廣藿香對感染后腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感作用及機制研究

劉瑤，盧素宏，歐陽蒲月

（廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510520）

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種最常見的胃腸道功能紊亂性疾病，該病患病率高、病程長、易反復(fù)、治療困難、嚴重影響生活質(zhì)量，引起人們廣泛重視[1]。患者被腸道病毒、細菌或寄生蟲等感染，在病原體清除及黏膜炎癥逐漸消退后，出現(xiàn)IBS癥狀，稱之為感染后腸易激綜合征(post?infectious irritable bowel syndrome,PI?IBS)。PI?IBS發(fā)病機制復(fù)雜，內(nèi)臟高敏感是PI?IBS癥狀產(chǎn)生的核心機制[2]。本課題組前期研究結(jié)果表明，藿香正氣液、廣藿香油、廣藿香醇均能不同程度地修復(fù)PI?IBS大鼠腸黏膜機械屏障，調(diào)節(jié)腸道免疫異常和菌群失調(diào)，藿香正氣制劑可作為治療PI?IBS的理想藥物[3]。廣藿香Pogostemoncablin(Bl anco)Benth.是藿香正氣方中的君藥，在治療PI?IBS中起主要作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，廣藿香具有調(diào)節(jié)胃腸道功能和抑菌抗炎作用[4]。但廣藿香能否顯著改善PI?IBS內(nèi)臟高敏感性，廣藿香不同提取物（廣藿香水提液、廣藿香油）對PI?IBS大鼠腸道脊髓轉(zhuǎn)入神經(jīng)通路的影響是否有差異，均有待于進一步研究。因此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，深入研究廣藿香對PI?IBS大鼠內(nèi)臟高敏感的調(diào)控作用及其機制，為廣藿香合理應(yīng)用于PI?IBS臨床治療提供實驗數(shù)據(jù)支持，為中醫(yī)藥對PI?IBS的認識以及診療方案提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Sprague?Dawley大鼠，體質(zhì)量180～200 g，雄性，購自廣東省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013?0002。動物于20～24℃，濕度60%～70%，12 h明暗的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始實驗。

1.2 藥物與試劑

廣藿香藥材采自廣東省高要市。廣藿香揮發(fā)油制備：取廣藿香地上部分，晾干剪碎后，精密稱取碎葉置于蒸餾瓶中，加入適量蒸餾水，按《中國藥典》規(guī)定的揮發(fā)油測定法提得黃色油狀物，出油率為1.5%。廣藿香水提液的制備：收集廣藿香揮發(fā)油提取后的濾渣，濾渣用蒸餾水煎煮3次并過濾，棄去濾渣，合并濾液，為廣藿香水提液。馬來酸曲美布汀片（開開援生制藥股份有限公司，批號13032817）；CRF、CGRP、5?HT檢測試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司，貨號分別為：c12031、c12421、c12311）；BDNF一抗（英國Abcam公司，貨號：ab122424）；ECL檢測試劑盒（美國ThermoFisher公司，批號：32019）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，由廣州浩瑪生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器

5810R高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；POW?ER/PAC 1000電泳儀、POWER/PAC Universal電轉(zhuǎn)裝置、GS?800光密度掃描儀（美國BIO?RAD公司）；MP150型多導(dǎo)生理記錄分析系統(tǒng)（美國BIOPAC公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組、造模及給藥方法 40只大鼠隨機分為5組，即正常組、PI?IBS模型組、馬來酸曲美布汀片（TMT）組[0.1 g/(kg·d）]、廣藿香油組[3 g/(kg·d）]、廣藿香水提物組[6 g/(kg·d）]，每組8只。參考課題組前期文獻復(fù)制PI?IBS模型[5]。造模成功后第2天開始給藥，正常對照組和PI?IBS模型組給予生理鹽水灌胃，藥物組給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

1.4.2 大鼠結(jié)腸運動能力和內(nèi)臟敏感性測定 于建模前、給藥前及給藥后測定大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸運動。大鼠2 h內(nèi)排便的糞粒數(shù)：清早未刺激前2 h內(nèi)大鼠排便的糞粒數(shù)。大鼠結(jié)腸運動的描記：將橡膠小囊與直徑為2 mm的塑料導(dǎo)管連接，將塑料導(dǎo)管與三通管（一端接壓力換能器，另一端接1 mL的注射器）連接，注射器注入水，排凈氣泡，將壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，記錄30 min結(jié)腸運動的曲線。然后計算連續(xù)30 min的曲線下面積為大鼠的結(jié)腸運動指數(shù)(motility index，MI)。用藥前及用藥結(jié)束后進行內(nèi)臟敏感性評估，行直腸氣囊擴張（colon rectal distension，CRD），根據(jù)腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）評分標(biāo)準[6]確定疼痛壓力閾值。

1.4.3 ELISA檢測結(jié)腸中CRF、CGRP、5?HT含量 實驗結(jié)束后，麻醉后量取距肛門8 cm處取結(jié)腸組織2 cm。加3倍體積生理鹽水勻漿后，按照ELISA試劑盒的操作說明檢測CRF、CGRP、5?HT含量。

