黃芪注射液對(duì)LPS所致THP?1源性巨噬細(xì)胞炎癥的干預(yù)作用

蔡大可，李鈺婷，胡子旋，甘海寧，黃雪君，黃丹娥，楊九妹，賴亦靜，李方圓，陳玉興

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510095；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；4.中山大學(xué)新華學(xué)院，廣東廣州510520）

黃芪作為一味傳統(tǒng)中藥，具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)單味黃芪、復(fù)方黃芪及其有效成分均具有保護(hù)心血管[2?3]、降血糖血脂[4?5]、免疫調(diào)節(jié)[6?7]、保肝[8]、護(hù)腎[9]、抗腫瘤[10]等藥理作用。有文獻(xiàn)表明黃芪具有較強(qiáng)抗炎活性的同時(shí)兼具免疫調(diào)節(jié)的雙重作用[11?12]，避免一般抗炎藥物治療所引起的機(jī)體免疫失衡等不良反應(yīng)，滿足于現(xiàn)代抗感染治療的新需求而被廣泛用于臨床治療心氣虛損、心脈瘀阻之病毒性心肌炎[13]、心功能不全及脾虛濕困之肝炎[14]等病癥。巨噬細(xì)胞作為上述炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，能夠左右疾病的轉(zhuǎn)歸與發(fā)展，同時(shí)也能夠被治療藥物所調(diào)控[15?16]。巨噬細(xì)胞根據(jù)其活化狀態(tài)、發(fā)揮功能以及分泌因子的不同，分為M1型和M2型，M1型巨噬細(xì)胞通過干擾素?g（interferon?g，INF?g）及細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）活化，主要分泌促炎因子IL?1β等；M2型巨噬細(xì)胞通過分泌IL?4、IL?10等抗炎因子從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)以及組織修復(fù)等作用[17?18]。兩種分型巨噬細(xì)胞的數(shù)量比例對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)生及消退起著關(guān)鍵的作用，且M1和M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與炎癥小體信號(hào)通路NLRP3/CASPASE?1/IL?1β的調(diào)控有關(guān)[19]，因此后者與黃芪的抗炎分子機(jī)制密切關(guān)系。黃芪注射液是我國(guó)CFDA批準(zhǔn)上市的黃芪提取物藥品，具有明確的抗炎作用[20]，但是其對(duì)巨噬細(xì)胞的炎癥表征以及關(guān)鍵促炎因子IL?1β的調(diào)控還尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過在LPS刺激THP?1源性巨噬細(xì)胞的模型上，探討黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響作用，在細(xì)胞水平上為黃芪注射液在臨床抗炎應(yīng)用以及藥物作用機(jī)理研究中提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

BS224S電子天平（1/萬(wàn)），購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；5450型小型高數(shù)離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；IM5?50型全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，購(gòu)自常熟市雪科電氣有限公司；VarioskanFlash型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；IQTM5型熒光定量PCR儀和SmartSpecplus核酸蛋白測(cè)定儀，購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad公司；ini?protean Teral Cell垂直電泳槽、Pow?erPac Basic電泳儀、M制膠器均購(gòu)自美國(guó)Bio?Rad公司；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)MilliPore公司；Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 主要試劑

黃芪注射液，購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1810112；LPS，購(gòu)自廣州奕元生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20180616；佛波酯（PMA），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：20190103；RPMI?1640培養(yǎng)基，購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，批號(hào)：201811；1%10 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素混合液（雙抗），購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：20180907；胎牛血清，購(gòu)自博維根生物制品有限公司，批號(hào)：181023；無(wú)水乙醇和異丙醇，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20181102；脫氧核糖核酸去離子水，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：20180722；TRIzol?總RNA提取試劑，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：20180117；SYBRgreen和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，批號(hào)：20180114；PCR引物，由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成；NLRP3和caspase?1抗體，購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：201811；CCK8試劑盒，購(gòu)自東仁化學(xué)（上海）有限公司，批號(hào)：20180901；IL?4、IL?10和IL?1βELISA試劑盒，購(gòu)自上海邦奕生物科技有限公司，批號(hào)：201809；RIPA蛋白裂解液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：201810；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、5×SDS?PAGE購(gòu)自美國(guó)bimake生物科技有限公司，批號(hào)：201809。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

THP?1細(xì)胞株購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞中心。THP?1單核細(xì)胞用含10%（φ）胎牛血清、1%10 U/mL青霉素和10 mg/mL鏈霉素混合液的RPIM?1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)目維持在1×106cells/mL，待生長(zhǎng)良好，以6×105cells/mL細(xì)胞數(shù)接種于相應(yīng)板中。

