張雅卿,葉書建,周 睿,張 晶,劉雙平
(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214000)
不同發(fā)酵食品有不同風(fēng)味,如奶制品的酸甜、醬油的鮮美、白酒的辛辣等等,這是不同的原輔料、發(fā)酵工藝、優(yōu)勢菌種及主要風(fēng)味物質(zhì)造成的。但是它們的發(fā)酵過程從微觀角度上看卻是相通的,即風(fēng)味物質(zhì)的生成本質(zhì)是一樣的。
目前已經(jīng)有諸多研究者利用GC-MS等技術(shù)檢測出了多種典型發(fā)酵食品所含的風(fēng)味物質(zhì),進(jìn)一步揭開了風(fēng)味來源的本質(zhì),為風(fēng)味的調(diào)控奠定了基礎(chǔ);隨著分子技術(shù)的廣泛應(yīng)用,人們通過PCR-DGGE 和高通量測序等技術(shù)分析發(fā)酵中微生物的群落結(jié)構(gòu);隨后,主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)和聚類分析(Cluster analysis,CA)等方法將風(fēng)味物質(zhì)與微生物聯(lián)系在一起;因此,我們能夠更加詳細(xì)地知道風(fēng)味/異味物質(zhì)是哪些、源自何處,以及如何調(diào)節(jié)。
典型的傳統(tǒng)發(fā)酵食品有食醋、黃酒、腐乳、干酪等,大多采用開放的發(fā)酵系統(tǒng),其發(fā)酵過程中涉及復(fù)雜的微生物系統(tǒng),會產(chǎn)生許多對人體有益的活性物質(zhì),同時使整體風(fēng)味提高,但也會產(chǎn)生生物胺等有害物質(zhì)。為揭示食品發(fā)酵過程中的機(jī)理,國內(nèi)學(xué)者主要采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)、宏基因組測序等技術(shù)對發(fā)酵食品的特征風(fēng)味物質(zhì)和微生物群落的多樣性進(jìn)行了研究。通過分析不同發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的多樣性、群落結(jié)構(gòu)以及演替規(guī)律,有助于揭示其微生物群落的功能和風(fēng)味物質(zhì)形成的機(jī)理,改善產(chǎn)品品質(zhì),為發(fā)酵食品的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 食醋
食醋是人們?nèi)粘I畋貍涞乃嵛墩{(diào)味品,主要風(fēng)味物質(zhì)為乙酸、醛酮和高級醇類等。不同的特征風(fēng)味物質(zhì)糅合在一起,賦予了食醋特定的風(fēng)味和香氣,不同的食醋風(fēng)味也各不相同,山西老陳醋以色、香、醇、濃、酸五大特點享譽“天下第一醋”;恒順香醋酸而不澀;北京米醋酸中帶柔、香氣濃郁,研究食醋不同的風(fēng)味物質(zhì)對食醋口感的提升有巨大作用。鄭宇等[1]采用HS-SPME-GC-MS 對6 個品牌的山西老陳醋進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量較高的成分為糠醛、乙酸乙酯、2,3-丁二酮;采用HPLC 法檢測出7 種有機(jī)酸,乙酸和乳酸為山西老陳醋的主要酸類。余鳴春等[2]通過GC-MS 測定了5 種恒順香醋中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有成分含量較高的依次為糠醛、乙酸、乙偶姻、乙酸乙酯、四甲基吡嗪、5-甲基糠醛、異戊酸。其中糠醛含量高達(dá)23.52 %,對恒順香醋風(fēng)味貢獻(xiàn)顯著,賦予了其木香、焦糖香和烘烤食品的氣味[3]。Zhang 等[4]通過HS-SPME-GC-MS 對北京米醋不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了測定,結(jié)果表明,在米醋不同的發(fā)酵階段香氣成分不同。酸和醇為主要香氣成分,乙醇、3-甲基丁醇和苯乙醇是酒精化階段潛在的香氣標(biāo)志物,乙醇含量最高為70%;乙酸和3-羥基-2-丁酮是醋化階段的代表化合物,乙酸的含量達(dá)90%以上。
1.1.2 酒類飲料
