溴氰菊酯對(duì)中華絨螯蟹的毒性作用和組織病理研究

張小俊，陸宏達(dá)，田全全，賈相相，任芳芳

上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海海洋大學(xué)國家水生動(dòng)物病原庫，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹，已在我國的江蘇、安徽和遼寧等地進(jìn)行養(yǎng)殖，隨著河蟹養(yǎng)殖面積的不斷擴(kuò)大和經(jīng)濟(jì)效益的不斷提高，目前已成為我國蝦蟹類主要養(yǎng)殖品種之一，規(guī)?；B(yǎng)殖過程中常出現(xiàn)病毒性、細(xì)菌性和寄生蟲性等疾病[1]，有些疾病可使用化學(xué)類藥物等進(jìn)行防治，但部分化學(xué)類藥物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有高毒性，使用不當(dāng)容易造成中毒死亡等一些不良后果[2]。溴氰菊酯(deltamethrin)又稱敵殺死，具有對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類低毒但殺蟲活性強(qiáng)的特點(diǎn)，已成為農(nóng)業(yè)和林業(yè)中廣譜性殺蟲劑[3]。其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的使用較晚，可作為漁藥用于治療魚類指環(huán)蟲(Dactylogyrusspp.)、三代蟲(Gyrodactylusspp.)、錨頭鳋(Lernaeaspp.)和中華鳋(Sinergasilusspp.)等寄生蟲病[4-5],還可通過潑灑和浸泡清塘的方法殺滅池塘中的河蟹病原螺原體(Spiroplasmaeriocheiris)，達(dá)到防控疾病的目的[6-7]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上逐漸得到普遍應(yīng)用。近幾年出現(xiàn)的河蟹水癟子病，至今病因尚未確定，推測(cè)一些藥物的使用為其病因或病因之一，王元等[8]在有關(guān)河蟹水癟子病的報(bào)道中指出使用菊酯農(nóng)藥清塘后，農(nóng)藥易被土壤吸附長期殘留在池底土壤中，底棲生活的河蟹受到土壤釋放出的菊酯農(nóng)藥長期作用，受到慢性毒性危害。觀察機(jī)體組織病理變化是衡量藥物毒性作用的方法之一[9]，但有關(guān)溴氰菊酯毒性作用引起河蟹的組織病理鮮有報(bào)道，至今為止只有溴氰菊酯對(duì)河蟹肝胰腺的組織病理的簡略報(bào)道[10]。本文通過毒性試驗(yàn)，較為全面地研究了溴氰菊酯引起河蟹的中毒癥狀和其主要組織器官鰓、肝胰腺、心臟、腸、肌肉組織和神經(jīng)團(tuán)的病理損傷作用，對(duì)比較系統(tǒng)地掌握該藥對(duì)河蟹的毒性、組織病理變化特點(diǎn)和日后采取相應(yīng)的措施減少對(duì)河蟹的損傷作用等方面具有重要的意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)河蟹和藥品

健康河蟹購于上海某河蟹養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格為體重(14.58±2.36) g，殼長(2.83±0.19) cm，暫養(yǎng)于室內(nèi)水族箱中，飼養(yǎng)水體為經(jīng)曝氣后的自來水，待河蟹適應(yīng)環(huán)境并正常攝食后，挑選活力好、四肢健全的河蟹作為實(shí)驗(yàn)河蟹。將原產(chǎn)于印度，購于常熟恒耀新材料有限公司的溴氰菊酯原藥(純度98%)，溶于丙酮配成母液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 溴氰菊酯對(duì)河蟹的急性毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別配制0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12和10.24 μg·L-1溴氰菊酯溶液進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，探討溴氰菊酯對(duì)河蟹的半致死濃度(median lethal concentrations, LC50)和安全濃度(safe concentrations, SC)，并設(shè)置與實(shí)驗(yàn)組最高濃度組相同量的丙酮溶劑作為溶劑對(duì)照組和不加任何藥物作為空白對(duì)照組，各組河蟹20只，實(shí)驗(yàn)在水體為30 L的60 cm×40 cm×30 cm塑料水族箱中進(jìn)行，自然光照，持續(xù)充氣，維持水溫20～23 ℃，pH 7.2～7.6，每隔24 h各組分別替換與原實(shí)驗(yàn)體積相同的水體，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為96 h，實(shí)驗(yàn)期間不投食。分別在24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)統(tǒng)計(jì)河蟹死亡數(shù)，判斷死亡方法為玻璃棒觸碰河蟹眼無任何反應(yīng)，死亡河蟹及時(shí)撈出，并從試驗(yàn)開始起對(duì)河蟹行為、中毒癥狀和死亡數(shù)進(jìn)行觀察和記錄。

