菟絲子鹽炙前后HPLC指紋圖譜的變化研究

何廣銘，曹斯瓊，周湘媛，李國(guó)衛(wèi)，潘禮業(yè)，陳向東，魏梅，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山528244）

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta aus?tr al isR.Br.或菟絲子Cuscuta chinens i sLam.的干燥成熟種子，秋季果實(shí)成熟時(shí)采收植株，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)。菟絲子味辛、甘、平，歸肝、腎、脾經(jīng)，有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉之功效[1]，為中醫(yī)補(bǔ)腎、壯陽(yáng)、固精之要藥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，菟絲子具有保肝、抗氧化、降血糖以及調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和提高免疫力等作用[3?8]，主要包括黃酮類、有機(jī)酸、甾醇類、多糖、微量元素和氨基酸等成分，其中黃酮類成分是補(bǔ)腎壯陽(yáng)的主要成分[9]。菟絲子臨床上多用炮制品，2020年版《中國(guó)藥典》收載的菟絲子炮制品為鹽菟絲子，菟絲子經(jīng)鹽炙后能夠增強(qiáng)補(bǔ)益肝腎之功效[10]。目前的研究主要集中在從菟絲子黃酮類成分的溶出能力闡明菟絲子鹽炙的機(jī)理，認(rèn)為菟絲子鹽炙后較生品的金絲桃苷、槲皮素、山柰酚等黃酮成分溶出增加明顯[11?13]。本研究通過(guò)建立HPLC指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，從整體上揭示菟絲子鹽炙前后化學(xué)成分的差異，為菟絲子和鹽菟絲子的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260 infinity高效液相色譜系統(tǒng)（包括Agilent?G1311C四元泵，Agilent?G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent?G1314F可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，安捷倫公司）；AT?330外帶柱溫箱（天津奧特賽思儀器有限公司）；CHEMSTATION C.01.04化學(xué)工作站；Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世公司）；Waters Xsclect HSS T3 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，Thermo Acclaim C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，Phe?nonmenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱；ME204E萬(wàn)分之一天平、XP26百萬(wàn)分之一天平（梅特勒?托利多公司）；KQ?500DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli?Q Direct超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

1.2 試藥

綠 原 酸（批 號(hào)：110753?201415，質(zhì) 量 分 數(shù)96.2%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521?201205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%）、異槲皮苷（批號(hào)：111809?201102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；15批菟絲子藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為旋花科植物南方菟絲子Cuscuta austr al isR.Br.的干燥成熟種子。本品為秋季果實(shí)成熟時(shí)采收植株，曬干，打下種子，除去雜質(zhì)，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 菟絲子和鹽菟絲子來(lái)源信息Table 1 Information of the Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽菟絲子的炮制

取15批經(jīng)過(guò)凈選的菟絲子藥材，參照《中國(guó)藥典》2020版四部通則0213的鹽炙法，炒至微鼓起，即得鹽菟絲子炮制品。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱定綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含40.792、48.022、45.160μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取菟絲子和鹽菟絲子粉末（過(guò)四號(hào)篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters Xselect HSS T3柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～30 min，7%～12%A；30～35 min，12%～15%A；35～55 min，15%A；55～80 min，15%～30%A；80～85 min，30%～93%A）；流 速 為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取按“2.2”項(xiàng)方法制備的菟絲子供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次，以金絲桃苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.16%，相對(duì)峰面積RSD為0.11%～0.84%，均小于1.0%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取按“2.2”項(xiàng)方法制備的菟絲子供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.04%～0.14%，相對(duì)峰面積RSD為0.04%～0.65%，均小于1.0%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批菟絲子粉末，按“2.2”項(xiàng)方法平行制備供試品溶液6份，同法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.04%～0.08%，相對(duì)峰面積RSD為0.07%～2.27%，均小于3.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 中間精密度 由另一名實(shí)驗(yàn)人員在不同的日期，取同一批菟絲子粉末，按“2.2”項(xiàng)方法平行制備供試品6份，使用不同的儀器同法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.05%～0.27%，相對(duì)峰面積RSD為0.25%～2.39%，均小于3.0%（n=12），表明方法中間精密度良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的確定 按“2.2”項(xiàng)方法分別制備15批菟絲子、15批鹽菟絲子的供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件采集指紋圖譜，并將指紋圖譜分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.130723版）軟件進(jìn)行分析，分別匹配出12個(gè)共有峰，得菟絲子藥材和鹽菟絲子的指紋圖譜共有峰模式（見(jiàn)圖1、圖2），與對(duì)照品對(duì)比指認(rèn)4號(hào)峰為綠原酸峰，9號(hào)峰為金絲桃苷峰，10號(hào)峰為異槲皮苷峰（見(jiàn)圖3）。以峰9為參照峰，分別計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，兩者共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于2%，而相對(duì)峰面積范圍分別17.35%～127.53%和13.53%～108.58%。