傳統(tǒng)發(fā)酵酒類主要為黃酒、白酒、啤酒等酒種,由于不同的發(fā)酵工藝、環(huán)境、氣候等,不同的酒體的風(fēng)味也各有不同,傳統(tǒng)發(fā)酵酒的主要成分為氨基酸、醇類、酸類、酯類、酚類等,對風(fēng)味物質(zhì)的研究對提升酒體風(fēng)味具有重要意義。Chen 等[5]通過氣相色譜-嗅覺法(GC-O)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GCMS)對黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),乙酸、3-甲基丁酸、丁酸為主要酸類,賦予了酒體奶酪香味,起到降低刺激等作用;乙酸乙酯為主要酯類物質(zhì),賦予了酒體蜜糖甜味;3-甲基丁醇和β-苯乙醇為主要醇類;另外苯甲醛、香蘭素、土臭素和γ-壬內(nèi)酯也對黃酒的獨特風(fēng)味的形成有重要貢獻(xiàn)。孫其然等[6]采用GC-MS 對貴州茅臺酒進(jìn)行了測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),主要酸類為丙酸;主要酯類為辛酸乙酯、亞油酸乙酯、庚酸乙酯,其中辛酸乙酯貢獻(xiàn)尤為突出,賦予了酒體菠蘿、蘋果香氣樣的香韻;主要醇類為2-丁醇和糠醇,2-丁醇有類似葡萄酒的氣味。馮紅艷等[7]采用靜態(tài)頂空-氣相色譜法對啤酒的主要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了測定,研究發(fā)現(xiàn),啤酒的主要特征風(fēng)味物質(zhì)為乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊酯、異戊醇等,其中乙醛對啤酒風(fēng)味的影響很大,賦予了啤酒生青味,異戊醇是構(gòu)成啤酒酒體最重要物質(zhì),濃度高達(dá)126.05 mg/L。齊曉茹等[8]采用HS-SPME-GC-MS 對6 種不同酒齡的紅葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有風(fēng)味物質(zhì)中,主要醇類為苯乙醇,賦予酒體清甜的玫瑰樣花香;主要酸類為己酸,帶有類似羊的氣味;酯類含量較高的為癸酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯,特別是癸酸乙酯含量很高,賦予了酒梨味果香。
傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品種類繁多,典型代表有酸奶和奶酪等。最原始的發(fā)酵乳制品是利用乳酸菌以乳糖為原料進(jìn)行生長代謝,產(chǎn)生各種酶催化乳糖產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì),具有營養(yǎng)豐富、易消化、便于儲藏等特點。以奶酪為代表,其具有悠久的歷史,隨著制作過程、配方、熟成程度等因素不同,而擁有豐富多變的口感,通過研究奶酪的風(fēng)味物質(zhì)對調(diào)控產(chǎn)品品質(zhì)有巨大作用。
1.2.1 酸奶
劉東等[9]采用HS-SPME-GC-MS 對3 份不同地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵白牦牛酸奶和1 份普通酸奶的特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測,并測定了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)ROAV 值,結(jié)果發(fā)現(xiàn)白牦牛酸奶和普通酸奶的風(fēng)味物質(zhì)相差較大,乙酸乙酯、2-甲基丁醛、異戊醛為白牦牛酸奶中的主要風(fēng)味物質(zhì),而乙酸乙酯(7.59%~12.59%)為白牦牛酸奶關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì),賦予了酸奶果酒香味;而乙醛、雙乙酰、乙偶姻為普通酸奶的主要風(fēng)味物質(zhì),賦予了酸奶奶油香味。成堃等[10]采用SPME-GC-MS 對藍(lán)莓味酸奶的特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)主要為2,3-丁二酮、己酸、乙酸,而2,3-丁二酮(60.90 %)對酸奶貢獻(xiàn)比較大,賦予了酸奶奶油香味,且隨著發(fā)酵時間延長而增長。
1.2.2 奶酪
羅天淇等[11]采用SPME-GC-MS 對宮廷奶酪的特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)酸類物質(zhì)含量最高,占總量的55.7%~64.84%;采用香氣活力值(OAV),確定了26種特征風(fēng)味物質(zhì)的OVA值,辛醛對奶酪風(fēng)味和香氣的貢獻(xiàn)最大,其OVA 值為4.87。馬艷麗等[12]采用SPME-GC-MS 對西方奶酪的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了測量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)切達(dá)奶酪中含有20 種揮發(fā)性化合物,脂肪酸類化合物含量最高,占總含量的25.04%,丁酸(9.1%)和乙酸(3.08%)為主要酸類,賦予了奶酪酸臭味和刺鼻性氣味。