1.3 溴氰菊酯慢性毒性作用下河蟹的組織病理研究

根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16和0.32 μg·L-1溴氰菊酯溶液進(jìn)行慢性毒性實(shí)驗(yàn)，探討溴氰菊酯對(duì)河蟹組織病理等的影響，并設(shè)置與慢性毒性實(shí)驗(yàn)組最高濃度組相同量的丙酮溶劑作為溶劑對(duì)照組和不加任何藥物作為空白對(duì)照組，每組河蟹25只，每天定時(shí)投喂適量的河蟹顆粒飼料，每隔24 h各組分別替換與原實(shí)驗(yàn)體積相同的水體，同時(shí)清除殘餌，其他實(shí)驗(yàn)條件與急性毒性實(shí)驗(yàn)相同。實(shí)驗(yàn)第7、14、21天時(shí)，分別隨機(jī)采集各濃度組中5只河蟹，立即取鰓、肝胰腺、心臟、腸、肌肉組織和位于胸腔中央靠近胸甲處的神經(jīng)團(tuán)于波恩氏液中固定，24 h后用70%酒精沖洗并保存?zhèn)溆谩＝?jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4～5 μm組織切片，蘇木精和伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，在帶有NIS-Elements F 4.0軟件的Nikon Eclipse 55i顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。根據(jù)組織病理嚴(yán)重程度的觀察結(jié)果，將21 d實(shí)驗(yàn)期內(nèi)溴氰菊酯對(duì)河蟹組織器官造成的組織病理變化劃分為病變前期、中期和后期。實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的臨死河蟹進(jìn)行相同的組織病理觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Probit回歸分析，以溴氰菊酯濃度對(duì)數(shù)為自變量x，以相應(yīng)濃度下河蟹死亡百分率的概率值為因變量y建立擬回歸方程，分別計(jì)算出24 h、48 h、72 h和96 h LC50、95%置信區(qū)間和可決系數(shù)(R2)。采用公式SC = 96 h-LC50× 0.1[11]計(jì)算溴氰菊酯對(duì)河蟹的安全濃度。

2 結(jié)果(Results)

2.1 溴氰菊酯的毒性作用

2.1.1 急性毒性和慢性毒性作用

溴氰菊酯急性暴露引起河蟹累積死亡見表1，除0.16 μg·L-1組在72 h時(shí)才出現(xiàn)死亡外，其他各實(shí)驗(yàn)組在24 h時(shí)起均出現(xiàn)不同程度的死亡，隨著溴氰菊酯濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，河蟹累積死亡數(shù)和累積死亡率均出現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)過程中均無河蟹死亡現(xiàn)象。

溴氰菊酯對(duì)河蟹的LC50和SC見表2，由概率單位法分別得到24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)的y與x的擬回歸方程，它們的R2都在0.97以上，溴氰菊酯溴氰菊酯慢性毒性引起河蟹累積死亡見表3。0.04 μg·L-1以下濃度組、丙酮對(duì)照組和空白對(duì)照組在21 d的實(shí)驗(yàn)過程中均沒有出現(xiàn)河蟹死亡現(xiàn)象，0.08 μg·L-1組只在實(shí)驗(yàn)的第14天時(shí)出現(xiàn)1只河蟹死亡，0.16 μg·L-1組和0.32 μg·L-1組在第7、14和21天時(shí)均有河蟹死亡，最高累積死亡率達(dá)36%。

表1 溴氰菊酯急性毒性作用下的河蟹累積死亡數(shù)和死亡率Table 1 Cumulative death and mortality of crab under the acute exposure of deltamethrin

表2 溴氰菊酯對(duì)河蟹的半致死濃度和安全濃度Table 2 The median lethal concentrations (LC50) and safe concentrations (SC) of deltamethrin on crab

濃度對(duì)數(shù)與死亡率概率單位之間高度相關(guān)，溴氰菊酯對(duì)河蟹的24 h、48 h、72 h和96 h LC50分別為2.127 μg·L-1、1.380 μg·L-1、1.153 μg·L-1和0.905 μg·L-1，它們分別分布在各自的95%置信區(qū)間，對(duì)河蟹的SC為0.0905 μg·L-1。