1.4.4 Western blot檢測大鼠海馬中BDNF表達 實驗結(jié)束，麻醉后取腦組織。按說明書提取蛋白并測定濃度。每孔上樣50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗溶液（BDNF 1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，10 min/次，3次，HRP標(biāo)記的二抗溶液（1∶15 000）室溫孵育2 h，上述方法洗膜后加入ECL液顯色曝光。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0 for windows統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，采用單因素方差分析及LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廣藿香提取物對大鼠結(jié)腸運動的影響

造模前，各組大鼠2 h內(nèi)排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸MI無差異。造模后，PI?IBS大鼠排出的糞粒數(shù)和結(jié)腸MI較正常組顯著增加(P＜0.01)。給藥后，廣藿香油組、廣藿香水提物組、TMT組大鼠2 h內(nèi)排出糞粒數(shù)和結(jié)腸MI較模型組均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)明顯多于TMT組，大鼠結(jié)腸運動指數(shù)也明顯高于TMT組。結(jié)果見表1、表2。

2.2 廣藿香提取物對大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

與正常組相比，用藥前各組大鼠直腸擴張時的疼痛閾值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，廣藿香油組、廣藿香水提液組、TMT組疼痛閾值明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表1 各組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)（個）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

表1 各組大鼠2 h內(nèi)糞粒數(shù)（個）Table 1 Number of fecal particles in each group within 2 h(±s，n=8)

與正常對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與TMT組比較：△P＜0.05。

組別正常對照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg?1）--0.1 3 6建模前4.7±1.16 4.6±1.27 4.5±0.97 4.8±0.79 4.6±0.85給藥前4.5±1.08 7.5±1.35**7.6±1.71**7.4±1.89**7.3±1.57**給藥后4.6±0.97 7.3±1.64**5.5±1.08##6.6±1.33#△6.7±1.32#△

表2 各組大鼠結(jié)腸運動指數(shù)Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

表2 各組大鼠結(jié)腸運動指數(shù)Table 2 Colonic motility index of rats in each group（mmHg·s-1，±s，n=8）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg?1）? ?0.1 36建模前1 073.4±95.12 1 039.15±91.27 1 090.29±105.97 1 090.51±112.79 1 082.7±108.85給藥前1 096.65±154.08 2 092.27±183.35**2 111.88±179.71**2 097.4±197.26**2 063.43±249.82**給藥后1 086.22±93.47 2 112.15±107.2**1 470.92±86.85##1 870.12±85.93#△1 880.64±93.5#△

2.3 廣藿香提取物對大鼠結(jié)腸組織中CRF、CGRP、5?HT的影響

表3 各組大鼠疼痛閾值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

表3 各組大鼠疼痛閾值（60 mmHg）Table 3 Pain threshold of rats in each group(±s，n=8）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

?

與正常組相比，PI?IBS大鼠結(jié)腸組織中CRF、CGRP和5?HT含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。給藥后，廣藿香油組、廣藿香水提物組、TMT組結(jié)腸中CRF、CGRP和5?HT含量較模型組顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。3個給藥組大鼠的結(jié)腸中CGRP含量仍明顯高于正常組（P＜0.01）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表4。

2.4 廣藿香提取物對大鼠腦組織中BDNF的影響

與正常組相比，模型組海馬中BDNF表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，廣藿香油組、廣藿香水提液組和TMT組，海馬組織中BDNF表達均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。廣藿香油組、廣藿香水提液組與TMT組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖1。

3 討論

內(nèi)臟高敏感性是指內(nèi)臟器官對來自外周的各類傷害性刺激和正常生理性刺激的感覺閾值降低、感受性加強的現(xiàn)象。現(xiàn)代研究表明，內(nèi)臟高敏感是PI?IBS癥狀產(chǎn)生的核心機制，腸道內(nèi)持續(xù)存在的低度炎癥是使外周神經(jīng)末梢致敏的重要原因。持續(xù)的炎癥不僅釋放各種炎性介質(zhì)包括前列腺素、緩激肽、神經(jīng)生長因子等，還通過刺激EC細胞增生釋放5?HT，影響胃腸道神經(jīng)和平滑肌的功能，引起胃腸動力異常和內(nèi)臟感覺過敏。

圖1 各組大鼠海馬BDNF的水平Figure 1 Levels of BDNF in hippocampus of rats in each group(±s，n=4)

5?HT作為一種具有多種生物功能廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的神經(jīng)遞質(zhì)，被發(fā)現(xiàn)積極參與了上述生理病理過程，并與PI?IBS患者腹痛、腹瀉及內(nèi)臟敏感等癥狀密切相關(guān)[7]。腸道內(nèi)5?HT的增加，會導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)高度敏感，激活多種神經(jīng)活性物質(zhì)，導(dǎo)致腦?腸軸內(nèi)信號異常；而5?HT還作用于相關(guān)受體，導(dǎo)致患者腸道的感知、運動和分泌改變，產(chǎn)生IBS的癥狀[8?9]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)是一種能夠介導(dǎo)下丘腦?垂體?腎上腺軸(HPA軸)產(chǎn)生各種應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)肽。應(yīng)激可以刺激下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞釋放CRF，CRF能夠激活肥大細胞，使其脫顆粒釋放5?HT，改變胃腸動力，提高內(nèi)臟敏感性。因此，CRF可能通過對5?HT表達的調(diào)控來影響PI?IBS的內(nèi)臟敏感性[10?12]。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織CRF、CGRP、5?HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5?HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

