變性乳清分離蛋白膠體及其在慢速團(tuán)聚條件下團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)的光散射研究

魏丹，蔣贛，伍春嫻

（廣東藥科大學(xué)醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山528458）

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）被稱為“蛋白之王”，是從牛奶中提取的一種蛋白質(zhì)，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點(diǎn)，其生物學(xué)價(jià)值和臨床價(jià)值較高，在食品、醫(yī)療等領(lǐng)域具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景[1?3]。因此，近年來許多專家學(xué)者開展了對(duì)WPI的研究，尤其是對(duì)其團(tuán)聚和凝膠行為及相應(yīng)團(tuán)聚體和凝膠結(jié)構(gòu)的研究[4?5]。

過去，WPI用于食物和醫(yī)藥領(lǐng)域的時(shí)候，都是首先將WPI加入到食物或者藥物中，然后將混合物加熱到至少65℃形成濃度較高的溶液或凝膠[5?7]，這樣很容易破壞食物和藥物的性質(zhì)。于是冷固團(tuán)聚和凝膠技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，這種技術(shù)將WPI加入到食物和藥物中的方法分為兩步：第一步將WPI熱變性得到WPI初 級(jí) 團(tuán) 聚 體（WPI?PreA，Why Protein Isolate Pre?aggregate）膠體分散體；第二步再將WPI?PreA膠體分散體和食物或藥物一起在室溫下用電解質(zhì)（Ca?Cl2，NaCl等）誘導(dǎo)團(tuán)聚和凝膠[8?9]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的大多數(shù)研究集中于第一步，兩步結(jié)合起來研究以及對(duì)第二步團(tuán)聚過程的動(dòng)力學(xué)研究比較少。本研究采用光散射方法將兩步研究結(jié)合起來，第一步對(duì)WPI熱 變 性 得 到WPI?PreA，用 廣 角 光 散 射 儀（WALS，Wide Angle Light Scattering）的動(dòng)態(tài)光散射（DLS，Dynamic Light Scattering）和 靜 態(tài) 光 散 射（SLS，Static Light Scattering）方法測(cè)量WPI?PreA的一系列重要參數(shù)；第二步采用電解質(zhì)CaCl2溶液對(duì)WPI?PreA誘導(dǎo)團(tuán)聚，首先得到其臨界聚沉濃度（C CC，Critical Coagulation Concentration），然后選取遠(yuǎn)離C CC的1個(gè)CaCl2溶液濃度，用小角光散射儀（SALS，Small Angle Light Scattering）研究其在慢速團(tuán)聚（RLCA，Reaction Limited Cluster Aggregation）條件下的團(tuán)動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)，同時(shí)引入了電子顯微鏡（EM，Electron Microscopy）的取像成像顯微技術(shù)驗(yàn)證得到的團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的可靠性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

針頭式過濾器（25 mm GD/X，濾紙孔徑0.45 mm，英國(guó)Whatman公司）；電子顯微鏡（FEI Quanta 600 ESEM，美國(guó)），檢測(cè)系統(tǒng)：取向成像顯微術(shù)（OIM），EDX能譜分析，特點(diǎn)：LaB6發(fā)射極，高壓1～40 kV；廣角光散射儀，BI?200SM角度測(cè)量器（美國(guó)Brookhaven Instruments）配以Ventus LP532型激光發(fā)射器（英國(guó)Laser Quantum），入射光波長(zhǎng)為λ1=532 nm，測(cè)角范圍20～145°；Mastersizer 2000小角光散射儀（英國(guó)Malvern），入射光波長(zhǎng)為λ2=633 nm，測(cè)角范圍0.02～40°。

1.2 試劑

WPI粉末（BiPro，JE345?3?420，Davisco Foods In?ternational Inc.，美國(guó)明尼蘇達(dá)）；疊氮化鈉（NaN3，分析純）、NaOH（固體，分析純）、HCl溶液（0.1 mol/L，分析純）、4?羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液（HEPES，分析純）均由Sigma?Aldrich公司提供。超純水，自制。