發(fā)酵蔬菜是以新鮮蔬菜為原料,經(jīng)過乳酸菌、醋酸菌等混合微生物發(fā)酵而成的食品,其中含有大量的氨基酸、維生素C 和膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì),具有抗肥胖、凈腸等功能。張華芳等[13]利用GC-MS對不同發(fā)酵時期的芫根泡菜的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要醇類物質(zhì)為乙醇和芳樟醇,乙醇在發(fā)酵21 d 時含量達(dá)到最高為21.14 %;主要烴類物質(zhì)為d-檸檬烯,賦予了泡菜新鮮橙子的香氣;二烯丙基二硫醚對泡菜的風(fēng)味貢獻(xiàn)尤為突出,在14 d時含量達(dá)到了24.65 %,賦予了其大蒜味口感。周相玲等[14]對人工接種和自然接種的發(fā)酵蔬菜進(jìn)行了風(fēng)味物質(zhì)的檢測與對比分析,研究發(fā)現(xiàn)兩者的主要氨基酸都為蘇氨酸,賦予了泡菜鮮甜的口感;乳酸都為主要有機(jī)酸,賦予了泡菜澀感;主要呈味物質(zhì)都為二烯丙基硫醚,賦予了泡菜大蒜味。
發(fā)酵豆制品是利用大豆發(fā)酵的食品,主要包括腐乳、豆豉和醬油等,其中富含醇、酯、有機(jī)酸、氨基酸等有益物質(zhì),具有改善腸道機(jī)能,預(yù)防心血管病等功效,不同的發(fā)酵豆制品風(fēng)味物質(zhì)差異也很大。劉娜等[15]采用HS-SPME-GC-MS 對3 種紅腐乳的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),共有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為23 種,醇類和酯類含量都很高,賦予了腐乳醇香、果香、甜香等口感。其中乙醇、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、α-水芹烯、茴香腦和2-戊基呋喃在3 種腐乳中含量比較高,為腐乳的主要風(fēng)味物質(zhì)。謝蘭心等[16]采用SPME-GCMS對黑豆和黃豆發(fā)酵的豆豉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 種樣品共有的風(fēng)味物質(zhì)為10種,其中苯甲醛和苯乙醛含量比較高,賦予了腐乳苦杏仁味和玫瑰花香味,為豆豉的主要風(fēng)味物質(zhì)。王棟等[17]采用SPME-GC-MS 對海天醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中苯乙醛(11.21 %)為核心揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),賦予了醬油風(fēng)信子的香味,其次十四烷、月桂酸、十八醛、十六烷、云杉苷含量比較高,組成了醬油的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。
2.1.1 食醋
在市面上有很多發(fā)酵醋類產(chǎn)品,由于微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,風(fēng)味也大不相同,對其微生物群落結(jié)構(gòu)的研究可以更好的了解發(fā)酵機(jī)制,獲得優(yōu)勢菌種,對醋產(chǎn)品的工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化提供理論基礎(chǔ)。Wang 等[18]通過宏基因組學(xué)確定了鎮(zhèn)江香醋的醋酸發(fā)酵過程中微生物群的結(jié)構(gòu),優(yōu)勢細(xì)菌和真菌分別為醋酸桿菌、乳酸桿菌、曲霉和鏈霉菌,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌比真菌對風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)更大,并將醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬、脫水桿菌屬、乳球菌屬、葡萄糖醋酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等7 個屬確定為鎮(zhèn)江香醋功能性核心菌群。張嬌嬌等[19]利用高通量測序?qū)t曲米醋制曲微生物組成進(jìn)行了分析,研究獲得32 個菌株,主要真菌為酵母屬、紅曲霉屬和曲霉屬,且隨時間延長,曲中的優(yōu)勢真菌逐漸由酵母屬、紅曲霉屬變?yōu)榍箤佟<?xì)菌優(yōu)勢菌為乳酸菌。
2.1.2 酒類飲料
