甜蕎資源萌發(fā)期耐旱性鑒定體系建立與種質(zhì)篩選

侯澤豪，盧奕霏，孫坤坤，王書平，張迎新，劉志雄，方正武

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 荊州 434025；2.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

蕎麥屬廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrumspp.)，是一年生或多年生的重要經(jīng)濟(jì)作物，有甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtataricumGaertn)2個(gè)栽培種[1]，是重要的藥食兼用作物。蕎麥廣泛種植于中國(guó)、俄羅斯、歐洲和北美的高海拔地區(qū)[2]。在中國(guó)，蕎麥主要分布于北部和中西部地區(qū)，特別是云貴高原﹑川西以及西北地區(qū)的高海拔地帶[3]。由于這些地區(qū)水資源短缺，土壤干旱極易導(dǎo)致蕎麥種植區(qū)季節(jié)性缺水，尤其播種時(shí)的干旱嚴(yán)重影響了蕎麥生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成[4]，培育具有耐/抗旱的品種是應(yīng)對(duì)干旱氣候最為有效和經(jīng)濟(jì)的途徑之一[5]，鑒定與篩選具有耐/抗旱性的種質(zhì)資源則是其前提與基礎(chǔ)[6]。蕎麥的耐旱性鑒定缺乏規(guī)范的鑒定體系[7]，且對(duì)于不同來(lái)源或不同生境下的蕎麥種質(zhì)資源的抗旱性評(píng)價(jià)報(bào)道較少。

聚乙二醇(PEG)作為一種高分子滲透劑，用于模擬干旱脅迫可達(dá)到與土壤控水相同的效果[8]，具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短和重復(fù)性好等特點(diǎn)[9]，因此，PEG模擬干旱脅迫已成為農(nóng)作物、林木、蔬菜和花卉等植物早期抗/耐旱性的重要方法之一[10-11]。植物種子萌發(fā)期是感應(yīng)外界環(huán)境改變的最初階段，這一階段的耐旱情況可直接或者間接反映植物耐旱性的強(qiáng)弱[12]，但由于植物的耐旱性是諸多因子相互作用和影響的結(jié)果，受形態(tài)、解剖和生理生化特性等控制[13]，且在不同植物和同一植物的不同品種之間，由于遺傳背景、發(fā)育階段的代謝特征及生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境等造成的差異，使得植物體內(nèi)的生理生化特征也處于一個(gè)多變狀態(tài)[14]。因此，采用多指標(biāo)，并結(jié)合聚類分析、主成分分析、灰度關(guān)聯(lián)和隸屬函數(shù)等進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，能有效提高鑒定的準(zhǔn)確性[15]，在小黑麥[16-17]、玉米[18]、花椰菜[19]和苜蓿[20]等種質(zhì)資源萌發(fā)期耐旱種質(zhì)篩選中得到廣泛應(yīng)用。

本研究采用PEG6000高滲溶液模擬干旱脅迫的方式，對(duì)80份不同來(lái)源的甜蕎種質(zhì)資源進(jìn)行耐旱性鑒定，旨在建立蕎麥萌發(fā)期耐旱性鑒定和分級(jí)體系，篩選耐旱性強(qiáng)的蕎麥種質(zhì)資源，為蕎麥耐旱新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為課題組征集并保存的來(lái)自全國(guó)各地的80份甜蕎種質(zhì)材料，材料編號(hào)及來(lái)源見表1，其中地方種質(zhì)資源34份，育成品種46份。

表1 參試甜蕎種質(zhì)資源名稱及來(lái)源Table 1 Information of the tested common buckwheat germplasm resources

1.2 甜蕎萌發(fā)期耐旱鑒定體系建立

為明確模擬干旱脅迫的最適PEG6000體積分?jǐn)?shù)，選取7個(gè)已報(bào)道[7,21]的不同耐旱性的種質(zhì)資源進(jìn)行萌發(fā)期耐旱鑒定體系建立初步摸索，材料信息見表2。

表2 萌發(fā)期耐旱鑒定體系建立供試材料及耐旱性等級(jí)Table 2 Information of 7 common buckwheat for establishment of buckwheat drought tolerance identification system