2.1.2 急性和慢性中毒癥狀

急性毒性試驗(yàn)中的河蟹中毒癥狀主要表現(xiàn)為：開始時(shí)河蟹出現(xiàn)不安的狀態(tài)，爬動(dòng)加快，有沿水族箱側(cè)壁向上爬動(dòng)等避開藥浴水體的行為，隨著藥浴時(shí)間的延長，部分河蟹四處亂竄，河蟹步足出現(xiàn)微顫現(xiàn)象，進(jìn)一步發(fā)展河蟹出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，爬動(dòng)能力下降，步足逐漸僵硬僵直，互相團(tuán)抱等現(xiàn)象(圖1-1)，臨死時(shí)所有的步足撐起而靜止不動(dòng)(圖1-2)，只有眼能微動(dòng)，死亡河蟹腹臍略張開，用玻璃棒觸碰眼無反應(yīng)。急性毒性試驗(yàn)中0.16 μg·L-1至10.24 μg·L-1各組河蟹都會(huì)出現(xiàn)這些不同程度的癥狀，只是出現(xiàn)相同癥狀的時(shí)間有差異，溴氰菊酯濃度越高，河蟹出現(xiàn)相同癥狀和死亡越早，同一濃度組中河蟹的死亡時(shí)間有一定的差異。最早出現(xiàn)死亡河蟹是在用藥后80 min時(shí)的10.24 μg·L-1濃度組。

表3 溴氰菊酯慢性毒性作用下的河蟹累積死亡數(shù)和死亡率Table 3 Cumulative death and mortality of crab under the chronic exposure of deltamethrin

慢性毒性試驗(yàn)過程中，0.005 μg·L-1組河蟹在整個(gè)試驗(yàn)過程中無明顯的癥狀表現(xiàn)，0.01～0.08 μg·L-1各組只出現(xiàn)爬動(dòng)異常，有避開藥浴水體行為等一些輕微中毒癥狀。0.16 μg·L-1、0.32 μg·L-1兩組中毒癥狀與急性中毒癥狀相似，少數(shù)河蟹出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，0.08 μg·L-1、0.16 μg·L-1和0.32 μg·L-1組分別于20 d、13 d、11 d時(shí)出現(xiàn)部分河蟹不攝食現(xiàn)象。無論急性毒性試驗(yàn)還是慢性毒性試驗(yàn)，丙酮和空白對(duì)照組的河蟹在實(shí)驗(yàn)過程中均無異?，F(xiàn)象。

2.2 溴氰菊酯對(duì)河蟹各組織的病理損傷

經(jīng)對(duì)慢性毒性試驗(yàn)不同濃度組和不同時(shí)間點(diǎn)的河蟹各組織器官的組織病理觀察，將出現(xiàn)組織病理變化的組織劃分為病變前期、中期和后期。

2.2.1 鰓組織病理變化

河蟹每條鰓由鰓軸和向兩邊發(fā)出的層層鰓葉組成，鰓葉最外側(cè)是角質(zhì)層，內(nèi)側(cè)是單層上皮細(xì)胞，與柱狀細(xì)胞一起形成血淋巴液循環(huán)的鰓腔[12-13]。

鰓病變前期：部分鰓小葉出現(xiàn)腫大，鰓腔膨大，部分區(qū)域厚度是健康鰓小葉1倍以上，出現(xiàn)許多從鰓腔中滲出的嗜伊紅性滲出物，鰓小葉不同區(qū)域滲出物的滲出量不同，分布在鰓小葉之間(圖1-3)。病變中期：鰓小葉間滲出物在有些區(qū)域進(jìn)一步增加，腫大的鰓開始出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，鰓腔縮小，鰓小葉厚度小于正常的鰓小葉，但鰓小葉鰓腔兩側(cè)的扁平上皮細(xì)胞層還沒有完全閉合，少量鰓腔內(nèi)出現(xiàn)嗜伊紅性的濃染物質(zhì)，這些區(qū)域扁平上皮細(xì)胞及柱狀細(xì)胞細(xì)胞核輕微固縮(圖1-4)。病變后期：鰓腔進(jìn)一步縮小，部分鰓小葉鰓腔兩側(cè)的扁平上皮細(xì)胞閉合在一起，鰓小葉的鰓腔消失，較為嚴(yán)重的區(qū)域大部分鰓腔閉合，已失去鰓小葉的鰓腔結(jié)構(gòu)，這些區(qū)域扁平上皮細(xì)胞及柱狀細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)濃染固縮等細(xì)胞壞死現(xiàn)象，沒有閉合的鰓腔內(nèi)出現(xiàn)嗜伊紅性的濃染物質(zhì)(圖1-5)。實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，0.005 μg·L-1組鰓組織未發(fā)生明顯病理變化；從0.01 μg·L-1組起鰓出現(xiàn)前期的病理變化，0.01 μg·L-1組只有少量的鰓小葉出現(xiàn)腫大，0.04 μg·L-1組腫大更為嚴(yán)重，鰓小葉之間出現(xiàn)更多的滲出物；0.08 μg·L-1及以上各組均出現(xiàn)中期病理變化，0.08 μg·L-1組部分鰓腔開始出現(xiàn)萎縮，0.32 μg·L-1組更多的鰓腔萎縮并出現(xiàn)嗜伊紅物質(zhì)，但鰓腔尚未出現(xiàn)閉合。14 d時(shí)，0.02 μg·L-1及以下各組鰓處于前期的病理變化，鰓腔不同程度地出現(xiàn)腫大現(xiàn)象；從0.04 μg·L-1組至0.16 μg·L-1組鰓出現(xiàn)中期的病理變化，鰓小葉出現(xiàn)萎縮，其中0.08 μg·L-1組鰓腔出現(xiàn)少量嗜伊紅物質(zhì)；0.32 μg·L-1組處于后期的病理變化，部分鰓腔兩側(cè)上皮細(xì)胞閉合在一起，鰓腔消失。21 d時(shí)，0.005 μg·L-1濃度組的鰓小葉處于病變前期，多數(shù)鰓小葉鰓腔腫大；0.01 μg·L-1至0.04 μg·L-1各組鰓小葉處于病變中期，鰓小葉鰓腔萎縮程度進(jìn)一步加大，且鰓腔出現(xiàn)少量強(qiáng)嗜伊紅性物質(zhì)；0.08 μg·L-1及以上各組鰓出現(xiàn)后期的病理變化，但鰓小葉鰓腔萎縮閉合的區(qū)域面積不同，濃度越高閉合的區(qū)域越大，出現(xiàn)更多的壞死細(xì)胞，尚未完全閉合的鰓腔內(nèi)出現(xiàn)嗜伊紅性物質(zhì)。臨死的河蟹鰓病變程度都處于病變后期。

