scape 3.6.0，利用Cytoscape插件CytoHubba尋找排名前10的差異表達(dá)基因。

1.4 Go分析與KEGG通路富集分析

運(yùn)用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）將“1.3”項(xiàng)下獲得的關(guān)鍵共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。其中以參數(shù)P＜0.05，設(shè)定為HOMO species篩選出count值前10個(gè)來分析生物過程（biological process,BP）、分子功能（molecular?function,MF）、細(xì)胞組成（cellular component,CC）的GO富集功能和KEGG信號(hào)通路。最后用易漢博生物在線網(wǎng)站做氣泡圖進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。

1.5 核心有效成分與靶點(diǎn)的對(duì)接

使用AutoDock分子軟件將差異表達(dá)排名前4位的靶點(diǎn)與6種別旁茶苷核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接分析，結(jié)合能越低說明結(jié)合程度越緊密。

2 細(xì)胞體外試驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 材料與細(xì)胞株

別旁茶苷（Jasminoside，HPLC≥96%，成都Alfa Biotechnology Company Limited）;Caco?2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)；1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Life Science公司，批號(hào)：AC11225278)；FBS（Gibico公司，批號(hào)：42F2362K）；雙抗（Gibico公司，批號(hào)：1881459）；胰酶（TRYPSIN）(VWR amreso Life Science，批 號(hào)：0106C059)；MTT(Sigma公司，批號(hào)：MKCB8895)；Rabbit anti?NF?κBp65(Cell signaling technology公司，批號(hào)：9);β?actin Mouse mAb(博 士 德 公 司，批 號(hào)：BM0627)；TransAMNF?κBp65試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：220680351）。

2.2 方法

2.2.1 Caco?2細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清的1640培養(yǎng)液，將Caco?2細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下進(jìn)行培養(yǎng)，3～4 d可基本融合。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化、計(jì)數(shù)。

2.2.2 炎癥細(xì)胞模型的篩選

2.2.2.1 IL?1β誘導(dǎo)模型的篩選 將Caco?2細(xì)胞培養(yǎng)24 h，分為正常對(duì)照組、模型組，加入10 ng/mL IL?1β分別刺激0.5、1、3、12 h后，收集細(xì)胞。采用Trans AMNF?κBp65試劑盒檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞核蛋白NF?kBp65的含量，確定IL?1β最佳刺激時(shí)間點(diǎn)。

2.2.2.2統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad prism 8.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析(One?WayANOVA)檢驗(yàn)比較各組間顯著性差異，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測(cè)別旁茶總苷對(duì)Caco?2細(xì)胞活性的影響 取細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%的Caco?2細(xì)胞，按5×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔180μL，隨后置于恒溫培養(yǎng)箱中，待4 h后，細(xì)胞貼壁，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組：Control組，別旁茶苷濃度梯度組（6.25、12.5、25、50、100、200 mol/L）每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，Control組每孔加入20μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，別旁茶苷梯度組每孔加入20μL相應(yīng)濃度10倍的別旁茶苷溶液。孵育20 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT儲(chǔ)備液10μL，繼續(xù)孵育4 h，孵育結(jié)束后，取注射器小心吸棄上清，再加入150μL二甲基亞砜，于震板儀上充分溶解甲臜結(jié)晶10 min后，在波長分別為490、630 nm處檢測(cè)其吸光值，并計(jì)算。

2.2.4 Western blot檢測(cè)別旁茶苷對(duì)Caco?2細(xì)胞NF?κB p65蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長期的Caco?2細(xì)胞，按1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，鋪板均勻后，置于恒溫培養(yǎng)箱。貼壁過夜，對(duì)細(xì)胞分為3組：Normal組、模型組、別旁茶苷梯度組。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1次后，Normal組、模型組加入完全培養(yǎng)基，別旁茶苷梯度組進(jìn)行別旁茶苷處理24 h。24 h后，加入IL?1β刺激0.5 h，棄去培養(yǎng)基，1 mL PBS清洗2次，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞至離心管中，在1 260 r/min、4℃條件下，離心5 min，棄去上清液，按蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞核蛋白并檢測(cè)蛋白濃度，按4∶1加入5×Loading Buffer，在95℃以上水浴加熱5 min，得Western Blot實(shí)驗(yàn)樣品。Western Blot具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[30]進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用Pubchem數(shù)據(jù)庫并結(jié)合Swiss target predic?tion數(shù)據(jù)庫篩選出8種活性化合物，基本信息見表1。分別預(yù)測(cè)所有單體活性成分，共得到靶點(diǎn)139個(gè)，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，將別旁茶苷8種有效成分和139個(gè)有效靶點(diǎn)建立可視網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，見圖1。

表1 別旁茶苷有效活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of the effective active compounds in BPC