萌發(fā)期耐旱鑒定體系設(shè)置10%、20%、25%和30%PEG6000溶液共4個(gè)體積分?jǐn)?shù)水平，以蒸餾水為對(duì)照，共5個(gè)處理。每個(gè)處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)處理50粒種子。參考《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[22]進(jìn)行蕎麥種子的干旱脅迫萌發(fā)試驗(yàn)。選取顆粒飽滿，大小一致的蕎麥種子，經(jīng)0.1% HgCl2溶液消毒10 min后，使用無(wú)菌水沖洗數(shù)次直至將HgCl2殘余沖洗干凈后，置于鋪有兩層濾紙發(fā)芽床的種子發(fā)芽盒(13 cm×19 cm×12 cm)中，以濾紙充分濕潤(rùn)為標(biāo)準(zhǔn)加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)水平的PEG6000溶液。于人工氣候箱(JYC-412，上海佳語(yǔ)科學(xué)儀器有限公司)中進(jìn)行恒溫恒濕培養(yǎng)：參數(shù)設(shè)置為溫度25℃，濕度60%，12 h光照/12 h黑暗。每天添加適量體積的無(wú)菌水以維持PEG6000溶液的體積分?jǐn)?shù)恒定。

1.3 甜蕎種質(zhì)資源的耐旱性鑒定

通過(guò)耐旱性體系建立，明確了用于耐旱性鑒定的PEG6000溶液最適濃度，設(shè)置干旱脅迫組(DT)和對(duì)照組(CK)兩組處理，每組處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)80份甜蕎種質(zhì)資源材料進(jìn)行耐旱性鑒定，鑒定培養(yǎng)條件同1.2。

1.4 耐旱指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算

每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)(以胚根突破種皮2 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，直至第7天。于第7天計(jì)算發(fā)芽率，并隨機(jī)挑取10株幼苗，利用直尺對(duì)其株高及根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。

發(fā)芽率(%)=第7天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

相對(duì)發(fā)芽率(RGR)=(干旱脅迫下種子發(fā)芽率/對(duì)照種子發(fā)芽率)×100%

萌發(fā)抗旱指數(shù)(SIDR)[23]=(1.00 ×nd1+0.75×nd3+0.50×nd5+0.25×nd7)×100%(式中nd1、nd3、nd5和nd7依次為第1、3、5、和7天的種子相對(duì)發(fā)芽率)

相對(duì)株高指數(shù)(RPHI)=(脅迫下幼苗株高/對(duì)照幼苗株高)×100%

相對(duì)根長(zhǎng)指數(shù)(RRLI)=(脅迫下幼苗根長(zhǎng)/對(duì)照幼苗根長(zhǎng))× 100%

株高脅迫指數(shù)(PHSI)=[(對(duì)照幼苗株高-脅迫下幼苗株高)/對(duì)照幼苗株高]×100%

根長(zhǎng)脅迫指數(shù)(RLSI)=[(對(duì)照幼苗根長(zhǎng)-脅迫下幼苗根長(zhǎng))/對(duì)照幼苗根長(zhǎng)]×100%

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法進(jìn)行多重比較。運(yùn)用R語(yǔ)言的stats包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干旱脅迫水平下甜蕎種子的萌發(fā)

由表3得知，不同程度水分脅迫對(duì)各參試材料相對(duì)發(fā)芽率(RGR)和萌發(fā)抗旱指數(shù)(SIDR)的影響程度不同，隨著脅迫程度的加劇呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。10% PEG6000溶液脅迫對(duì)各參試材料的相對(duì)發(fā)芽率影響較小，但萌發(fā)抗旱指數(shù)存在顯著差異，其中定甜蕎1號(hào)(YZU-39)顯著高于其他品種。在20% PEG6000溶液脅迫下，RGR和SIDR變幅分別為72.22%～101.12%和50.82%～101.62%；寧麥1號(hào)(YZU-38)的RGR顯著低于其他，但SIDR與蒙0207(YZU-44)和榆蕎1號(hào)(YZU-45)無(wú)顯著差異。YZU-39和北早生(YZU-62)在25% PEG6000溶液脅迫下，其RGR和SIDR均顯著高于其他品種，而YZU-38和YZU-44在25% PEG6000溶液脅迫下，其相對(duì)發(fā)芽率和萌發(fā)抗旱指數(shù)顯著低于其他品種。當(dāng)水分脅迫水平達(dá)到30%時(shí)，YZU-39和YZU-62的相對(duì)發(fā)芽率在10%以下。

表3 不同干旱脅迫水平對(duì)蕎麥種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different drought stress levels on seed germination of buckwheat

2.2 不同干旱脅迫水平下甜蕎的生長(zhǎng)

由表4可知，隨著水分脅迫程度的加劇，甜蕎幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育所受影響也在加劇，表現(xiàn)為相對(duì)株高指數(shù)(RPHI)下降和株高脅迫指數(shù)(PHSI)上升。在濃度為10% PEG6000溶液濃度下，各品種的RPHI在22.99%～67.99%之間，在干旱敏感品種(YZU-44和YZU-45)中表現(xiàn)出了較為嚴(yán)重的傷害。干旱脅迫水平達(dá)到20%、25%PEG6000時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)受到了顯著的抑制作用；在30%PEG6000的高強(qiáng)度水分脅迫下，除了耐旱性較強(qiáng)的品種YZU-39和YZU-62外，其他品種幼苗的生長(zhǎng)均受到了極大抑制作用。