表4 各組大鼠結(jié)腸組織CRF、CGRP、5?HT的水平Table 4 Levels of CRF,CGRP and 5?HT in colon tissue of rats in each group（±s，n=8）

與正常對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照PI?IBS模型TMT廣藿香油廣藿香水提物劑量/（g·kg-1）--0.1 36 CRF/(ng·mg-1)3.85±0.28 4.89±0.68*3.09±0.26#3.17±0.19##3.15±0.34##5?HT/(ng·mg-1)3.22±0.18 4.78±0.36*3.53±0.45#2.85±0.43##2.89±0.51##CGRP/(ng·mg-1)2.51±0.16 4.54±0.25**3.95±0.27*#3.82±0.43*#3.85±0.47*#

TMT是一種胃腸運動節(jié)律調(diào)節(jié)劑，是IBS及其他一些胃腸運動障礙性疾病的常用治療藥物。其可作用于平滑肌細胞膜中的Ca2+、K+通道，對腸道運動產(chǎn)生抑制和興奮的雙重作用。此外，TMT對平滑肌神經(jīng)受體也有雙向調(diào)節(jié)作用[13]。本實驗選用TMT作為治療PI?IBS的對照藥物。結(jié)果顯示，TMT組給藥后各項指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組。結(jié)果提示，TMT亦能改善PI?IBS大鼠內(nèi)臟高敏感性。

本實驗大鼠結(jié)腸運動能力測定結(jié)果顯示，給藥后，TMT組、廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠2 h內(nèi)排出糞粒數(shù)和結(jié)腸MI均顯著降低(P＜0.05)，TMT組對結(jié)腸運動調(diào)節(jié)作用優(yōu)于廣藿香油組和廣藿香水提物組。給藥后，TMT組、廣藿香油組、廣藿香水提物組大鼠直腸擴張時的疼痛閾值明顯上升。廣藿香油組、廣藿香水提物組對直腸擴張時的疼痛閾值的改善作用優(yōu)于TMT組。

PI?IBS模型組大鼠結(jié)腸組織中CRF與5?HT表達均顯著升高，而5?HT的異常升高會導(dǎo)致腸道內(nèi)臟敏感性和腸道動力異常，證明CRF和5?HT的表達異常與PI?IBS的發(fā)生有密切關(guān)系。給予廣藿香提取物干預(yù)后，廣藿香提取物能夠明顯降低PI?IBS模型大鼠結(jié)腸內(nèi)CRF與5?HT的含量，說明廣藿香可能是通過下調(diào)PI?IBS模型大鼠結(jié)腸CRF的表達，影響肥大細胞釋放5?HT，降低了結(jié)腸內(nèi)5?HT的含量，從而改善PI?IBS的相關(guān)癥狀。與TMT組比較，廣藿香油組和廣藿香揮發(fā)油組下調(diào)CRF與5?HT的作用優(yōu)于TMT組。

CGRP是一種主要的炎癥促進型的感覺神經(jīng)肽，在結(jié)腸固有膜血管壁表達尤其豐富，且在腸壁各層均有分布，具有調(diào)節(jié)胃腸運動、血流及分泌的功能。作為調(diào)節(jié)介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)的CGRP有促炎作用，能直接產(chǎn)生傷害作用，還參與內(nèi)臟傷害性遞質(zhì)的傳遞[14]。本研究顯示，與模型組比較，廣藿香油、廣藿香水提物、TMT均可以顯著降低PI?IBS大鼠結(jié)腸CGRP含量，但CGRP水平仍明顯高于正常組。結(jié)果提示，廣藿香提取物和TMT可以通過下調(diào)結(jié)腸CGRP含量從而調(diào)節(jié)PI?IBS內(nèi)臟敏感性。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)家族中的一員，在中樞有致痛和致敏感性作用。研究發(fā)現(xiàn)，適量的內(nèi)源性BDNF可維持感覺神經(jīng)及其神經(jīng)通路的正常功能，其異常升高可引起內(nèi)臟疼痛及其高敏感性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PI?IBS模型組大鼠海馬BDNF表達明顯升高，廣藿香干預(yù)后可下調(diào)模型組大鼠海馬BDNF表達，從而改善PI?IBS的相關(guān)癥狀。

綜上所述，廣藿香提取物可以有效調(diào)控感染后腸易激綜合征的模型大鼠結(jié)腸運動，能顯著改善大鼠直腸擴張?zhí)弁撮撝?；廣藿香對感染后腸易激綜合征模型大鼠內(nèi)臟高敏感性的調(diào)控作用可能與5?HT信號系統(tǒng)有關(guān)。