圖1 河蟹中毒癥狀以及鰓和肝胰腺組織病理注：1. 中毒河蟹相互抱團(tuán)在一起；2. 中毒河蟹步足僵直撐起；3. 病變前期，鰓腔膨大()，鰓小葉之間出現(xiàn)滲出物()，HE；4. 病變中期， 鰓腔萎縮()，腔內(nèi)出現(xiàn)嗜伊紅濃染物質(zhì)()，滲出物增多()，HE；5. 病變后期，大部分鰓腔完全閉合()，核固縮()和未閉合的鰓腔中出現(xiàn)嗜伊紅濃染物質(zhì)()，HE；6. 病變前期，部分肝胰腺管中肝胰腺細(xì)胞出現(xiàn)空泡()，肝胰腺管腔內(nèi)出現(xiàn)較多的分泌物()，HE；7. 病變中期，部分肝胰腺管中個(gè)別肝胰腺細(xì)胞開始出現(xiàn)壞死()，管腔內(nèi)分泌物進(jìn)一步增加()，HE；8. 病變后期，部分肝胰腺管中較多肝胰腺細(xì)胞壞死崩解()，但基膜尚完整()，HE；9. 病變后期，部分肝胰腺管中全部肝胰腺細(xì)胞壞死崩解，成一片無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)()，基膜崩解消失()，HE。Fig. 1 Poisoning symptoms and histopathology of gill and hepatopancreasNote: 1.Poisoning crabs gathered together; 2. Pereiopods of crab were spastic; 3. In the early lesion, enlarged gill cavities (), exudation () between secondary lamellae, HE; 4. In the middle lesion, gill cavities atrophied () and eosinophilic materials (), increased excretions (), HE; 5. In the late lesion, gill cavities were completely closed (), karyopyknosis () and eosinophilic materials () in the unclosed gill cavities, HE. 6. In the early lesion, hepatopancreatic cells appeared vacuoles (), and more excretions appeared in hepatopancreatic ducts (), HE; 7. In the middle lesion, necrotic hepatopancreatic cells (), increased excretions in ducts (), HE; 8. In the late lesion, more necrotic hepatopancreatic cells (), intact basement membrane (), HE; 9. In the late lesion, all hepatopancreatic cells were necrosed to be unstructured materials (), and the basement membrane disintegrated and disappeared (), HE.

2.2.2 肝胰腺組織病理變化

肝胰腺由大量排列緊密的肝胰腺管和少量管間的結(jié)締組織組成，肝胰腺管外緊貼著一層基膜，膜內(nèi)有纖維細(xì)胞，核橢圓形或圓形，1～2個(gè)核仁；管內(nèi)有4種肝細(xì)胞組成，分別是胚細(xì)胞(E細(xì)胞)、泡狀細(xì)胞(B細(xì)胞)、纖維細(xì)胞(F細(xì)胞)和吸收細(xì)胞(R細(xì)胞)[13]。