不同干旱脅迫水平對(duì)蕎麥幼苗根長(zhǎng)的影響如表5所示，整體表現(xiàn)為在較低的干旱脅迫下(10%PEG6000)，對(duì)根部生長(zhǎng)的影響程度較小，甚至有促進(jìn)根的生長(zhǎng)作用，當(dāng)干旱脅迫水平達(dá)到20%PEG6000以上時(shí)，表現(xiàn)為相對(duì)根長(zhǎng)指數(shù)(RRHI)顯著下降和根長(zhǎng)脅迫指數(shù)(RLSI)升高，干旱脅迫對(duì)根生長(zhǎng)影響隨著脅迫水平的提高而增大；當(dāng)脅迫達(dá)到25%PEG6000時(shí)，各品種的RLSI均在90%以上；30%PEG6000時(shí)絕大多品種的RLSI達(dá)到了100%，幼苗根的生長(zhǎng)受到了極大地抑制。

表5 不同干旱脅迫水平對(duì)蕎麥幼苗根長(zhǎng)的影響Table 5 Effects of different drought stress levels on root length of buckwheat

2.3 甜蕎種質(zhì)資源萌發(fā)期耐旱性鑒定

如圖1所示，20% PEG6000脅迫下，參試品種RGR、SIDR、RPHI、PHSI、RRHI和RLSI均呈現(xiàn)近似正態(tài)分布，且表現(xiàn)出明顯的差異。RGR變幅為0～93.33%，變異系數(shù)為72.14%；SIDR變幅為0～87.47%，變異系數(shù)為79.06%。RPHI和PHSI的變幅分別為0～19.72%和80.28%～100%，而RRHI和RLSI的變幅分別為0～29.15%和50.85%～100%。研究結(jié)果表明參試甜蕎種質(zhì)資源在干旱脅迫下萌發(fā)與生長(zhǎng)差異較大。

聚類分析得出(圖2)，80份種質(zhì)資源共聚成4類，其中YZU-33耐旱性最強(qiáng)，與YZU-08和YZU-44聚為第1類，為耐旱性極強(qiáng)種質(zhì)，將這3份種質(zhì)資源材料的耐旱等級(jí)定義為1級(jí)；YZU-39(定甜蕎1號(hào))、YZU-62(北早生)與其他11份種質(zhì)資源聚為第2類，為耐旱型種質(zhì)，將這13份種質(zhì)資源材料的耐旱等級(jí)定義為2級(jí)； YZU-63(西農(nóng)9976)、YZU-64(西農(nóng)9978)等33份種質(zhì)資源聚為第3類，為耐旱性較弱種質(zhì)，將其耐旱性等級(jí)定義為3級(jí)；YZU-38(寧蕎1號(hào))、YZU-44(蒙0207)和YZU-45(榆蕎1號(hào))等31份種質(zhì)資源聚為第4類，為干旱敏感型種質(zhì)，耐旱性等級(jí)定義為4級(jí)。

相關(guān)性分析結(jié)果表明(表6)，耐旱等級(jí)與RGR、SIDR、RRHI呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)性分別為-0.92，-0.94和-0.85(P<0.05)，與RLSI呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.85，與RPHI和PHSI無(wú)顯著相關(guān)性。該試驗(yàn)結(jié)果表明蕎麥種質(zhì)資源的耐旱性越強(qiáng)，在受到干旱脅迫時(shí)維持發(fā)芽和地下部生長(zhǎng)的能力越強(qiáng)，但與地上部生長(zhǎng)關(guān)系不緊密。因此，相對(duì)發(fā)芽率(RGR)、萌發(fā)抗旱指數(shù)(SIDR)、相對(duì)根長(zhǎng)指數(shù)(RRHI)和根長(zhǎng)脅迫指數(shù)(RLSI)可作為蕎麥萌發(fā)期耐旱性鑒定的有效指標(biāo)。

表6 耐旱等級(jí)與各生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of drought tolerance grade and growth indexes