傳統(tǒng)發(fā)酵酒類主要以淀粉為原料,經(jīng)過淀粉糖化和酒精發(fā)酵兩個過程發(fā)酵而成。由于系統(tǒng)相對開放,多種微生物共同參與其中,在淀粉酶、酒化酶等作用下產(chǎn)生酒精。而好酒窖經(jīng)過時間的積累,有益微生物不斷富集純化,釀出的酒體風(fēng)味香濃。為了更好的了解其發(fā)酵機(jī)理和產(chǎn)香機(jī)制,做到對發(fā)酵酒類的品質(zhì)把控,對釀酒微生物群落的研究尤為重要。Huang等[20]通過高通量測序技術(shù)對傳統(tǒng)武夷紅曲糯米酒的核心功能菌群進(jìn)行了研究,結(jié)果表明乳酸桿菌、芽孢桿菌、亮葡菌、乳球菌、拉烏爾氏菌、葡萄球菌、足球菌、魏斯氏菌、酵母菌等是傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的核心菌種。且細(xì)菌和真菌群落在不同的發(fā)酵階段均存在顯著差異,在最初的釀造階段為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等,但其種群隨著發(fā)酵的進(jìn)行而減少,在發(fā)酵結(jié)束(46 d)時乳酸桿菌屬、葡萄糖桿菌等演替為優(yōu)勢菌種。李路等[21]研究了黃酒發(fā)酵劑-紅曲和白曲的微生物群落組成,紅曲的優(yōu)勢菌種為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、黃曲霉和紫紅曲霉等,而白曲中的優(yōu)勢菌種為腸桿菌屬、泛生菌屬、魏斯氏菌屬、少根根霉、印度毛霉和釀酒酵母等。孫利林等[22]采用高通量測序技術(shù)對醬香型白酒釀造過程中的真菌多樣性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,酒曲中的優(yōu)勢菌種主要為曲霉屬(64.43%)和嗜熱子囊菌屬(27.79 %),為后續(xù)的堆積糖化發(fā)酵發(fā)揮著重要的作用;窖內(nèi)發(fā)酵酒醅的微生物多樣性最高,優(yōu)勢菌種為曲霉菌屬(52.89 %)和嗜熱子囊菌屬(19.49%),與醬香風(fēng)味產(chǎn)生有密切關(guān)系。
發(fā)酵乳制品以乳類為原料,經(jīng)過乳酸菌、酵母菌等發(fā)酵制成,以奶酪、酸奶等最具代表性。在發(fā)酵過程中微生物相互作用,將原料分解成人體易于吸收的小分子,提高了其營養(yǎng)價值。
2.2.1 酸奶
瑪依樂·艾海提等[23]采用高通量測序?qū)鹘y(tǒng)發(fā)酵酸奶微生物群落組成進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),乳桿菌屬和鏈球菌屬為主要的優(yōu)勢細(xì)菌,酵母菌屬和克魯維酵母屬為主要的優(yōu)勢真菌。張敏等[24]采用高通量測序?qū)λ崤D?、酸駝奶和酸馬奶中微生物群落組成進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),酸牛奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和鏈球菌屬;酸駝奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和乳球菌屬;酸馬奶的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、乳球菌屬和醋桿菌屬。乳桿菌屬為3 種酸奶中共有的優(yōu)勢菌屬,但所占比例各不相同。
2.2.2 奶酪
Zheng 等[25]對哈薩克手工奶酪的微生物群落進(jìn)行了分析,研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌、鏈球菌、克魯維酵母菌和飽圓酵母菌是奶酪的主要菌種,且細(xì)菌比真菌對風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)更大;并基于其主要風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生和微生物群落的功能,確定了8 個細(xì)菌屬和7 個真菌屬作為風(fēng)味生產(chǎn)的功能性核心菌群。王春艷等[26]采用高通量測序技術(shù)研究了新疆伊犁牧區(qū)傳統(tǒng)手工奶酪,研究發(fā)現(xiàn)奶酪中存在493 種細(xì)菌屬和780種細(xì)菌種,優(yōu)勢細(xì)菌屬為雷爾氏菌屬,優(yōu)勢乳酸菌屬為乳桿菌屬,瑞士乳桿菌為奶酪中的優(yōu)勢乳酸菌種。
菌種對發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味起到了至關(guān)重要的作用,發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)不同,發(fā)酵蔬菜口味也大不相同,其風(fēng)味物質(zhì)的變化與微生物的代謝密切相關(guān),因此對發(fā)酵蔬菜的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,能更好的提高產(chǎn)品品質(zhì)。Peng 等[27]采用高通量測序來描述海南省發(fā)酵蔬菜微生物群的多樣性,研究發(fā)現(xiàn)其核心菌群為發(fā)酵乳桿菌,戊糖乳桿菌和魏氏桿菌。燕平梅等[28]采用PCR-DGGE 指紋圖譜技術(shù)研究了9種市售發(fā)酵蔬菜,發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌廣泛存在于所有的發(fā)酵蔬菜中,消化乳桿菌和短乳桿菌為酸菜的優(yōu)勢菌群,彎曲乳桿菌和短乳桿菌為泡菜的優(yōu)勢菌群,食用糖乳桿菌為醬菜的優(yōu)勢菌群,彎曲乳桿菌為浙江榨菜優(yōu)勢菌群。