圖1 15批菟絲子藥材HPLC指紋圖譜共有峰模式Figure 1 The common peak mode of HPLC fingerprints of 15 batches of Cuscutae Semen

圖2 15批鹽菟絲子HPLC指紋圖譜共有峰模式Figure 2 The common peak mode of HPLC fingerprints of 15 batches of Salt Cuscutae Semen

圖3 菟絲子和鹽菟絲子對(duì)照指紋圖譜Figure 3 Reference fingerprints of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen by HPLC

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.130723版）軟件分別對(duì)15批菟絲子藥材和15批鹽菟絲子進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，與生成的對(duì)照指紋圖譜對(duì)比，除T5外，菟絲子藥材的相似度均大于0.9。鹽菟絲子與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度大于0.9。表明不同產(chǎn)地間的菟絲子藥材與鹽菟絲子飲片的指紋圖譜具有較高相似度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 15批菟絲子藥材和15批鹽菟絲子相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of similarity analysis of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

表3 15批菟絲子和鹽菟絲子的共有峰峰面積Table 3 Peak area of common peaks of 15 batches of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

2.5.3 特征峰峰面積的差異分析 由上述結(jié)果可知，鹽菟絲子與菟絲子指紋圖譜均呈現(xiàn)12個(gè)相同的共有峰，但鹽菟絲子部分色譜峰的峰面積發(fā)生明顯的變化。運(yùn)用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)菟絲子和鹽菟絲子各共有峰峰面積（見(jiàn)表3）進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，峰2、峰3、峰6、峰7、峰11在炮制前后的峰面積間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明峰2、峰3、峰6、峰7、峰11的含量在炮制后發(fā)生了明顯的變化。

表4 菟絲子和鹽菟絲子共有峰峰面積的獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果Table 4 The independent sample test result of peak area of each common peak of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

2.6 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.6.1 主成分分析（PCA）將30批樣品的12個(gè)共有指紋峰峰面積導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 21.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后作為變量進(jìn)行主成分分析，計(jì)算得到主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率，結(jié)果見(jiàn)表5；碎石圖見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)，PCA共提取3個(gè)特征值大于1的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)84.558%，因此，前3個(gè)主成分可以代表菟絲子指紋圖譜共有峰中大部分的化學(xué)信息，且碎石圖中前4個(gè)特征值的變化曲線陡峭，表明前3個(gè)主成分可以揭示引起不同批次樣品之間差異的信息[14]。成分載荷矩陣見(jiàn)表6，可見(jiàn)，第1主成分主要反映了峰9、8、4、1、10、5的信息；峰3、6、2、11、12、7在第2主成分的載荷值較高。同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)作為變量導(dǎo)入SIMCA 14.0軟件進(jìn)行PCA分析，得到得分散點(diǎn)圖見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)，菟絲子和鹽菟絲子分別分布在不同的區(qū)域，區(qū)別明顯。且未

經(jīng)過(guò)炮制的菟絲子生品離散程度大，鹽菟絲子樣品更為集中，表明經(jīng)過(guò)炮制后菟絲子中各類化學(xué)成分具有較好的一致性[15]。主成分分析結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。