3 討 論

植物種子萌發(fā)期作為感應(yīng)外界環(huán)境改變的最初階段，耐旱性強(qiáng)弱與其是否能發(fā)育為健壯植物有著較高的關(guān)聯(lián)性[24]，建立萌發(fā)期耐旱性鑒定體系對(duì)于培育耐旱品種具有重要意義[25-26]。PEG6000高滲溶液模擬干旱脅迫發(fā)現(xiàn)，10%PEG6000干旱脅迫對(duì)甜蕎種子的萌發(fā)率和根的生長(zhǎng)影響較小，甚至對(duì)于某些品種具有促進(jìn)作用，隨著PEG6000高滲溶液濃度的升高，種子萌發(fā)率、萌發(fā)抗旱指數(shù)、株高和根長(zhǎng)等各項(xiàng)指標(biāo)呈下降趨勢(shì)，20%PEG6000溶液為蕎麥萌發(fā)期耐旱性篩選與鑒定的適宜脅迫濃度。這與對(duì)芒果[27]、藜麥[28-29]、花椰菜[19]和扁豆[11]種子萌發(fā)影響的研究報(bào)道結(jié)果基本一致，但不同作物對(duì)PEG濃度響應(yīng)各不相同[19]，因此，篩選適宜的耐旱性鑒定脅迫濃度可提高耐旱性鑒定的準(zhǔn)確性。

植物的耐/抗旱性是多基因控制的數(shù)量性狀，在植物的耐/抗旱性評(píng)價(jià)體系中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍采用多指標(biāo)相結(jié)合的耐/抗旱指標(biāo)和評(píng)價(jià)方法[20,30]。應(yīng)用灰度關(guān)聯(lián)分析、模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法和聚類分析等方法可對(duì)植物的耐旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，如單云鵬等[31]采用隸屬函數(shù)法與聚類分析相結(jié)合的方法對(duì)235份小豆種質(zhì)資源材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選得到了15份抗旱種質(zhì)；王焱等[20]則在59份苜蓿種質(zhì)資源材料中篩選得到了3份極強(qiáng)抗旱型種質(zhì)。本研究將80份甜蕎種質(zhì)資源分為4類，篩選到了3份耐旱性極強(qiáng)的農(nóng)家種種質(zhì)資源，可作為選育耐旱型蕎麥品種的基礎(chǔ)材料。

種子萌發(fā)期作為決定作物基本苗數(shù)和群體結(jié)構(gòu)建成的關(guān)鍵階段，該時(shí)期受到干旱脅迫極易對(duì)作物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[19]，因此確立作物萌發(fā)期耐旱性鑒定方法和指標(biāo)，篩選簡(jiǎn)單快捷的耐旱評(píng)價(jià)指標(biāo)以提高材料篩選效率[32-33]，并在萌發(fā)期進(jìn)行種質(zhì)資源耐旱性鑒定對(duì)耐旱性育種具有重要意義[34]。Bouslama等[23]根據(jù)種子在高滲溶液或不同滲透勢(shì)土壤中的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率來(lái)評(píng)價(jià)萌發(fā)期的耐旱性，并提出種子萌發(fā)抗旱指數(shù)。大量的研究發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)等可作為植物萌發(fā)期耐旱性評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)[35-36]。在水稻[37]、油菜[38]和大豆[39]等作物的萌發(fā)期抗旱性研究中發(fā)現(xiàn)萌發(fā)耐旱指數(shù)與種質(zhì)資源的耐旱性顯著正相關(guān)，在本次研究中，甜蕎的耐旱性與萌發(fā)抗旱指數(shù)呈顯著正相關(guān)，表明萌發(fā)抗旱指數(shù)是甜蕎種質(zhì)資源耐旱鑒定的有效指標(biāo)。此外，在萌發(fā)期耐旱性鑒定過(guò)程中，除了關(guān)注發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率等種子萌發(fā)性狀外，還可以采用相對(duì)苗高和相對(duì)胚根長(zhǎng)等幼苗生長(zhǎng)勢(shì)相關(guān)指標(biāo)以全面體現(xiàn)種質(zhì)資源的出苗率及幼苗健壯程度[40-41]，如余貴海等[42]和成鍇等[43]利用PEG脅迫條件下的發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)等性狀對(duì)玉米萌發(fā)期耐旱性綜合評(píng)價(jià)；張春宵等[33]的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合發(fā)芽率、胚芽干重和貯藏物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)率可以比較全面地評(píng)價(jià)土培條件下玉米萌發(fā)期的耐旱性。張海平等[39]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合相對(duì)發(fā)芽率、萌發(fā)耐旱指數(shù)、相對(duì)株高和相對(duì)苗高等指標(biāo)可以全面且直觀地反映出大豆種子在萌發(fā)期的耐旱性。本次研究中，蕎麥萌發(fā)期的耐旱性與相對(duì)根長(zhǎng)指數(shù)顯著相關(guān)，但與相對(duì)株高指數(shù)相關(guān)性較低，這與前人的研究結(jié)果基本一致[7,44]。本次研究結(jié)果表明RGR(相對(duì)發(fā)芽率)、SIDR(萌發(fā)抗旱指數(shù))、RRHI(相對(duì)根長(zhǎng)指數(shù))和RLSI(根長(zhǎng)脅迫指數(shù))可以作為蕎麥萌發(fā)期耐旱性鑒定的有效指標(biāo)。