2.2 細(xì)胞分組

將生長(zhǎng)良好的THP?1單核細(xì)胞均勻接種于96孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，用于黃芪注射液對(duì)細(xì)胞增殖的檢測(cè)。在接種細(xì)胞的同時(shí)，給予10 nmol/L PMA誘導(dǎo)24 h，將THP?1單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，24 h后將含PMA培養(yǎng)基棄去，換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，后換無(wú)血清培養(yǎng)基100 mL/孔，同時(shí)給予相應(yīng)藥物，分別為正常組、黃芪注射液（HQ）10%[注射劑體積/（培養(yǎng)基體積+注射劑體積）]、5%、2.50%、1.25%、0.625%、0.313%、0.156%、0.078%組，每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)兩塊板。干預(yù)24 h后，其中一塊板每孔加入10 mL CCK8,另一塊不作處理。1 h后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞存活率（存活率=A給藥組/A空白組×100%）。

將生長(zhǎng)良好的THP?1單核細(xì)胞均勻接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，共6組，分別為正常對(duì)照組（Control）、模型組（LPS 500 ng/mL）、LPS+黃芪注射液200μL/mL（HQ200）、LPS+黃芪注射液100μL/mL（HQ100）、LPS+黃芪注射液50μL/mL（HQ50）、LPS+黃芪注射液25μL/mL（HQ25），以同樣的方法誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，換無(wú)血清培養(yǎng)基2 mL/孔，同時(shí)給予相應(yīng)藥物，重復(fù)2次實(shí)驗(yàn)，干預(yù)24 h后，上清液用于ELISA檢測(cè)，細(xì)胞用于PCR和WB的檢測(cè)。

2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL?4、IL?10和IL?1β的含量

在藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書，用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)A值，再根據(jù)公式計(jì)算IL?4（Y=-3.48×10-7X2+6.65×10-4X+1.31×10-4）、IL?10(Y=7.06×10-10X2+4.07×10-5X?5.16×10-3)和IL?1β(Y=?7×10-7X2+0.001X+0.034)的含量。

2.4 RT?qPCR檢測(cè)炎癥相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

每孔細(xì)胞中加入1 mL TRIzol，室溫放置5 min，根據(jù)TRIzol總RNA提取試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，用0.5 mg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，用b?actin基因作為內(nèi)參對(duì)照基因，在反應(yīng)條件：步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→60℃×30 s→72℃×50 s（45個(gè)循環(huán)）；步驟3：72℃×7 min下，進(jìn)行RT?qPCR擴(kuò)增，運(yùn)用2-△△C t法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物信息如表1所示。

表1 炎癥相關(guān)引物序列Table 1 Primers sequences of inflammation?related genes

2.5 Western blot檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)

將RIPA、蛋白酶抑制劑、磷酸化酶抑制劑按照100∶1∶1的體積比制成混合物，六孔板中的細(xì)胞每孔加入100 mL RIPA混合物，并在4℃下裂解5～10 min，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮取轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，進(jìn)行超聲離心后，吸取上清，根據(jù)上清量加入5×SDS?PAGE蛋白緩沖液，95℃煮沸5 min使蛋白變性，-80℃下保存。根據(jù)目的蛋白條帶選擇分離膠濃度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)Marker條帶大小取所需要的蛋白條帶，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，洗滌，孵育二抗，洗滌，在化學(xué)發(fā)光液中浸泡1 min后，用凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行拍攝。用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal?Wallis檢 驗(yàn)，P＜0.05為 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，10 mL/mL以內(nèi)系列濃度的黃芪注射液對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，且可促進(jìn)細(xì)胞增殖，因而在安全范圍內(nèi)選取系列濃度進(jìn)行藥效研究。

3.2 黃芪注射液對(duì)LPS所致巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

如表2所示，在LPS刺激下，巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子IL?4、IL?10含量顯著降低（P＜0.05），而趨化因子IL?1β的分泌量顯著升高（P＜0.05）；在給予黃芪注射液干預(yù)后，與LPS組相比，IL?4和IL?10的分泌量呈上升趨勢(shì)，其中HQ100組和HQ50組的IL?4分泌量顯著升高（P＜0.01），HQ100組和HQ25組的IL?10分泌量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而各組IL?1β分泌量均顯著降低（P＜0.05,P＜0.01）。

圖1 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of astragalus injection on macrophage prolif?eration（±s，n=6）

3.3 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，在LPS刺激下，巨噬細(xì)胞中抗炎因子IL?4、IL?10 mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.05），而促炎因子IL?1β、CASPASE?1、IL?6以及IL?18 mRNA的表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；在給予黃芪注射液干預(yù)后，與LPS組相比，IL?4和IL?10mRNA表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)（P＜0.01），I L?1β、C A S PA S E?1、IL?6以及IL?18 mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。

3.4 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

如圖3所示,在LPS的刺激下，巨噬細(xì)胞炎癥小體NLRP3及其下游cleaved?CASPASE?1蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；在黃芪注射液的干預(yù)下，與LPS組比較，HQ25、HQ50和HQ200組的NLRP3、cleaved?CASPASE?1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。

表2 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Table 2 Effect of astragalus injection on the secretion of IL?4,IL?1βand IL?10 in macrophages（±s，n=3） ρ/(pg·mL?1)

