番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）對(duì)3種殺菌劑的抗性監(jiān)測及交互抗藥性研究

魏佳爽，袁善奎，向冰峰，朱志峰

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125）

番茄灰霉病是一種世界性的真菌病害，主要由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea） 侵染引起。該病害在國內(nèi)外早有報(bào)道，已成為設(shè)施農(nóng)業(yè)上一種重要病害，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)40%～50%，甚至絕產(chǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，是番茄生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一[1]。灰葡萄孢菌的寄主范圍廣，可導(dǎo)致500多種植物病害，其中農(nóng)作物超過200種[2]。目前化學(xué)防治仍是控制該病害的主要手段。由于灰葡萄孢具有繁殖力強(qiáng)、變異速度快等特點(diǎn)，被殺菌劑抗性行動(dòng)委員會(huì)（FRAC）歸入高抗性風(fēng)險(xiǎn)病原菌[3]。在山西、上海等地區(qū)已發(fā)現(xiàn)其對(duì)多菌靈、腐霉利、嘧霉胺、氟吡菌酰胺、嘧菌酯、啶酰菌胺等多種殺菌劑產(chǎn)生了不同程度抗性[4-7］。

隨著生產(chǎn)上番茄灰霉病菌對(duì)多菌靈、乙霉威等一些傳統(tǒng)藥劑不斷產(chǎn)生抗性，嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑等藥劑已成為生產(chǎn)上防治該病的主要藥劑品種。本研究采用菌絲生長速率法，分別測定了采自河南省和江蘇省8個(gè)不同地市番茄種植區(qū)的158株番茄灰霉病菌對(duì)上述3種藥劑的敏感性，分析了不同地區(qū)菌株的敏感性差異及交互抗性情況，以期為番茄灰霉病的科學(xué)合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

2019年，從江蘇淮安、江蘇東臺(tái)、江蘇泰州、河南洛陽、河南許昌、河南開封、河南鄭州、河南新鄉(xiāng)等8地的番茄種植基地隨機(jī)采集已感染灰霉病的病果共220個(gè)，參考文獻(xiàn)方法[8-9]對(duì)灰霉病菌進(jìn)行分離、鑒定和保存，共分離得到158個(gè)擔(dān)孢菌株。所有菌株均在4℃下保存于PDA斜面中待用。

1.1.2 供試藥劑

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），北京奧博星生物技術(shù)有限公司。其用于菌株培養(yǎng)及菌絲生長抑制試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

筆者采用菌絲生長速率法[10]。各菌株先在PDA平板上預(yù)培養(yǎng)5 d，然后制取直徑6 mm的菌餅，菌絲朝下分別接入含系列濃度嘧菌酯（同時(shí)含100 μg/mL SHAM）、啶酰菌胺、啶菌唑的PDA平板上。每皿接種1個(gè)菌餅，每處理重復(fù)3次，以不含藥劑的PDA平板為對(duì)照。25℃下培養(yǎng)5 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.2 番茄灰霉病菌抗藥菌株對(duì)不同殺菌劑間的交互抗性測定

其次，從供試菌株中選擇5株對(duì)嘧菌酯敏感性不同的菌株，采用1.2.1所述的菌絲生長速率法分別測定其對(duì)其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑如醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯的敏感性；另從供試菌株中選擇5株對(duì)啶酰菌胺敏感性不同的菌株，分別測定其對(duì)其他琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHI）類殺菌劑如萎銹靈、氟吡菌酰胺、噻呋酰胺的敏感性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，采用該軟件描述統(tǒng)計(jì)模塊進(jìn)行Shapiro-Wilk法（W法）正態(tài)性檢驗(yàn)，P＞0.05則符合正態(tài)分布，反之則為非正態(tài)分布；通過probit模塊計(jì)算藥劑抑制病原菌菌絲生長的毒力回歸方程（y=A＋Bx）、相關(guān)系數(shù)和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間番茄灰霉病菌對(duì)3種殺菌劑的敏感性及抗性

敏感性測定結(jié)果表明，158個(gè)番茄灰霉病菌菌株對(duì)嘧菌酯的EC50值在0.0045～90.5 μg/mL，平均EC50值為9.80±21.1 μg/mL，最高值為最低值的2.0×105倍；對(duì)啶酰菌胺的EC50值在0.0576～36.8 μg/mL，平均EC50值為2.56±6.35 μg/mL，最高值為最低值的639倍；對(duì)啶菌唑的EC50值在0.0169～2.64 μg/mL，平均值為0.13±0.23 μg/mL，最高值為最低值的156倍。在供試的3種殺菌劑中，對(duì)于敏感菌株而言，均具有較高活性，其中嘧菌酯對(duì)番茄灰霉病菌的活性最高，其次是啶酰菌胺和啶菌唑；但從整個(gè)群體的平均敏感性水平來看，番茄灰霉病菌群體對(duì)啶菌唑最敏感，其次是啶酰菌嘧菌酯，最后是嘧菌酯，說明病原菌對(duì)嘧菌酯出現(xiàn)了較高水平的抗性。158株番茄灰霉病菌對(duì)嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑的抗性頻率分別為19.0%、11.4%、0.6%。

將上述3個(gè)藥劑對(duì)158株番茄灰霉病菌的EC50值范圍劃分為7個(gè)區(qū)間，每個(gè)區(qū)間的菌株出現(xiàn)頻率見圖1。通過SPSS分析Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果，顯示菌株對(duì)嘧菌酯（W=0.905，P＜0.05）、對(duì)啶酰菌胺（W=0.815，P＜0.05）、對(duì)啶菌唑（W=0.946，P＜0.05）的敏感性頻次分布均不符合正態(tài)分布，表明不同番茄灰霉病菌對(duì)嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑的敏感性均出現(xiàn)了分化，并已出現(xiàn)敏感性降低的亞群體或抗性菌株。