2 方法

2.1 WPI?PreA的制備及性質(zhì)測(cè)定

將WPI粉末溶解于超純水（后面所有溶液的配置均用超純水）中，并用NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，配制成WPI濃度Cp=100 g/L的溶液后加熱到90℃保持30 min使全部變性，然后趁熱用針頭式過濾器將溶液過濾除掉溶液中可能存在的大團(tuán)聚體。變性后得到的WPI?PreA溶液進(jìn)一步用含有NaN3（作用是避免細(xì)菌滋生）的超純水稀釋至Cp=50 g/L的膠體分散體（最終NaN3的濃度為5×10-3mol/L），儲(chǔ)存于溫度為4℃左右的冰箱中，備用。按照文獻(xiàn)[10]方法采用DLS和SLS方法測(cè)量初級(jí)粒子在不同濃度的旋轉(zhuǎn)半徑R g,0和Rh,0。

2.2 臨界聚沉濃度的測(cè)量

臨界聚沉濃度（C C C，Critical Coagulant Concen?tration）是指在一定時(shí)間內(nèi)，使一定量的溶膠發(fā)生明顯的聚沉所需電解質(zhì)的最小濃度。將一定數(shù)量的分散體滴加到不同濃度的電解質(zhì)溶液中，設(shè)定膠粒的體積分?jǐn)?shù)為φ=5×10-2時(shí)，肉眼觀察是否有絮狀凝膠物出現(xiàn)，絮狀凝聚物馬上出現(xiàn)時(shí)電解質(zhì)的最小濃度即為該膠體的臨界聚沉值。需要說明的是，雖然以上測(cè)試聚沉值的方法為經(jīng)驗(yàn)方法，但因?yàn)槟z體的穩(wěn)定性對(duì)離子的強(qiáng)度變化極其敏感，特別是膠粒與分散介質(zhì)的顏色差別較大時(shí)，聚沉值的誤差在10%以下[8,11]。測(cè)得本體系WPI?PreA在CaCl2誘導(dǎo)下的C CC值為26 mmol/L。

2.3 CaCl2誘導(dǎo)的RLCA團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)及測(cè)量

為了保證團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)在RLCA條件下進(jìn)行，選取遠(yuǎn)離C C C的CaCl2濃度Cs=10 mmol/L，膠粒體積濃度C p=2.00 g/L。實(shí)驗(yàn)開始前，先用超純水對(duì)WPI?PreA膠體分散體和CaCl2溶液進(jìn)行多次稀釋，以免膠體溶液和電解質(zhì)溶液濃度太高導(dǎo)致團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)過程中局部混合不均而出現(xiàn)大團(tuán)聚體。然后把稀釋的CaCl2溶液倒入膠體分散體中達(dá)到設(shè)定的電解質(zhì)濃度、膠粒濃度和設(shè)定的pH值7.00。平衡幾秒后，將溶液分成相等的兩部分，一部分用注射器迅速但輕輕地把團(tuán)聚體系注入SALS測(cè)試槽，在線檢測(cè)膠粒的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)過程；另一部分置于與測(cè)試槽溫度相同的恒溫水槽中，待到團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取出團(tuán)聚體做EM測(cè)試。

3 結(jié)果與討論

3.1 WPI?PreA表征結(jié)果

由Zimm?plot[12]方法可知膠粒的重均分子量Mw和第二維里系數(shù)A存在如下關(guān)系：

其中,Cp是WPI的濃度，g/cm3；K是光學(xué)常數(shù):

其中，n0是溶劑水的折光指數(shù)（1.33）；d n/d C p是WPI溶液的折光指數(shù)增量，根據(jù)文獻(xiàn)[13]及WPI成分組成計(jì)算值為0.190 cm3/g；N A是阿伏伽德羅常數(shù)（6.02×1023）；方程(1)中的R e x(θ)是膠粒在角度θ的超瑞利比，它與相同角度下甲苯的超瑞利比R T（Wu等測(cè)得在入射光波長(zhǎng)范圍為420～700 nm時(shí)，其值為2.13×10-5cm-1）之間的關(guān)系為：

其中，Iex(θ)是所測(cè)膠體在角度θ的光散射強(qiáng)度；IT是甲苯在與所測(cè)膠體相同測(cè)試條件下的光散射強(qiáng)度，nT是甲苯的折光指數(shù)，取1.496。