大豆中含有難以被人體吸收的植酸、抗原蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子[29],而豆制品發(fā)酵過程中通過微生物的相互作用,可以將難以吸收的大分子物質(zhì)分解,從而增加其營養(yǎng)價值,而通過對發(fā)酵微生物群落的研究能更好改善其營養(yǎng)價值,保證產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定。劉亞棟等[30]利用高通量測序描述了22 個腐乳的微生物多樣性,研究發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬、鞘氨醇桿菌、Wautersiella、Rummelii bacillus、鹽厭氧菌屬、四聯(lián)球菌屬、不動桿菌屬和假單胞菌屬為腐乳的優(yōu)勢菌群。李曉然等[31]利用高通量測序檢測了云南豆豉中微生物群落多樣性,研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬(總序列的72%)和芽孢桿菌屬(總序列的8%)為優(yōu)勢菌群。耿予歡等[32]采用PCR-DGGE 指紋圖譜技術(shù)對醬油中微生物多樣性進(jìn)行了研究,優(yōu)勢菌群為魏斯菌屬、類腸膜魏斯菌、費氏檸檬酸桿菌、腸桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌、嗜鹽四聯(lián)球菌和非培養(yǎng)的腸桿菌屬。
傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的種類豐富,各種微生物代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)也數(shù)目繁多,因此研究風(fēng)味物質(zhì)與微生物的相關(guān)性對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)展有著重大的意義。目前在分析風(fēng)味物質(zhì)與微生物的相關(guān)性常用的方法有:主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA),聚類分析(Cluster analysis,CA)和偏最小二乘法回歸分析(Partial least squares regression,PLS),嶺回歸分析(Ridge Regression),正交偏最小二回歸乘法回歸分析(OPLS)[33]等。
主成分分析的應(yīng)用十分廣泛,其主要目的是對高維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理[34],它將原來互相具有相關(guān)性的眾多數(shù)據(jù),重新組合為不具相關(guān)性的一組綜合指標(biāo)。其處理方法是將原來的P 個指標(biāo)進(jìn)行線性組合,作為新的一個綜合指標(biāo),通常選取一個線性指標(biāo)F1,以其方差Var(F1)表示,若第一主成分不足以表示原來所有指標(biāo)所蘊含的信息量,則再選取第二主成分(F2),此時需要Cov(F1,F(xiàn)2)=0,依次類推至第P 個主成分(Fp)[35]。在研究發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性時,在將所有的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化之后,選取少量主成分,進(jìn)行主成分分析,通過各主成分的貢獻(xiàn)率,從而分析出微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性。該方法目前被廣泛運用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)分類以及風(fēng)味分析等方面[36]。