圖2 心臟和腸組織病理注：1. 病變前期，心臟出現(xiàn)水腫，心肌纖維之間間隙增大()，但心肌纖維橫紋清晰()，HE；2. 病變中期，部分心肌纖維橫紋模糊()， 逐漸消失，核輕微固縮()，HE；3. 病變后期，局部壞死的心肌纖維消失成一片無結(jié)構(gòu)物質(zhì)，呈強(qiáng)嗜伊紅性()，核固縮()，HE； 4. 病變前期，腸黏膜層部分柱狀上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性()，HE；5. 病變中期，少量柱狀上皮細(xì)胞細(xì)胞膜破裂消失()， 開始出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，HE；6. 病變后期，較多上皮細(xì)胞壞死崩解成一片無結(jié)構(gòu)物質(zhì)()，與殘存的細(xì)胞核()一起脫落入腸腔，HE。Fig. 2 Histopathology of heart and intestineNote: 1.In the early lesion, heart appeared edema, the gaps between the myocardial fibers increased (), but the transverse lines of the myocardial fibers were clear (), HE; 2. In the middle lesion, some of the myocardial fibers were blurred (), and gradually disappeared, slight karyopyknosis (), HE; 3. In the late lesion, necrotic myocardial fibers became into an unstructured, strongly eosinophilic materials (), karyopyknosis (), HE; 4. In the early lesion, some epithelial cells in the intestinal mucosa showed vacuolar degeneration (), HE; 5. In the middle lesion, membrane of a small amount of necrotic epithelial cells disappeared (), HE; 6. In the late lesion, more necrotic epithelial cells becoming unstructured materials () with the remaining nuclei () that fell into the intestinal duct, HE.

病變前期：部分肝胰腺管中肝胰腺細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的空泡變性，變性嚴(yán)重的細(xì)胞空泡數(shù)量和體積都有所增加，肝胰腺管的管腔內(nèi)分泌物增多(圖1-6)。病變中期：部分區(qū)域肝胰腺管中的少量肝胰腺細(xì)胞出現(xiàn)壞死崩解，壞死的肝胰腺細(xì)胞和細(xì)胞核脫離基膜，失去應(yīng)有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，肝胰腺管管腔內(nèi)分泌物進(jìn)一步增多(圖1-7)。病變后期：部分區(qū)域肝胰腺管中的肝胰腺細(xì)胞壞死進(jìn)一步加劇，較多的肝胰腺細(xì)胞出現(xiàn)壞死崩解現(xiàn)象，但肝胰腺管的基膜還存在，基膜不呈現(xiàn)鋸齒狀的皺縮現(xiàn)象(圖1-8)，少量嚴(yán)重病變的肝胰腺管，所有肝胰腺細(xì)胞全部崩解壞死，細(xì)胞核也崩解消失，成一片無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，肝胰腺管的基膜崩解消失(圖1-9)。實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，0.005 μg·L-1組肝胰腺組織和健康對(duì)照組無差異；0.01 μg·L-1及以上各組均為病變前期，0.01 μg·L-1組少數(shù)肝胰腺細(xì)胞開始出現(xiàn)空泡變性，隨著濃度的增加，空泡增大，數(shù)量增多，呈現(xiàn)進(jìn)一步加劇現(xiàn)象。14 d時(shí)，0.005 μg·L-1及以上各組均為中期，少數(shù)肝胰腺管內(nèi)的個(gè)別肝胰腺細(xì)胞出現(xiàn)崩解壞死現(xiàn)象。21 d時(shí)，0.005 μg·L-1組至0.04 μg·L-1組為中期，濃度越高的組，相對(duì)病變程度略有加?。?.08 μg·L-1及以上各組均為后期，隨著濃度增加，部分肝胰腺管中壞死崩解的肝胰腺細(xì)胞增多，部分病變嚴(yán)重的肝胰腺管中肝胰腺細(xì)胞全部壞死崩解，基膜也出現(xiàn)崩解消失現(xiàn)象。臨死河蟹的肝胰腺病變程度都處于病變后期。

2.2.3 心臟組織病理變化

心臟分為心外膜、心內(nèi)膜和心肌層三層結(jié)構(gòu)，心外膜和心內(nèi)膜主要由結(jié)締組織構(gòu)成，而較厚的心肌層有結(jié)締組織和大量的心肌纖維，心肌纖維有分支，整齊而松散地排列，為橫紋肌，其核橢圓形，位于肌膜邊緣[13]。