圖1中的圓點(diǎn)曲線是用SLS方法得到的K Cp/Rex(0)與WPI濃度Cp之間的關(guān)系，二者基本呈直線關(guān)系，用方程(1)由直線斜率和截距可以得到WPI?PreA的重均分子量Mw和第二維里系數(shù)A2的值，見表1?？梢?，A2的值是正值，表明WPI?PreA之間的相互作用力是排斥力，這與蛋白質(zhì)表面含有羧基有關(guān)，其pKa～4.75，本體系pH為7.00，羧基基本處于電離狀態(tài)帶負(fù)電，分子與分子之間的羧基間存在排斥力，因此，置于冰箱中并且含有5×10-3mol/L的NaN3的WPI?PreA可以保存數(shù)月之久。WPI的分子量為6.06×104g/mol，從Mw值可以算出WPI?PreA的聚集度Nagg為91.82，見表1。

用SLS和DLS方法測(cè)得的不同C p下WPI?PreA的旋轉(zhuǎn)半徑Rg,0和水力學(xué)半徑Rh,0見圖1所示。可見，Rh,0的平均值為29.32 nm，與C p基本無關(guān)，而R g,0的平均值為70.54 nm，是Rh,0的2.50倍，且其值隨Cp的增加有些許減小。這主要是由R g,0和Rh,0的定義及初級(jí)團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)決定的，Rg,0是根據(jù)膠粒分子上各個(gè)點(diǎn)到其質(zhì)量中心的平均距離計(jì)算的，而Rh,0是指與所測(cè)膠粒具有相同擴(kuò)散系數(shù)的球形膠粒的半徑，所以Rg,0與膠粒形狀密切相關(guān)，其值隨Cp減小，說明其外部無規(guī)則延展開的鏈因?yàn)闈舛仍黾訉?dǎo)致膠粒之間相互碰撞幾率增加而受到阻礙，Rg,0的平均值為Rh,0的2.50倍主要也是由于WPI變性時(shí)形成的延展開的長(zhǎng)纖維狀結(jié)構(gòu)所致[14?15]。

表1 初級(jí)團(tuán)聚體WPI?PreA相關(guān)參數(shù)的測(cè)定結(jié)果Table 1 Parameters of the prepared WPI pre?aggregates(WPI?PreA)

圖1 KCp/R ex(0)、WPI?PreA旋轉(zhuǎn)半徑R g,0和水力學(xué)半徑Rh,0與WPI濃度C p的關(guān)系Figure 1 The relationship between the quantity,KC p/R ex(0),the radius of gyration,R g,0,and the hydrodynamic radius,R h,0,of the WPI?PreA,and the WPI concentration,Cp

3.2 RLCA條件下WPI?Pre A的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)

WPI?Pr e A的團(tuán)聚在室溫下進(jìn)行，濃度固定在C p=2.00 g/L。SALA所測(cè)得的團(tuán)聚體的光散射強(qiáng)度I(q)的表達(dá)式如下[10,16]：

其中，I(0)是q=0的散射強(qiáng)度，P(q)是初級(jí)團(tuán)聚體WPI?Pre A的形狀因子，它由直接測(cè)量濃度為2.00 g/L的WPI?Pr e A分散體得到，〈S(q)〉是電解質(zhì)誘導(dǎo)團(tuán)聚得到的團(tuán)聚體的歸一化形狀因子，對(duì)初級(jí)團(tuán)聚體可以認(rèn)為〈S(q)〉=1。q是基于散射角q計(jì)算得到的波矢量：

團(tuán)聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈R g〉*和分形維數(shù)D f，可以從〈S(q)〉得到[10,17]：

由方程(6)和(7)得到的平均旋轉(zhuǎn)半徑只有在團(tuán)聚體足夠大時(shí)才正確，對(duì)小團(tuán)聚體，比如在團(tuán)聚初始階段生成的團(tuán)聚體，初級(jí)團(tuán)聚體對(duì)旋轉(zhuǎn)半徑的貢獻(xiàn)需要考慮進(jìn)來：

其中，R g,0的值見表1所示。

此外，分形維數(shù)Df還可以由q=0處的光散射強(qiáng)度I(0)求得[8,18]：

膠粒團(tuán)聚過程中團(tuán)聚體質(zhì)量分布可以用PBE模型來表述[8,15,18]：

其中N i(t)是質(zhì)量為i的團(tuán)聚體在時(shí)間t的質(zhì)量濃度，K i,j是質(zhì)量為i和j的兩個(gè)團(tuán)聚體之間的團(tuán)聚速率常數(shù)，它的定義如下：

