龍膽苦苷對非小細(xì)胞肺癌的炎癥因子水平及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

鐘春蕾,黃國濤,楊洋,申思,張志強(qiáng)

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科二病區(qū)，河南衛(wèi)輝453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科二病區(qū)，河南衛(wèi)輝453100）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一,也是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[1]。非小細(xì)胞肺癌(non?small cell lung cancer,NSCLC)幾乎占所有肺癌的80%[2]。由于轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,治療選擇有限[3]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因,并且是涉及入侵和遷移的復(fù)雜的多步驟過程[4?5]。在許多情況下,晚期NSCLC患者預(yù)后不良和治療失敗是造成從原發(fā)部位到遠(yuǎn)處器官的局部浸潤或轉(zhuǎn)移的原因[6]。盡管在過去的幾十年中早期診斷的改善和鉑類化學(xué)療法的發(fā)展,NSCLC患者的預(yù)后和存活率仍然不能令人滿意,因此,迫切需要制定預(yù)防轉(zhuǎn)移策略并尋找新的、安全有效的肺癌預(yù)防劑。長期以來,植物來源的天然產(chǎn)物一直被認(rèn)為是抗癌劑的來源,并且正在針對幾種類型的癌癥進(jìn)行評估。龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS)是龍膽草的活性成分之一,據(jù)報(bào)道具有多種藥理作用,包括抗炎[7]、保肝[8]和止痛[9]。最近,由于低毒的優(yōu)勢,GPS作為抗肝癌[10]和卵巢癌[11]的潛在抗癌劑受到越來越多的關(guān)注,但GPS對人類NSCLC是否具有抑制作用及其潛在機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS，美國Sigma);胎牛血清(FBS)、RPMI?1640培養(yǎng)基、胰酶(美國Invitrogen);TRIzol試劑(美國Thermo Fisher);CCK?8試劑盒、結(jié)晶紫、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL發(fā)光液(上海碧云天);白細(xì)胞介素(interleukin,IL)?6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和IL?1β ELISA試劑盒(武漢博士德);P65、p?P65、β?actin、E?cad、N?cad和Vimentin兔抗單克隆抗體、山羊抗兔IgG(Alexa Fluor?488)熒光二抗(美國CST公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆IgG抗體(英國Abcam);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore);tran?swell小室(美國康寧);基質(zhì)膠(美國BD);高速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司);CO2培養(yǎng)箱、Nanodrop 2000(美國Thermo Fisher公司);流式細(xì)胞儀(美國BD Bio?sciences);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),將細(xì)胞在含有10%(φ)胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素的RP?MI 1640中于37℃、含5%(φ)CO2濕潤條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性

將A549細(xì)胞(每孔104個(gè))接種到補(bǔ)充有10%FBS的100μL RPMI 1640中的96孔板中,并使其貼壁過夜。用不同濃度的GPS處理24 h后,將10μL CCK8溶液添加到平板的每個(gè)孔中。將板在37℃下孵育1 h,然后使用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度（A）。所有實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行,并重復(fù)至少3遍。

1.4 ELISA檢測細(xì)胞上清液IL?6、iNOS和IL?1β的含量

將細(xì)胞(3×105/孔)鋪在6孔板上培養(yǎng)過夜后,用0、5、10、20μmol/L濃度(分別用a、b、c、d表示)的GPS處理細(xì)胞24 h后,收集細(xì)胞并用超聲儀裂解以制備細(xì)胞懸液。以1 000 g離心10 min后,取上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測細(xì)胞上清液中IL?6、i NOS和IL?1β的水平。

1.5 免疫印跡檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞(3×105/孔)鋪在6孔板上培養(yǎng)過夜后,用0、5、10、20μmol/L濃度的GPS處理細(xì)胞48 h后,用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白。用Nanodrop 2000測量蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平后,用十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS?PAGE)分離蛋白質(zhì),然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。接下來,將膜用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。然后,將膜與稀釋的一抗P65(1∶1 000)、p?P65(1∶1 000)、β?actin(1∶2 000)、E?cad(1∶1 000)、N?cad(1∶1 000)和Vimentin(1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST洗滌3次,并與HRP偶聯(lián)的二抗37℃孵育1 h。使用ECL并用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.6 Transwell分析檢測細(xì)胞侵襲

上部Transwell室中預(yù)涂稀釋的基質(zhì)膠(BD),下部Transwell室添加0.5 mL含20%FBS的RPMI?1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞用RPMI?1640培養(yǎng)基以5×105細(xì)胞/mL的密度懸浮,基質(zhì)膠凝結(jié)后,然后將細(xì)胞懸液的等分試樣100μL接種到上部Transwell室。培養(yǎng)20 h后,將通過膜的細(xì)胞用甲醇和0.05%結(jié)晶紫染色。使用光學(xué)顯微鏡從5個(gè)隨機(jī)視野中確定侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 免疫熒光檢測Vimentin陽性細(xì)胞

將A549細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞密度接種在96孔板中,用0、5、10、20μmol/L濃度的GPS培養(yǎng)48 h后,用PBS洗滌,將細(xì)胞與兔抗Vimentin單克隆抗體(1∶100)4℃孵育30 min,PBS洗滌3次,加入山羊抗兔熒光二抗避光孵育15 min。熒光顯微鏡下觀察Vimentin陽性細(xì)胞(綠色熒光)并拍照統(tǒng)計(jì)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對NSCLC細(xì)胞活力的影響