聚類分析是一種簡化數(shù)據(jù)的方法,其實質(zhì)是將物理的或者抽象的對象,在相似的基礎(chǔ)上進(jìn)行分組,從而分成由相似對象組成的多個類的過程,同類中的對象應(yīng)該具有很大的相似性,而不同類的對象應(yīng)該有很大的相異性。聚類與直接分類的區(qū)別在于聚類所要求劃分的類是未知的,因此聚類分析是一種探索性的分析,使得聚類分析可以從樣本數(shù)據(jù)本身的變化規(guī)律出發(fā),根據(jù)研究對象的特征進(jìn)行自動分類。如姜元華等[37]在研究酵母品種與披薩面胚品質(zhì)的相關(guān)性時,通過聚類分析將5 種酵母分為了4 類。趙加茜、朱衛(wèi)豐等[38]在研究發(fā)酵蟲草菌粉氨基酸含量差異時,通過聚類分析將16 種氨基酸聚為5 類,隨機(jī)選擇其中的5 個變量能夠準(zhǔn)確反映發(fā)酵蟲草菌粉氨基酸的質(zhì)量,能夠有效區(qū)別不同發(fā)酵蟲草菌粉類產(chǎn)品,結(jié)合主成分分析和聚類分析能夠客觀評價發(fā)酵蟲草菌粉類產(chǎn)品的質(zhì)量。
偏最小二乘法是主成分分析法所產(chǎn)生的衍生物,故PLS 集主成分分析、相關(guān)性分析以及回歸建模3 種分析方法為一體,是一種十分便利的多元數(shù)據(jù)分析方法[39]。偏最小二回歸乘法是一種多因變量(Y)對多自變量(X)的回歸建模方法,相比較于普通多元線性回歸方法,PLS 能更大限度的利用全部數(shù)據(jù)信息,其在完成回歸建模的同時還完成了對數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的簡化[40]。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,由于微生物菌群數(shù)量繁多,各種微生物合成代謝機(jī)制復(fù)雜,一般的回歸分析方法很難分析出風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的相關(guān)性。在現(xiàn)代分子測序技術(shù)的快速發(fā)展下,人們才得以通過PLS 等方法對此進(jìn)行研究。如Liu 等[41]在焦磷酸測序技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合偏最小二乘回歸分析法,證明了黃酒的發(fā)酵過程是一個與十多個屬相關(guān)的多菌株共發(fā)酵過程,Liu等人在發(fā)酵過程中共鑒定出64 種揮發(fā)性化合物。王洪偉等[42]通過GC-MS 法結(jié)合PLS 法,在煙熏臘肉中共鑒定出6 種愈創(chuàng)木酚類和6 種烷基酚類,確定了酚類化合物是煙熏臘肉的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。肖作兵等[43]研究甜橙油中風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性時,通過GC-MS 法及感官評價,結(jié)合PLS 法得出檸檬烯、己醛等15 種物質(zhì)是甜橙油中的主要風(fēng)味物質(zhì)。
嶺回歸分析的實質(zhì)是偏最小二乘法的改良方法,主要用于處理共線性的數(shù)據(jù)分析處理,嶺回歸方法舍棄了偏最小二乘法所具備的無偏性特征,通過對部分病態(tài)數(shù)據(jù)的舍去,使得到的回歸數(shù)據(jù)更加偏向?qū)嶋H,但同時其精度也有所降低。在數(shù)據(jù)中含有較多病態(tài)數(shù)據(jù)或存在共線性問題時,嶺回歸方法通過舍棄無偏性,使得回歸分析結(jié)果具有較大的實用價值[44]。鄭蓉建等[45]通過嶺回歸方法檢測谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)物濃度,在保證模型精度的前提下優(yōu)化了模型結(jié)構(gòu),降低了模型復(fù)雜度。
正交偏最小二回歸乘法是為了解決PLS 方法中提取的成分解釋能力不均勻的問題而產(chǎn)生的,通過先用正交信號修正法將數(shù)據(jù)中的正交分量進(jìn)行過濾后,再運用PLS 法進(jìn)行建模,使得模型具有更好的解釋能力及預(yù)測能力,提高了模型的解釋度以及透明度[46]。在研究風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性時,可通過O2PLS 模型對微生物相對豐度及風(fēng)味物質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析,可得出二者之間的相關(guān)性的重要性指標(biāo)(VIP(pred)),選擇VIP(pred)含量較高的微生物與風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析,從而得出微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性。
傳統(tǒng)發(fā)酵食品一直因為其獨特的風(fēng)味而深受全世界各國消費者的喜愛,發(fā)酵食品的產(chǎn)味物質(zhì)有醇、酯、醛、酮、酸、硫化物、呋喃、酚等各類化合物,這些化合物構(gòu)成了發(fā)酵食品獨特的風(fēng)味[50]。然而,在發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生一些不良風(fēng)味,當(dāng)其中的某些具有不良風(fēng)味的物質(zhì)超過一定劑量時,便會產(chǎn)生異味。目前傳統(tǒng)發(fā)酵食品中主要的異味物質(zhì)有醇類、硫化物、醛類、多肽和氨基酸(表1)。