其中，KB=8kT/3μ是Smoluchoeski速率常數(shù)（k是波爾茲曼常數(shù)，1.381×10-23J/K，T和μ分別是分散體的溫度和動(dòng)力學(xué)黏度，單位分別為K和Pa·s）；W是Fuchs穩(wěn)定性常數(shù)，典型RLCA團(tuán)聚過程其值大于5，一般小角光散射適合測(cè)得的值在103～107數(shù)量級(jí)的范圍；乘積項(xiàng)(ij)λ表示在RLCA團(tuán)聚過程中，團(tuán)聚體的反應(yīng)速率隨團(tuán)聚體質(zhì)量的增加而增大，指數(shù)λ的值理論上一般是0.50左右[10,15,19?20]。這個(gè)模型的解能給出整個(gè)團(tuán)聚過程中不斷長(zhǎng)大的所有團(tuán)聚體的質(zhì)量分布（Ni，i=1,2，……），從Ni可以計(jì)算出團(tuán)聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈R g〉的值：

其中，Rg,i是質(zhì)量為i的單個(gè)團(tuán)聚體的旋轉(zhuǎn)半徑，RLCA條件下，無融合膠粒團(tuán)聚體的分形維數(shù)D f值的范圍為2.00～2.10，可以通過上述團(tuán)聚體平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉和q=0處光散射強(qiáng)度I(0)等得到，可以作為一個(gè)已知參數(shù)，所以通過公式(10)、(11)和(12)擬合膠粒的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)就只有W和λ兩個(gè)擬合參數(shù)，盡管體系中有兩個(gè)擬合參數(shù)，但W只對(duì)〈R g〉的初始值敏感，而λ對(duì)團(tuán)聚過程后期的〈Rg〉值敏感。

圖2是用SALS測(cè)得的團(tuán)聚體的散射強(qiáng)度隨時(shí)間的演化曲線，分為兩個(gè)不同的時(shí)間間隔展示于(A)（團(tuán)聚初期）和(B)圖（團(tuán)聚中后期），從圖(A)可以看到早期的團(tuán)聚時(shí)間t=20.60 min時(shí)，I(q)的值在大q值處（q=1×10-3）有一個(gè)彎曲，其彎曲位置隨著時(shí)間不斷上揚(yáng)且移向小q值處（q＜1×10-3），在q＞1×10-3部分曲線不重疊，說明團(tuán)聚初期是由WPI?PreA初級(jí)團(tuán)聚體或微觀結(jié)構(gòu)團(tuán)聚體不斷結(jié)合長(zhǎng)大的過程。團(tuán)聚中后期圖(B)中I(q)的值在q＜1×10-3部分依然隨著時(shí)間向上增長(zhǎng)，而在q＞1×10-3部分，曲線重疊在一起基本與時(shí)間無關(guān)，這表明微觀結(jié)構(gòu)的變化已經(jīng)結(jié)束，這些微觀結(jié)構(gòu)團(tuán)聚體開始連接在一起形成宏觀結(jié)構(gòu)，即凝膠。I(q)的值隨著團(tuán)聚過程的進(jìn)行顯著增大，表明團(tuán)聚體隨著團(tuán)聚的進(jìn)行逐漸長(zhǎng)大，這種緩慢、漸進(jìn)的團(tuán)聚體增長(zhǎng)表明WPI?PreA的團(tuán)聚是在RLCA條件下進(jìn)行的，I(q)曲線上的冪指數(shù)區(qū)域跨越兩個(gè)數(shù)量級(jí)且其斜率值為-2.10，是典型的RLCA條件下得到的團(tuán)聚體的分形維數(shù)的值。

圖2 WPI?PreA團(tuán)聚過程中的團(tuán)聚體的光散射強(qiáng)度I(q)曲線隨時(shí)間的演化曲線Figure 2 Typical time evolution of the scattered intensity curves I(q)to the aggregation of the WPI?PreA