如圖1所示,GPS對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的活力有抑制作用,隨著GPS濃度的升高,A549細(xì)胞存活率逐漸降低。選擇0、5、10、20μmol/L濃度的GPS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 龍膽苦苷對NSCLC細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

如圖2所示,與GPS 0μmol/L組相比,GPS10μmol/L和20μmol/L組A549細(xì)胞上清液中炎癥因子IL?6、iNOS和IL?1β水平顯著下降(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 龍膽苦苷對NSCLC細(xì)胞中NF?κBP65磷酸化的影響

圖1 GPS對NSCLC細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of GPS on the viability of non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

如圖3示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS 10μmol/L和20μmol/L組A549細(xì)胞中NF?κB P65磷酸化水平顯著降低(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 龍膽苦苷對NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響

如圖4示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS10μmol/L和20μmol/L組A549細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P＜0.05),GPS 5μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 龍膽苦苷對NSCLC細(xì)胞EMT的影響

如圖5所示,與GPS 0μmol/L組比較,GPS10 μmol/L和20μmol/L組A549細(xì)胞中N?cad和Vimen?tin的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05),E?cad蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);免疫熒光染色結(jié)果示GPS 10μmol/L和20μmol/L組Vimentin陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少,GPS 5μmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 GPS對NSCLC細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Figure 2 Effect of GPS on the secretion of inflammatory factors in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖3 GPS對NSCLC細(xì)胞中NF?κB P65磷酸化的影響Figure 3 Effect of GPS on NF?κB P65 phosphorylation in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖4 GPS對NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of GPS on the invasion ability of non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

圖5 GPS對NSCLC細(xì)胞EMT標(biāo)記物蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of GPS on the expression of EMT marker protein in non?small cell lung cancer cells(±s,n=5)

3 討論

肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥治療失敗和晚期NSCLC預(yù)后不良的主要因素,也是其高死亡率的原因[12?13]。因此,發(fā)現(xiàn)新的抗轉(zhuǎn)移劑對于肺癌的治療至關(guān)重要。最近,大量證據(jù)表明許多基于天然產(chǎn)物的藥物因其對多種疾病,特別是對腫瘤轉(zhuǎn)移的有益作用而受到了更多關(guān)注。GPS是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物,已顯示出抗癌作用[10?11,14]。CCK8實(shí)驗(yàn)表明,與對照比較,GPS10μmol/L及以上濃度時(shí),A549細(xì)胞的存活率顯著降低,所以GPS對A549細(xì)胞具有毒性作用。

研究發(fā)現(xiàn),炎癥微環(huán)境能通過多種細(xì)胞因子來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,參與腫瘤的轉(zhuǎn)移等[15?16]。IL?6是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial?to?mesenchymal transition,EMT)和NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞因子[17?18]。IL?6的增加可導(dǎo)致肺癌分子靶向治療的耐藥性[19],IL?6水平可能是NSCLC患者的預(yù)后指標(biāo)[20]。IL?1β在腫瘤微環(huán)境中起著雙向作用,微量IL?1β可促發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答而激活特異性免疫反應(yīng)而起免疫監(jiān)控效應(yīng),大量IL?1β可能導(dǎo)致炎性損傷[21]。本研究結(jié)果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明顯降低A549細(xì)胞中IL?6、IL?1β和iNOS的產(chǎn)生,減輕腫瘤微環(huán)境的炎癥浸潤。iNOS被認(rèn)為與NSCLC的發(fā)生明顯相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中iNOS的表達(dá)顯著增高,且與術(shù)后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[22]。NF?κB被認(rèn)為是免疫和炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì),且IL?6可能會增強(qiáng)NF?κB信號通路的激活[23]。本研究結(jié)果表明GPS(10μmol/L和20μmol/L)明顯降低NF?κB P65的磷酸化水平,抑制NF?κB通路的激活。

EMT被認(rèn)為是癌癥惡性、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中最關(guān)鍵的步驟之一[24]。為了進(jìn)一步檢測GPS的潛在抗轉(zhuǎn)移作用,對A549細(xì)胞進(jìn)行了侵襲實(shí)驗(yàn)和EMT蛋白表達(dá)的檢測。在EMT進(jìn)展過程中,癌細(xì)胞會獲得間質(zhì)特征,例如波形蛋白和N?鈣黏著蛋白的增加,并失去上皮特性,例如E?鈣黏著蛋白的減少[25]。本研究中,GPS(10μmol/L和20μmol/L)可明顯減少A549細(xì)胞的侵襲數(shù)目,并通過降低N?鈣粘蛋白和波形蛋白的表達(dá)來顯著抑制EMT進(jìn)展,同時(shí)增加E?鈣粘蛋白的蛋白表達(dá),這表明GPS抑制了A549細(xì)胞的EMT。

綜上所述,本研究結(jié)果表明GPS可以有效抑制A549細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,其主要機(jī)制可能是炎癥因子IL?6和NF?κB P65的磷酸化水平降低所致。因此,GPS可能會成為將來治療或預(yù)防肺癌的有效抗腫瘤藥物。