離子色譜法測(cè)定糊精中的5種還原糖

李藝，王淼

（廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510006）

糊精系由淀粉或部分水解的淀粉，在干燥狀態(tài)下經(jīng)加熱改性而制得的聚合物[1]。糊精通常分為白糊精、黃糊精和英國膠三類。白糊精隨著轉(zhuǎn)化作用的進(jìn)行，還原糖穩(wěn)定地上升到最高值，在轉(zhuǎn)化作用的后期，還原糖增加的速度較緩慢；黃糊精和英國膠，當(dāng)黏度開始下降時(shí)還原糖含量開始減少，因此，還原糖是反映淀粉水解程度的關(guān)鍵指標(biāo)。在制藥工業(yè)中，糊精作為藥用輔料主要用于片劑和膠囊劑的稀釋劑，片劑的黏合劑，糖包衣的增塑劑和黏合劑，以及混懸劑的增稠劑[2]，用量大，輔料的還原性可能影響制劑中原料藥的活性。因此有必要對(duì)糊精中還原糖進(jìn)行控制。

糊精收載于《中國藥典》2020年版四部[1]，利用還原糖對(duì)堿性酒石酸銅的還原性，采用重量法進(jìn)行測(cè)定；《美國藥典》和《英國藥典》中也收載了糊精，采用滴定法對(duì)還原糖進(jìn)行控制，原理與《中國藥典》相同，該法僅能分析還原糖的總量。目前，文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定還原糖和總糖的方法主要有高效液相色譜法[3?4]、比色法[5]及紫外可見法[6]等。上述方法大多存在需要前處理，分析效率低，或者選擇性較差的不足。而離子色譜法利用其優(yōu)異的陰離子交換色譜柱的分離技術(shù)，脈沖安培檢測(cè)器所具有的優(yōu)勢(shì)，在糖類物質(zhì)的檢測(cè)中得到越來越多的應(yīng)用，可以很好地彌補(bǔ)上述不足。因此，本研究參考文獻(xiàn)[7]，采用操作較為簡(jiǎn)單快速且專屬性較高的離子色譜法首次測(cè)定糊精中還原糖，為糊精的質(zhì)量控制提供一個(gè)簡(jiǎn)便而有效的方法。

1 儀器與試藥

ICS?5000+DC離子色譜儀，Thermofisher，主要配置在線脫氣裝置的四元梯度泵、柱溫箱、脈沖安培檢測(cè)器（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；D?葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110833?201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.5%）；麥芽糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100287?201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.4%）；麥芽三糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100274?201703）；麥芽四糖（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Z04J9X52064，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）；麥芽五糖（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：112017?201602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）；糊精樣品（A企業(yè)：180108C、180306B；B企業(yè)：180212、180301；C企業(yè)：171201；D企業(yè)：160314）；試劑均為分析純；純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜儀：ICS?5000+DC離子色譜儀；檢測(cè)器：脈沖安培檢測(cè)器（Au為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；色譜柱：Dionex CarboPac PA200分析柱（250 mm×5 mm），Dionex CarboPac PA200保護(hù)柱（50 mm×5 mm）；流速：0.4 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：25μL；以純化水流動(dòng)相A，0.25 mol/L NaOH溶液為流動(dòng)相B，0.25 mol/L醋酸鈉溶液為流動(dòng)相C，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水適量，搖勻，稀釋至刻度，作為供試品溶液，濾過（0.22μm微孔濾膜）。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖適量，加水稀釋成每1 mL中含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖各100μg的溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.3 屬性及系統(tǒng)適用性

取對(duì)照品溶液與空白溶液，精密量取25μL，分別注入離子色譜儀，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖見圖1?？梢?，D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的保留時(shí)間分別為7.2、19.8、23.4、27.4、30.3 min，分離度均大于1.5，空白溶劑無干擾。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液加水稀釋成含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖質(zhì)量濃度分別為0.1、1、2、5、10、20μg/mL的系列溶液，作為線性溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度作橫坐標(biāo)（X）、峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），得到各成分測(cè)定的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