病變前期：心臟部分區(qū)域出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，心肌纖維之間間隙增大，但這些水腫部位的心肌纖維橫紋清晰，心肌纖維和核無異常現(xiàn)象(圖2-1)。病變中期：水腫區(qū)域部分心肌纖維橫紋逐漸模糊不清，但尚未消失，細(xì)胞核有輕微的固縮現(xiàn)象(圖2-2)。病變后期：病變進(jìn)一步發(fā)展，部分心肌纖維橫紋消失，心肌纖維出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，壞死的心肌纖維呈強(qiáng)嗜伊紅性，成一片無結(jié)構(gòu)物質(zhì)，細(xì)胞核固縮(圖2-3)。實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，0.005～0.08 μg·L-1各組心臟組織無病理變化；0.16 μg·L-1以上的濃度組心臟處于前期的病理變化，局部心肌纖維出現(xiàn)水腫現(xiàn)象。14 d時(shí)，0.005 μg·L-1及以上各組為前期病理變化，濃度越高,水腫現(xiàn)象越嚴(yán)重，但橫紋仍清晰。21 d時(shí)，0.04 μg·L-1及以下各組為前期病理變化，0.08 μg·L-1組和0.16 μg·L-1組表現(xiàn)為病變中期，部分心肌纖維橫紋模糊不清；0.32 μg·L-1濃度組和臨死的河蟹心臟病變均為后期病理變化，部分心肌纖維出現(xiàn)橫紋消失和壞死。

2.2.4 腸組織病理變化

河蟹腸結(jié)構(gòu)從內(nèi)到外由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜四部分組成，單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成黏膜層，胞核位于基部，黏膜下層和肌層不發(fā)達(dá)，較薄，外膜為漿膜，由疏松結(jié)締組織構(gòu)成[14]。

腸病理變化主要發(fā)生在腸的黏膜層，病變前期：部分腸黏膜層柱狀上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性現(xiàn)象(圖2-4)。病變中期：黏膜層少數(shù)上皮細(xì)胞細(xì)胞膜破裂崩解，出現(xiàn)壞死現(xiàn)象(圖2-5)。病變后期：黏膜層上皮細(xì)胞壞死程度進(jìn)一步加劇，較多上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，壞死崩解的細(xì)胞脫落進(jìn)入腸腔(圖2-6)。實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，0.005～0.32 μg·L-1各組的腸組織未發(fā)生病理變化。14 d時(shí)，0.08 μg·L-1以下濃度各組未出現(xiàn)病變；0.16 μg·L-1組和0.32 μg·L-1組腸處于病變前期，黏膜層上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。21 d時(shí)，0.005 μg·L-1至0.02 μg·L-1各組未見明顯病理性變化；0.04 μg·L-1組出現(xiàn)空泡變性的病變前期；0.08 μg·L-1和0.16 μg·L-1組為中期病變，少數(shù)上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死；0.32 μg·L-1組和臨死河蟹的腸均為后期病變，較多的黏膜層上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死崩解脫落入腸腔。

2.2.5 肌肉和神經(jīng)團(tuán)

不同溴氰菊酯濃度下河蟹的肌肉和神經(jīng)團(tuán)均未發(fā)生組織病理變化，肌肉組織中的肌纖維橫紋清晰，無變性和壞死病理現(xiàn)象，神經(jīng)團(tuán)中的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿中尼氏小體未出現(xiàn)異常。

3 討論(Discussion)

3.1 溴氰菊酯對(duì)養(yǎng)殖水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的急性毒性

養(yǎng)殖的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物包括高等的脊椎動(dòng)物魚類和低等的無脊椎動(dòng)物蝦蟹類，溴氰菊酯對(duì)不同種類水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物毒性存在很大的差異，溴氰菊酯對(duì)脊椎動(dòng)物魚類鯽魚(Carassiusauratus)的96 h-LC50為15.00 μg·L-1 [15]、羅非魚(Oreochromisniloticus)為14.50 μg·L-1 [16]、花鰻鱺(Anguillamarmorata)為7.67 μg·L-1 [17]、淡水鯰魚(Clariasgariepinus)為4.00 μg·L-1 [18]和鏡鯉(Cyprinuscarpio)為1.65 μg·L-1 [19]，而對(duì)無脊椎動(dòng)物甲殼類遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunuspelagicus)為0.11 μg·L-1、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)0.143 μg·L-1 [20]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)為0.0562 μg·L-1 [21]，本實(shí)驗(yàn)溴氰菊酯對(duì)河蟹的96 h-LC50為0.905 μg·L-1，根據(jù)農(nóng)藥對(duì)魚類的毒性分級(jí)：LC50≤0.1 mg·L-1為劇毒、0.110.0 mg·L-1為低毒[22]，溴氰菊酯對(duì)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物魚類和蝦蟹類均為劇毒，但對(duì)蝦蟹類毒性遠(yuǎn)高于對(duì)魚類的毒性。對(duì)同種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的毒性強(qiáng)弱，動(dòng)物大小是主要因素之一，溴氰菊酯對(duì)平均體重66.6 g和8.21 g的草魚的96 h-LC50分別為4.26 μg·L-1和2.16 μg·L-1 [23]，對(duì)平均體重4.1 g的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的96 h-LC50為20 μg·L-1 [24]和體重1.9～2.5 g的虹鱒的96 h-LC50為0.6961 μg·L-1 [25]。耿雪冰等[26]對(duì)河蟹的急性毒性報(bào)道中，由于應(yīng)用的安全濃度計(jì)算公式等有誤，數(shù)據(jù)不可靠。此外，目前只有對(duì)平均體重114.04 g的河蟹的96 h-LC50為1.3195 μg·L-1的報(bào)道[10]，本實(shí)驗(yàn)平均體重14.04 g的河蟹的96 h-LC50為0.905 μg·L-1，毒性較文獻(xiàn)報(bào)道的大。因此，溴氰菊酯對(duì)同種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的毒性表現(xiàn)為個(gè)體越小毒性越大，毒性與同種水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物大小成反比關(guān)系。