將不同時(shí)間團(tuán)聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉對(duì)歸一化的波矢量q×〈R g〉作圖，如圖3所示，可以看到曲線全部重疊在一起，冪指數(shù)區(qū)域跨越兩個(gè)數(shù)量級(jí)，呈直線關(guān)系，直線的斜率為-2.10，說明WPI?PreA的團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出分形體特征，且在研究條件下的團(tuán)聚過程屬于典型的RLCA團(tuán)聚，分形維數(shù)D f=2.10。為了更進(jìn)一步證明從I(q)和S(q)得到的Df值的正確性，用公式(9)計(jì)算了不同時(shí)間q=0處的散射光強(qiáng)度I(0)與〈R g〉/Rh,0之間關(guān)系，如圖4所示，可見除了團(tuán)聚初始階段的兩個(gè)點(diǎn)（團(tuán)聚初期會(huì)有稍許誤差），I(0)與〈R g〉/Rh,0的log?log對(duì)數(shù)關(guān)系圖基本呈直線，且直線斜率為2.11，進(jìn)一步證明了WPI?PreA在RLCA條件下的團(tuán)聚過程中形成團(tuán)聚體的Df值確實(shí)是2.10左右。分形維數(shù)D f越小，所形成團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)越疏松；反之，Df值越大，如D f的值為3.00左右，說明形成團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)越緊密，纖維狀凝膠與含有低分形維數(shù)的團(tuán)聚體的凝膠是相似的，根據(jù)所得到的D f的值認(rèn)為團(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)呈纖維狀結(jié)構(gòu)[10]。取上述方法得到的Df=2.10，將W和入作為擬合參數(shù)，用PBE模型方程(10)、(11)和(12)對(duì)采用公式(6)和(8)計(jì)算得到的團(tuán)聚體的平均旋轉(zhuǎn)半徑〈Rg〉隨時(shí)間t的變化曲線進(jìn)行擬合，得到W和λ的值分別為1.10×106和0.45，如圖5所示，可見曲線擬合值和空心圓點(diǎn)實(shí)驗(yàn)值能較好地吻合，證明了前面得到的D f值的可靠性。

圖3 圖2中不同時(shí)間的團(tuán)聚體的歸一化平均結(jié)構(gòu)因子〈S(q)〉與歸一化的波矢量q×〈Rg〉的函數(shù)關(guān)系圖Fi gure 3 The normalized average structure factor of clusters,〈S(q)〉,at various aggregation times,as a function of normalized wavevector,q×〈R g〉corresponding to the ag?gregation system in Fig.2

為了更進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)分析的可靠性，采用電鏡（EM）的取像成像技術(shù)對(duì)團(tuán)聚實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的團(tuán)聚體進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。可見，團(tuán)聚體呈絞成股狀的疏松的纖維狀結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了光散射實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

圖4 在q=0處的散射光強(qiáng)度I(0)與〈R g〉/Rh,0之間關(guān)系的時(shí)間演化曲線Figur e 4 Time evolution of the intensity at q=0,I(0),as a function of the corresponding〈R g〉/Rh,0

圖5 〈Rg〉隨時(shí)間t的變化規(guī)律的PBE擬合結(jié)果（實(shí)線曲線）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（空點(diǎn)點(diǎn)線）的比較Figur e 5 PBE simulations(solid line)of the time evolutions of〈Rg〉compared with experiments(open symbol)

圖6 WPI?PreA團(tuán)聚體的EM圖Fi gure 6 EM image of WPI?PreA clusters

4 結(jié)論

本文采用光散射方法研究乳清分離蛋白WPI熱變性得到的初級(jí)團(tuán)聚體WPI?Pre的性質(zhì)及WPI?Pre在電解質(zhì)CaCl2誘導(dǎo)下在慢速團(tuán)聚（RLCA）下的團(tuán)聚動(dòng)力學(xué)和團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)。得到的WPI?Pre的一系列重要參數(shù)：重均分子量Mw、第二維里系數(shù)A2、旋轉(zhuǎn)半徑Rg,0和水力學(xué)半徑Rh,0的值，說明初級(jí)膠粒分子之間存在排斥力且呈纖維狀結(jié)構(gòu)，這種分析方法能為蛋白質(zhì)的分析檢測(cè)提供一種比較可靠的方法。通過小角光散射研究分析認(rèn)為團(tuán)聚體呈疏松的纖維狀結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡的取像成像顯微術(shù)驗(yàn)證了光散射測(cè)試結(jié)果的可靠性，對(duì)團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)的表征能為未來多孔材料、藥物緩釋膠囊等材料的制備提供參考依據(jù)和指導(dǎo)。