2.5 檢出限和定量限的考察

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水定量稀釋制成每1 mL中含D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖各約0.01μg的溶液，作為限度溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算信噪比，以基線噪音3倍和基線噪音10倍分別計(jì)算檢出限及定量限，各成分的檢出限及定量限見表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各6份，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果測(cè)得D?葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的峰面積RSD值分別為0.8%、0.5%、0.9%、0.7%和0.8%，表明方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)供試品溶液，分別于0、2、8、12、24、48 h時(shí)進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積值。結(jié)果表明各成分峰面積均無顯著性變化，RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取A企業(yè)樣品（批號(hào)：180108C），按“2.2.1”項(xiàng)方法配制供試品溶液，共6份，分別進(jìn)樣記錄色譜圖，結(jié)果測(cè)得葡萄糖、麥芽糖、麥芽二糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五塘的RSD分別為1.2%、2.3%、0.8%、1.8%和1.9%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取A企業(yè)樣品（批號(hào)：180108C）約0.05 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液4、5、6 mL，再按“2.2.1”項(xiàng)方法制備低、中、高3個(gè)回收濃度的供試品溶液，各3份，共9份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果測(cè)得D?葡萄糖平均回收率為98.4%，RSD為0.5%；麥芽糖平均回收率為99.2%，RSD為0.3%；麥芽三糖平均回收率為100.9%，RSD為1.1%；麥芽四糖平均回收率為98.9%，RSD為1.0%；麥芽五糖平均回收率為99.1%，RSD為0.8%，詳見表3。

圖1 空白對(duì)照溶液（A）、對(duì)照品溶液（B）和供試品溶液（C）的離子色譜圖Figure 1 Chromatograms of the black(A),reference standard(B)and sample(C)

2.1 0 樣品測(cè)定

取4個(gè)不同廠家共6批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液與供試品溶液，進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。同時(shí)按《中國藥典》方法進(jìn)行還原糖測(cè)定遺留殘?jiān)鳂悠窚y(cè)定結(jié)果見表4。

表2 各成分的線性方程與線性范圍及檢出限和定量限Table 2 The linear equation,linear range,detection limit and quantitative limit of each component

表3 糊精中5種還原糖的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table3 Resultsofrecoveryoffivereducingsugarsindextrin

表4 不同廠家樣品中5種還原糖的測(cè)定結(jié)果Table 4 The results of determination of five reducing sugars in dextrin w/%

3 討論

在糊精的干法轉(zhuǎn)化過程中，淀粉發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)比較復(fù)雜，主要包含水解反應(yīng)、苷鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng)、再聚反應(yīng)。酸可催化斷裂淀粉中的α?1,4糖苷鍵，也可能斷裂α?1,6糖苷鍵[8]，苷鍵水解形成的還原性端基量增加，還原性增加。糊精中所含還原糖是混合物，水解反應(yīng)生成含有游離醛基或酮基的葡萄糖單糖和含有游離醛基的麥芽糖，因而具有一定的還原性。此外，糊精還可能水解出麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖等，也具有一定的還原性基團(tuán)。因此，本研究選擇上述5種糖進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示糊精中確實(shí)存在上述5種糖。本研究可以定量分析糊精水解出的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖的含量，可為該檢查項(xiàng)提供具體量化數(shù)據(jù)，為分析糊精中的還原成分起到了巨大作用。

糊精在《中國藥典》中的還原糖檢查項(xiàng)采用重量法，通過測(cè)得氧化亞銅殘?jiān)牧?，從而判斷糊精中還原糖總量。根據(jù)《中國藥典》中的方法，對(duì)4個(gè)廠家的6批樣品進(jìn)行檢測(cè)，遺留殘?jiān)糠謩e為6.60%、3.08%、3.88%、6.08%、9.65%和0.64%。該結(jié)果對(duì)比本研究建立的離子色譜法檢測(cè)結(jié)果可以看出，2種檢測(cè)方法得到的結(jié)果趨勢(shì)性一致，重量法檢驗(yàn)得到遺留殘?jiān)嗟墓┰嚻凡捎秒x子色譜法檢測(cè)時(shí)的測(cè)定結(jié)果也較大；另外，對(duì)比兩種方法得到的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)重量法的結(jié)果均大于離子色譜法的檢測(cè)結(jié)果，原因分析一方面是重量法得到的結(jié)果是糊精中存在的還原性物質(zhì)總量，可能會(huì)有與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)生成沉淀的其他物質(zhì)，另一方面可能是由于離子色譜法測(cè)得的結(jié)果是由葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖相加的總量，糊精中可能還存在其他還原糖或者還原性物質(zhì)。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，重量法影響結(jié)果的因素較多，如煮沸反應(yīng)時(shí)間、過濾、洗滌、干燥等步驟都可能對(duì)結(jié)果造成影響，重復(fù)性較差；而離子色譜法簡(jiǎn)單快速且專屬性較高，排除了人為操作對(duì)結(jié)果的影響。

本研究參考離子色譜?積分脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定β?環(huán)糊精中的有關(guān)物質(zhì)[7]中的色譜條件建立了檢測(cè)方法，通過試驗(yàn)表明，方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，樣品制備簡(jiǎn)單，所測(cè)成分之間的分離度良好，可準(zhǔn)確檢測(cè)糊精中不同還原糖的含量，為糊精的質(zhì)量控制提供了一個(gè)簡(jiǎn)便而有效的方法，同時(shí)也在其他高分子多糖化合物的還原糖含量測(cè)定中具有廣闊的應(yīng)用前景。