表2 黃芪注射液對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響Table 2 Effect of astragalus injection on the secretion of IL?4,IL?1βand IL?10 in macrophages（±s，n=3） ρ/(pg·mL?1)

與正常組比較：#P＜0.05；與LPS組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別Control LPS HQ200 HQ100 HQ50 HQ25藥物濃度-500 ng/mL 200μL/mL 100μL/mL 50μL/mL 25μL/mL IL?4 212.06±2.90 193.92±3.26#213.36±27.69 216.90±1.95**220.15±2.98**196.78±6.63 IL?10 1 612.84±174.61 1 360.03±35.19#1 465.35±93.53 1 620.90±48.41**1 504.34±71.31 1 860.14±115.40**IL?1β 106.46±6.46 125.60±9.10#111.36±5.34*105.84±1.17*99.82±6.76**103.99±13.53**

圖2 黃芪注射液對(duì)炎癥基因mRNA表達(dá)的影響Figure 2 Effect of astragalus injection on the mRNA expression of inflammatory genes（±s，n=3）

圖3 黃芪注射液對(duì)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響Figure 3 Effect of astragalus injection on the expression of inflammation?related protein（±s，n=3）

4 討論

黃芪注射液是中藥黃芪按照標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑所提取的注射劑，其成分之一芒柄花素可與AMPK間接結(jié)合激活自噬，降低LPS誘導(dǎo)的NLRP3表達(dá)[21]。在小鼠巨噬細(xì)胞（ANA?1細(xì)胞）中黃芪注射液可上調(diào)自噬通量，抑制炎癥因子IL?1β、IL?6的分泌從而發(fā)揮抗炎作用[22]。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黃芪注射液具有明顯的抗炎作用，而且發(fā)現(xiàn)其抗炎作用與NLRP3/caspase?1的激活相關(guān)。同時(shí)，其抗炎作用亦與抗炎因子與促炎因子的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、兩類因子的相互轉(zhuǎn)化有相關(guān)性。

THP?1細(xì)胞因具有與人原代單核細(xì)胞相似的形態(tài)和功能，且具有穩(wěn)定的基因背景，而常被用于免疫和炎癥的研究。本實(shí)驗(yàn)通過用佛波酯（PMA）將THP?1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而通過LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化用以造成巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將巨噬細(xì)胞用LPS處理后，趨化因子IL?1β的分泌明顯增加，且炎癥因子IL?1β、CAS?PASE?1、IL?6、IL?18 mRNA表達(dá)以及NLRP3及其下游激活型CASPASE?1蛋白表達(dá)量也顯著升高。IL?1β是M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志性炎性因子[23]，也是介導(dǎo)各種炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，在LPS或某些病毒的刺激下可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌[24]，對(duì)單核/巨噬細(xì)胞具有特異性趨化，從而激活炎性反應(yīng)的下游環(huán)節(jié)，促進(jìn)IL?6、IL?18等的分泌，最終形成炎癥性損傷[25]。由此可見，LPS可刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促炎M1型巨噬細(xì)胞，致使IL?1β相關(guān)炎癥小體炎癥的激活，該結(jié)果驗(yàn)證LPS調(diào)控巨噬細(xì)胞分化及促炎的作用[26]。黃芪注射液作為抗炎藥物，能否逆轉(zhuǎn)LPS所致的炎癥小體激活仍有待驗(yàn)證。

在給予黃芪注射液干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，THP?1源性巨噬細(xì)胞中IL?1β的轉(zhuǎn)錄水平、胞外分泌下降，IL?1β的翻譯后修飾調(diào)控蛋白NLRP3及caspase?1亦受到抑制，且炎癥因子I L?6、IL?18 mRNA表達(dá)也明顯減少。鑒于IL?1β為巨噬細(xì)胞參與多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，其激活過程需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)和剪切激活等關(guān)鍵步驟[27]，黃芪注射液對(duì)于IL?1β轉(zhuǎn)錄及其上游NLRP3炎癥小體活性均有調(diào)控作用，提示黃芪注射液的調(diào)控靶點(diǎn)可能為IL?1β及NLRP3共同上游的調(diào)控因子——活性氧[28]。另外，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可明顯上調(diào)IL?4和IL?10的mRNA表達(dá)以及分泌。IL?4和IL?10是M2型巨噬細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子，M2型巨噬細(xì)胞可通過這些抑制性細(xì)胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答，限制炎性反應(yīng)[21]。換言之，黃芪注射液可促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化。由于巨噬細(xì)胞極化亦為細(xì)胞內(nèi)活性氧所調(diào)控，黃芪注射液促巨噬細(xì)胞極化的作用可能與其調(diào)控活性氧本身或其相關(guān)分子靶點(diǎn)相關(guān)。

綜上所述，黃芪注射液具有明顯的抗炎藥效，并通過逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞NLRP3/caspase?1/IL?1β炎癥小體激活以及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化等雙重調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)，從而抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上對(duì)黃芪注射液的抗炎作用進(jìn)行研究，為黃芪注射液的臨床應(yīng)用及藥理作用研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。