圖1 158 株番茄灰霉病菌對(duì)3 種殺菌劑的敏感性頻次分布

2019年從江蘇省和河南省分別采集97株和61株番茄灰霉病菌株，2個(gè)地區(qū)的菌株對(duì)嘧菌酯和啶酰菌胺的敏感性差異較大，但對(duì)啶菌唑的平均敏感性接近（表1）。總體來說，江蘇地區(qū)的番茄灰霉病菌對(duì)嘧菌酯和啶酰菌胺出現(xiàn)了較嚴(yán)重的抗性問題，抗性菌株頻率分別為25.8%、18.6%，并且檢測到1株抗啶菌唑的抗性菌株；河南地區(qū)采集的番茄灰霉病菌中未檢測到對(duì)啶酰菌胺和啶菌唑的抗性菌株，僅檢測到5株抗嘧菌酯的抗性菌株，抗性頻率為8.2%。以上結(jié)果說明，在防治番茄灰霉病方面，江蘇的用藥水平要高于河南地區(qū)。

表1 江蘇和河南番茄灰霉病菌對(duì)3 種殺菌劑的敏感性及抗性情況

2.2 番茄灰霉病菌對(duì)不同殺菌劑的交互抗性2.2.1 番茄灰霉病菌對(duì)嘧菌酯、啶酰菌胺和啶菌唑的交互抗性

2.2.2 番茄灰霉病菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的交互抗性

選擇5株對(duì)嘧菌酯敏感性不同的菌株，測定了其對(duì)醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯的敏感性。結(jié)果表明（表2），供試3種殺菌劑對(duì)5株番茄灰霉病菌菌絲生長的平均抑制活性依次為吡唑醚菌酯＞肟菌酯＞醚菌酯＞嘧菌酯，結(jié)果表明嘧菌酯與醚菌酯、肟菌酯和吡唑醚菌酯均存在交互抗性。

表2 番茄灰霉病菌對(duì)4 種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的交互抗性

2.2.3 番茄灰霉病菌對(duì)SDHI類殺菌劑的交互抗性

選擇5株對(duì)啶酰菌胺敏感性不同的菌株，測定了其對(duì)萎銹靈、氟吡菌酰胺、噻呋酰胺的敏感性（表3），結(jié)果表明,在SDHI類殺菌劑中，番茄灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺最敏感，對(duì)另外3個(gè)藥劑的敏感性較低，但從整體趨勢來看，啶酰菌胺與萎銹靈和噻呋酰胺均存在交互抗性，而與氟吡菌酰胺不存在交互抗性。

2.3 番茄灰霉病菌對(duì)多藥抗性情況

3 小結(jié)與討論

通過試驗(yàn)，供試的158個(gè)番茄灰霉病菌株中，有128株對(duì)嘧菌酯表現(xiàn)敏感，EC50值在0.0045～90.5 μg/mL，平均EC50值為0.81±1.27 μg/mL，這比Zhang等[11]報(bào)道的敏感性基線（2.24±1.29 μg/mL）更加敏感。另外30株表現(xiàn)抗性與敏感菌株的平均EC50值相比，抗性倍數(shù)在14～112倍，呈低抗到高抗趨勢；有140株對(duì)啶酰菌胺表現(xiàn)敏感，EC50值在0.0576～36.8 μg/mL，平均EC50值為0.54±0.36 μg/mL，與Zhang等[12]報(bào)道的敏感性基線（1.07±0.11 μg/mL）結(jié)果相比更加敏感。另外18株表現(xiàn)抗性與敏感菌株的平均EC50值相比，抗性倍數(shù)在11～68倍，呈低抗到中等抗趨勢；有157株對(duì)啶菌唑表現(xiàn)敏感，EC50值在0.0169～2.64 μg/mL，平均EC50值為0.106±0.095μg/mL，與馬建英等[13]報(bào)到的敏感性基線（0.1182±0.0363 μg/mL）結(jié)果一致。另外，從各藥劑的敏感性分布曲線來看，灰霉病菌對(duì)嘧菌酯的敏感群體的EC50差異較大，變化幅度較寬。

本研究表明，番茄灰霉病菌對(duì)甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑存在交互抗藥性，這與武東霞等[14]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)灰葡萄孢菌對(duì)苯噻菌酯、嘧菌酯、醚菌酯和吡唑醚菌酯之間存在正交互抗性，但與不同作用機(jī)制的殺菌劑無交互抗性。另外，研究發(fā)現(xiàn)番茄灰霉病菌對(duì)部分SDHI類殺菌劑存在交互抗性，但由于部分SDHI對(duì)灰葡萄孢菌的活性較低，從而未表選處交互抗性情況。盡管本研究測定的大多數(shù)菌株對(duì)嘧菌酯、啶酰菌胺、啶菌唑仍表現(xiàn)敏感，但抗藥性菌株的出現(xiàn)表明采用這3種藥劑防治番茄灰霉病具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，而且已發(fā)現(xiàn)大量菌株存在多藥抗性現(xiàn)象，這將會(huì)導(dǎo)致一些混配藥劑失去防效。此外，由于番茄灰霉病菌具有繁殖速度快、遺傳變異大和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，極易對(duì)藥劑產(chǎn)生抗藥性，建議應(yīng)加強(qiáng)番茄灰霉病對(duì)這幾類藥劑的敏感性監(jiān)測，同時(shí)注意輪換或混合使用其他具有不同作用機(jī)制的藥劑，以減小對(duì)田間種群的選擇性壓力，延緩病原菌對(duì)該類藥劑的抗性發(fā)展。