3.2 溴氰菊酯對(duì)河蟹的組織損傷

溴氰菊酯對(duì)河蟹的組織損傷主要表現(xiàn)在鰓、肝胰腺、心臟和腸等組織器官，而對(duì)肌肉和神經(jīng)團(tuán)沒有組織損傷的病理變化現(xiàn)象。組織病理變化是個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，為了更好地反映損傷程度，根據(jù)組織器官的損傷嚴(yán)重程度，分別將出現(xiàn)病理變化的組織器官劃分為病變初期、中期和后期，但同一溴氰菊酯濃度組中河蟹病理變化不是完全同步的，其組織器官會(huì)出現(xiàn)相鄰病變時(shí)期的組織病理，相同病變時(shí)期內(nèi)也會(huì)存在病變面積等不同的損傷程度。在溴氰菊酯藥浴第7天，除無病理變化的溴氰菊酯濃度組外，其他所有溴氰菊酯濃度組的組織病理變化主要是水腫或空泡變性，這些病理變化是可逆的病理過程[27]，此時(shí)消除溴氰菊酯的藥浴作用后，河蟹可以從這樣的輕度毒性作用中完全恢復(fù)。最早出現(xiàn)壞死的不可逆病理變化是在第14天的0.005 μg·L-1組，肝胰腺細(xì)胞壞死，即使此時(shí)消除溴氰菊酯的藥浴作用，河蟹壞死組織已不能恢復(fù)，隨著溴氰菊酯藥浴濃度和時(shí)間的增加，壞死的組織器官增多，壞死細(xì)胞數(shù)量增加，影響組織器官的功能，最終可導(dǎo)致河蟹死亡。

擬除蟲菊酯類具有高親脂性，魚鰓對(duì)其具有高吸收率，對(duì)魚的毒性作用較為強(qiáng)烈[28]，溴氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類，具有類似的特性，溴氰菊酯對(duì)食蚊魚(Gambusiaaffinis)鰓的毒性作用主要為引起鰓小片上皮細(xì)胞肥大、增生和鰓小片融合，進(jìn)一步發(fā)展造成壞死，鰓毛細(xì)血管擴(kuò)張成動(dòng)脈瘤的病理變化[29]。由于河蟹鰓與魚鰓組織結(jié)構(gòu)等方面不完全相同，溴氰菊酯對(duì)河蟹鰓的組織病理存在一定的差異性，河蟹鰓病理變化主要表現(xiàn)為鰓腫大，鰓腔增大，出現(xiàn)大量分泌物后鰓腔萎縮至閉合，上皮細(xì)胞壞死。在水環(huán)境生活的河蟹，其鰓是水體中外源物的第一靶器官，水體中的溴氰菊酯藥物最先接觸到的是鰓組織，甲殼類鰓功能之一是進(jìn)行離子運(yùn)輸調(diào)節(jié)維持體內(nèi)滲透壓穩(wěn)定，由鰓表面的上皮組織完成[30]，在溴氰菊酯的作用下，河蟹鰓失去調(diào)節(jié)維持滲透壓應(yīng)有的功能，鰓腔外的水分進(jìn)入鰓腔，而出現(xiàn)鰓腫大，鰓腔膨大，隨著溴氰菊酯濃度和作用時(shí)間的增加，上皮細(xì)胞進(jìn)一步受損，鰓腔內(nèi)的物質(zhì)滲出，滲出物逐漸增多，使得鰓腔逐漸縮小，腔中物質(zhì)濃縮而逐漸呈現(xiàn)強(qiáng)嗜伊紅性，上皮細(xì)胞壞死的病理變化。鰓另一個(gè)主要功能是呼吸作用，水流通過鰓小葉上皮細(xì)胞進(jìn)行氧氣的交換，河蟹鰓水腫和分泌物增多等輕度病理變化可影響鰓的呼吸，鰓腔閉合和上皮細(xì)胞壞死等重度病理變化可導(dǎo)致鰓無法呼吸危及生命。