2.6.2 正交最小偏二乘法分析（OPLS?DA）采用SIMCA 14.0軟件對(duì)12個(gè)共有指紋峰峰面積進(jìn)行OPLS?DA分析。所建立的模型0.907，Q2=0.871＞0.5，表明該模型可以用于菟絲子炮制前后的模式識(shí)別。通過(guò)OPLS?DA的得分散點(diǎn)圖（見(jiàn)圖6）可知，菟絲子藥材與鹽菟絲子明顯聚為2類。以VIP＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出5個(gè)差異標(biāo)志物，結(jié)果見(jiàn)圖7。對(duì)其影響顯著性排序，分別為峰3＞峰6＞峰7＞峰2＞峰11，提示這幾個(gè)化學(xué)成分對(duì)于區(qū)分炮制前后的菟絲子貢獻(xiàn)較大。OPLS?DA結(jié)果與獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)結(jié)果一致。

表5 菟絲子和鹽菟絲子主成分分析特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

表6 菟絲子和鹽菟絲子主成分分析成分載荷矩陣Table 6 Factors loading matrix of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

圖4 菟絲子和鹽菟絲子共有峰主成分分析碎石圖Figure 4 Gravel plot of principal component analysis of common peaks of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

圖5 菟絲子和鹽菟絲子共有峰主成分得分散點(diǎn)圖Figure 5 PCA Score plot of principal component analysis of common peaks of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

圖6 菟絲子和鹽菟絲子共有峰OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Figure 6 OPLS-DA Score plot of common peaks of Cuscutae Semen and Salt Cuscutae Semen

圖7 菟絲子和鹽菟絲子12個(gè)共有峰的VIP值圖Figure 7 Result of VIP about 12 common peaks of Cuscutae Se?men and Salt Cuscutae Semen

3討論

本研究比較了不同的流動(dòng)相體系、流速、柱溫下各指紋峰的分離度，結(jié)果顯示以乙腈?0.1%磷酸為流動(dòng)相，以流速為1.0 mL/min、柱溫為30℃時(shí)，圖譜中各色譜峰分離最好。同時(shí)也考察了360、282 nm兩個(gè)吸收波長(zhǎng)，兩者的吸收峰一致，但360 nm下的基線較為平穩(wěn)，所以最后選擇以360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。此外，還考察了不同提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，最后確定以70%甲醇為溶劑，水浴回流30 min作為供試品溶液的制備方法。

本研究從菟絲子及鹽菟絲子的HPLC指紋圖譜中標(biāo)識(shí)出12個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)其中的3個(gè)成分，分別為綠原酸、金絲桃苷和異槲皮苷。通過(guò)對(duì)比指紋圖譜可知，菟絲子和鹽菟絲子的色譜峰數(shù)目未呈現(xiàn)明顯的增加或減少，因此，經(jīng)過(guò)鹽炙后的菟絲子未產(chǎn)生新的化學(xué)成分或?qū)е履承┗瘜W(xué)成分的損失。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，菟絲子、鹽菟絲子均與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜的相似度較高，表明不同產(chǎn)地及炮制前后的菟絲子整體的化學(xué)成分具有較好的一致性。通過(guò)PCA和OPLS?DA分析可將菟絲子明顯區(qū)分成將鹽炙前后的2類，OPLS?DA分析篩選出5個(gè)差異標(biāo)志物，分別為峰3、峰6、峰7、峰2、峰11，且OPLS?DA結(jié)果與獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)結(jié)果一致，表明炮制前后其化學(xué)成分含量發(fā)生了顯著的變化。但對(duì)于化學(xué)成分產(chǎn)生的具體變化及是否為菟絲子鹽炙后增強(qiáng)補(bǔ)益肝腎功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。本研究所建立菟絲子的指紋圖譜及分析方法，能有效區(qū)分鹽炙后的菟絲子，為菟絲子和鹽菟絲子的質(zhì)量控制提供了新的技術(shù)手段。