3.2 別旁茶苷抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

通過GeneCard、DisGeNET與TTD數(shù)據(jù)庫搜集靶點(diǎn)，去重后獲得UC靶點(diǎn)，運(yùn)用score中位數(shù)篩選出靶點(diǎn)，易漢博生物信息網(wǎng)站在線做Venn圖，取疾病靶點(diǎn)與化合物靶點(diǎn)二者的共同交集，詳細(xì)信息見圖2。獲得共同關(guān)鍵靶點(diǎn)有139個(gè)，將獲得共同靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，之后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0進(jìn)行可視化分析。運(yùn)用Cytoscape插件CytoHubba找到差異表達(dá)基因，顏色越深越重要，如圖3所示。其中排名前4的分別是CASP3、EGFR、SRC、MMP9。

3.3 藥物?靶點(diǎn)?疾病共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將TNF?α、NMUR2、ADRA2A、ACHE、AKR1B1、CA7、CA12、CA4、CA2、NOX4、RPS6KA3等靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-共同靶點(diǎn)-潰瘍性結(jié)腸炎”PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，可判斷出三者的相互作用關(guān)系。

圖1 別旁茶苷活性成分靶點(diǎn)圖Figure 1 Target map of the effective active compounds in BPC

圖2 別旁茶苷與潰瘍性結(jié)腸炎的韋恩圖Figure 2 Venn diagram of BPC and ulcerative colitis

圖3 別旁茶苷治療潰瘍性結(jié)腸炎排名前10靶點(diǎn)Figure 3 Top 10 targets for BPC treatment of ulcerative colitis

圖4 化學(xué)成分-共同靶點(diǎn)-潰瘍性結(jié)腸炎的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 PPI network diagram of Chemical composition?common target?ulcerative colitis

3.4 別旁茶苷抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的核心通路篩選

將“1.3”項(xiàng)下獲得的關(guān)鍵共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。獲得生物過程（biological process，BP）217個(gè)，主要涉及信號(hào)傳導(dǎo)、負(fù)調(diào)節(jié)凋亡過程、氧化還原過程等。分子功能（molecularfunction,MF）獲得78個(gè)，主要涉及蛋白結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白激酶活性等。細(xì)胞組成(cellular component，CC)獲得37個(gè)，質(zhì)膜、胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、膜的整體組成部分、細(xì)胞外來體、核漿、細(xì)胞外空間、原生質(zhì)膜的組成成分、細(xì)胞外區(qū)域等。通過易漢博生物在線作圖，以count值前10與P值≤0.05進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果見圖5。KEGG信號(hào)通路有119個(gè)，主要與NF?kappa B信號(hào)通路、癌癥通路、蛋白多糖、PI3K?Akt信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體?受體相互作用、鞘脂信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路等有關(guān)。以count值前10與P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選結(jié)果見圖6。

3.5 核心活性與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

找到重要6種活性化合物（山柰酚?3?O?蕓香糖苷、橄欖苦苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B），將BPC治療UC差異表達(dá)排名前4的基因（CASP3、EGFR、SRC、MMP9）進(jìn)行分子對(duì)接，其中靶點(diǎn)基因與蛋白間活性的結(jié)合能等信息見圖7。結(jié)合能越低，說明活性成分與靶點(diǎn)受體結(jié)合越緊密，顯示苜蓿素與前4靶點(diǎn)結(jié)合方式較為相似，且結(jié)合能優(yōu)于陽性藥物美沙拉嗪，均落于靶點(diǎn)受體的活性中心內(nèi)，見圖8。

圖5 別旁茶的活性成分靶點(diǎn)的GO富集分析圖Figure 5 GO enrichment analysis diagram of active ingredient target in BPC

圖6 別旁茶抗UC作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析圖Figure 6 KEGG enrichment analysis diagram of BPC anti?UC target

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)與別旁茶苷成分的結(jié)合能熱圖Figure 7 Heat map of the binding energy of key targets and BPC components

圖8 關(guān)鍵靶點(diǎn)與苜蓿素的分子對(duì)接（與陽性藥比較）Figure 8 Molecular docking between key targets and alfalfa(compared with positive drugs)

3.6 細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.6.1 別旁茶苷實(shí)驗(yàn)濃度的確定

別旁茶苷實(shí)驗(yàn)濃度確定結(jié)果見圖9。與正常對(duì)照組比較，濃度為12.5、25、50μmol/L的別旁茶苷對(duì)細(xì)胞活性沒有影響(P＞0.05)，而別旁茶苷濃度為100、200μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活性抑制明顯(P＜0.05)，故將12.5、25、50μmol/L確定為別旁茶苷的實(shí)驗(yàn)濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖9 別旁茶苷實(shí)驗(yàn)濃度的考察Figure 9 Experimental concentration of BPC