相對(duì)其他擬除蟲菊酯類，溴氰菊酯由于在魚體內(nèi)不能完全代謝而不能快速解毒，會(huì)在魚體內(nèi)殘留，尤其在脂肪組織中最易積累和殘留，因此它對(duì)魚類是高毒性的[31]，河蟹肝胰腺由密集排列的肝胰腺管構(gòu)成，肝胰腺管由單層肝胰腺細(xì)胞組成，河蟹肝胰腺是脂類儲(chǔ)存器官[32]，本實(shí)驗(yàn)的溴氰菊酯同樣可在河蟹肝胰腺細(xì)胞中積累和殘留，最終超出其自身機(jī)體的保護(hù)和解毒能力，從而對(duì)肝胰腺細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，在溴氰菊酯不同藥浴時(shí)間和不同濃度作用下，河蟹肝胰腺產(chǎn)生不同程度的病理變化，影響肝胰腺的營養(yǎng)調(diào)控等其他代謝功能。溴氰菊酯對(duì)食蚊魚肝臟影響主要為肝細(xì)胞肥大，核固縮、脂肪變性，局部壞死的組織病理變化[29]，由于魚肝臟與河蟹肝胰腺在組織結(jié)構(gòu)上的差別，出現(xiàn)的病理變化也存在差異。

溴氰菊酯通過影響心臟的Na+通道，使虹鱒魚心臟心力衰竭和心律不齊，對(duì)心臟產(chǎn)生毒性作用[33]，溴氰菊酯作用下河蟹心臟的心肌纖維出現(xiàn)水腫到心肌纖維橫紋模糊，最后出現(xiàn)部分心肌纖維橫紋消失和壞死，這些不同程度的組織病理變化，可使其心臟心力衰竭，影響河蟹心律調(diào)節(jié)等功能，可導(dǎo)致河蟹血淋巴液循環(huán)障礙。

在21 d的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，一定量的溴氰菊酯可通過河蟹口和胃進(jìn)入腸道，對(duì)河蟹腸道產(chǎn)生損傷作用，病理變化主要出現(xiàn)在由單層柱狀上皮細(xì)胞組成的黏膜層，上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，到少量上皮細(xì)胞壞死和較多壞死細(xì)胞脫落進(jìn)入腸腔的過程，這些病理變化與溴氰菊酯引起食蚊魚腸道的組織病理變化有差別，溴氰菊酯藥浴后食蚊魚腸道主要表現(xiàn)為單核白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，在0.50 μg·L-1溴氰菊酯濃度下藥浴30 d時(shí)食蚊魚腸黏膜層才出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死現(xiàn)象[29]。河蟹腸的損傷影響其對(duì)食物攝入、消化和吸收，這與0.08、0.16、0.32 μg·L-1各濃度組的河蟹在毒性實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)不攝食的癥狀相吻合。

近幾年，江蘇興化等周邊地區(qū)養(yǎng)殖的河蟹大面積暴發(fā)了水癟子病，河蟹水癟子病的組織病理變化[13]與本實(shí)驗(yàn)溴氰菊酯引起的河蟹組織病理變化有較大的區(qū)別。首先除心臟病變相似外，兩者肝胰腺和鰓組織病理變化不同，水癟子病的肝胰腺以肝胰腺管萎縮和肝胰腺細(xì)胞壞死后肝胰腺管基膜出現(xiàn)皺縮呈波浪狀為主的病理變化，尤其到疾病后期肝胰腺萎縮和壞死，肝胰腺細(xì)胞大量減少，而溴氰菊酯作用下只有少量肝胰腺管壞死，壞死的肝胰腺管無基膜皺縮現(xiàn)象，水癟子病的河蟹鰓無明顯的滲出現(xiàn)象，溴氰菊酯作用下河蟹鰓出現(xiàn)大量滲出物并逐漸增多。其次水癟子病河蟹肌肉組織有嚴(yán)重壞死的病理變化，無腸的病變，而溴氰菊酯作用下的河蟹相反，無肌肉組織的病變，而腸出現(xiàn)腸黏膜層上皮細(xì)胞從變性到壞死的現(xiàn)象。因此水癟子病的組織病理與溴氰菊酯引起的組織病理有很大不同，具有各自的特點(diǎn)，從組織病理學(xué)的角度推測(cè)水癟子病的病因與溴氰菊酯不相關(guān)或不完全相關(guān)，但水癟子病病程較長，一般有2～3個(gè)月以上[34]，而本試驗(yàn)中溴氰菊酯引起的組織病理變化是藥物作用21 d的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更長時(shí)間的藥物作用是否會(huì)出現(xiàn)與水癟子病相同的病理變化，有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。