3.6.2 IL?1β誘導(dǎo)的Caco?2細(xì)胞NF?κBp65蛋白的相對(duì)含量

IL?1β刺激細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)NF?κBp65蛋白含量均高于正常對(duì)照組，其中刺激0.5 h細(xì)胞NF?κBp65蛋白含量最高，故確定IL?1β最佳刺激時(shí)間點(diǎn)為0.5 h，見圖10。

圖10 IL?1β誘導(dǎo)的Caco?2細(xì)胞細(xì)胞NF?κBp65蛋白相對(duì)含量Figure 10 The relative content of NF?κBp65 protein in Caco?2 cells induced by IL?1β

3.6.3 別旁茶苷對(duì)IL?1β誘導(dǎo)的NF?κB信號(hào)通路活化的影響

該部分對(duì)IL?1β激活的經(jīng)典炎癥信號(hào)通路NF?κB通路進(jìn)行檢測(cè)。由“3.6.2”項(xiàng)下數(shù)據(jù)確定使用IL?1β刺激細(xì)胞0.5 h作為炎癥模型，別旁茶苷對(duì)IL?1β誘導(dǎo)的NF?κB信號(hào)通路活化的影響結(jié)果見圖11。與正常組比較，模型組IL?1β能明顯誘導(dǎo)NF?κB信號(hào)通路活化，增加通路核蛋白NF?κBp65的表達(dá)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與模型組比較，別旁茶苷可以明顯緩解細(xì)胞核NF?κBp65的表達(dá)，且具有劑量依賴性。

圖11 別旁茶苷對(duì)NF?κBp65蛋白表達(dá)的影響Figure 11 The effect of BPC on the expression of NF?κBp65 protein

4 討論

UC發(fā)病具有癥狀多樣性、非特異性、發(fā)病較為隱匿、病因不明確等特點(diǎn)，給臨床治療帶來很大的難度，如何做到個(gè)體化治療或未病先防，是目前有待解決的醫(yī)療難題。中醫(yī)可根據(jù)UC患者體質(zhì)的差異進(jìn)行辨證施治，同時(shí)還能做到未病先防，在治療UC方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[18?19]?，幩巹e旁茶的藥理研究主要集中在腸胃炎、濕熱痢疾、腸胃消化等幾個(gè)方面，臨床上可作為中成藥腹可安的主藥，其許多化合物都具有抗感染作用[20?21]。前期研究使用UPLC/Q?TOF?MS法鑒定出別旁茶含有29種化合物[17]，通過Swiss target predictiony分析（P≥0.05）篩選出山柰酚?3?O?蕓香糖苷、橄欖苦苷、jaspogeranoside A、素馨苦苷?O?β?D?葡萄糖苷、jasminoside、苜蓿素、jashemsloside A、jashemsloside B為主要核心活性化合物。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示TNF、PTGS1、MAPK14、CXCR1、LGALS3、IL?2等靶點(diǎn)與UC有關(guān)，其中TNF、PTGS1是促炎性細(xì)胞因子，CXCR1是IL?8的受體，IL?2是抑炎細(xì)胞因子[22?23]。提示別旁茶苷中化合物可能通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞靶點(diǎn)進(jìn)行抗UC。大量、難以控制的出血成為UC癥狀，而別旁茶苷可作用于KDR、CA2、MMP2等多個(gè)靶點(diǎn)以調(diào)節(jié)血管[24]。

氧化脂質(zhì)衍生物能激活NF?κB[6]，誘導(dǎo)單核細(xì)胞結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥形成。而別旁茶苷可能通過激活PXR、CYP3A抑制NF?κB的表達(dá)，從而促進(jìn)消化系統(tǒng)功能，調(diào)節(jié)脾胃，止血止瀉，降低炎癥因子TNF?α、IL?6、IL?1β和TGF?β1的水平，發(fā)揮保護(hù)作用[25?28]。本研究篩選出NF kappa B signaling pathway、Pathways in cancer、Proteoglycans in cancer等119條通路，其中NF?κB信號(hào)通路排名前列，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果得知，別旁茶總苷確能降低IL?1β誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞核蛋白NF?κBp65的含量，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，與本文網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的假設(shè)具有一致性。

分子對(duì)接結(jié)果分析顯示，CASP3、EGFR、SRC、MMP9是別旁茶苷的差異靶點(diǎn)蛋白，它們與6種核心活性化合物的結(jié)合較為緊密，其中苜蓿素結(jié)合能優(yōu)于陽性藥美沙拉秦，這進(jìn)一步提示別旁茶總苷通過NF?κB發(fā)揮UC治療作用的可行性。此外，別旁茶苷類成分在臨床應(yīng)用還需更多體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探討了別旁茶苷抗UC作用主要靶點(diǎn)和信號(hào)通路，結(jié)果表明別旁茶苷類成分苜蓿素具有潛在研究價(jià)值。另體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，別旁茶總苷確能降低NF?κBp65的表達(dá)，這為民族藥的實(shí)驗(yàn)研究及產(chǎn)品開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。