醇類是糖、氨基酸等成分在霉菌、酵母菌、細(xì)菌等微生物的作用下生成的。在食品發(fā)酵過程中,由氨基酸分解所產(chǎn)生的各種醇類物質(zhì)如正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等,都會使食品呈現(xiàn)出苦味,正丁醇苦味較小,正丙醇苦味較重,還會產(chǎn)生具有刺激性的青草味和辣味,異丁醇苦味極重。此外,由酵母代謝產(chǎn)生的酪醇,在其含量較低時會帶來柔和的香氣,但其含量升高時會帶來重而長的苦味[56]。
食品中的硫化物主要是由于微生物的次級代謝反應(yīng)產(chǎn)生的,如在酒發(fā)酵過程中的硫化氫是由酵母的硫代謝反應(yīng)產(chǎn)生的,二甲基硫是通過酵母還原二甲基亞砜產(chǎn)生的。此外光化學(xué)反應(yīng)、熱化學(xué)反應(yīng)也會導(dǎo)致硫化物的生成。揮發(fā)性硫化物是十分重要的一類呈味物質(zhì),但其在食品中的閾值一般較低,不同的硫化物在食品中呈現(xiàn)出不同的氣味特征,硫化物能產(chǎn)生如香草味、果味等有益的風(fēng)味,但也會產(chǎn)生很多異味,如硫化氫呈臭雞蛋味,硫醇呈辣蘿卜味[57]。此外還有一些硫化物如二甲基硫在含量較低時可增強口感,但其含量超過閾值時呈腐爛蔬菜味。
乙醛是酒類中主要的醛類,也是酸奶中主要的香氣物質(zhì),但其含量過高時,會產(chǎn)生辛辣的青草氣味,乙醛是酵母把糖轉(zhuǎn)化為乙醇時產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,在乳酸菌產(chǎn)乳酸過程中,乙醛也可由核酸、氨基酸、丙酮酸代謝產(chǎn)生[58]。除乙醛外,丙烯醛具有辛辣的臭氣,且對人體健康有嚴(yán)重?fù)p傷,丙烯醛是最簡單的不飽和醛,可通過多不飽和脂肪酸氧化,氨基酸降解等途徑產(chǎn)生,丙烯醛在面包、奶酪及酒精飲料等發(fā)酵食品中含量高于一般食品[59]。
表1 傳統(tǒng)發(fā)酵食品的主要異味物質(zhì)
發(fā)酵食品的原料往往都含有大量的蛋白質(zhì),因此在發(fā)酵過程中不可避免的有肽的產(chǎn)生,尤其是由糧食谷物釀造而成的酒類,其中含有大量的肽,而大部分的肽都是苦味肽。如在奶酪發(fā)酵過程中會有一些不良風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生,主要便是由苦味肽引起的,在蛋白質(zhì)水解后,肽鏈中的苦味氨基酸或短肽便暴露出來,接觸味蕾從而產(chǎn)生苦味[60]。
在發(fā)酵體系中,產(chǎn)異味的物質(zhì)可能有酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、霉菌或其他雜菌等。如酵母代謝途徑中,酪氨酸產(chǎn)生的酪醇,產(chǎn)生了重而久的苦味;酵母在合成纈氨酸途徑中,由于一部分ɑ-乙酰乳酸瀉出酵母外,進(jìn)行氧化脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的雙乙酰,在啤酒中視為生青味的主要呈味物質(zhì)[61]。在葡萄酒發(fā)酵過程中,乳酸菌對氨基酸的脫羧作用,會產(chǎn)生如組胺、腐胺和尸胺之類的生物胺,從而產(chǎn)生一種“鼠臭味”[54];在發(fā)酵乳中,由乳糖經(jīng)過糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸是重要的中間產(chǎn)物,丙酮酸可以在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙醛,從而產(chǎn)生辛辣的青草氣息。醋酸菌是公認(rèn)的葡萄酒腐敗微生物,它能將乙醇氧化為乙酸從而產(chǎn)生具有刺激性的酸味[62];此外醋酸菌在缺少糖原的情況時,會將乙醇氧化成乙醛,從而產(chǎn)生異味。霉菌是發(fā)酵食品產(chǎn)生霉味的主要原因。發(fā)酵時若感染雜菌,導(dǎo)致發(fā)酵異常時,會產(chǎn)生丙烯醛,呈現(xiàn)出刺辣味,且?guī)в袧庵氐某掷m(xù)性苦味。
傳統(tǒng)發(fā)酵食品的原料大多富含蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)。這些物質(zhì)本身,或經(jīng)特殊加工如熱處理等后本就會呈現(xiàn)部分風(fēng)味[63];而食品的發(fā)酵環(huán)境大都富含多種微生物,因此,發(fā)酵體系中存在由各類微生物產(chǎn)生的復(fù)雜酶系,這些酶會將營養(yǎng)物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為風(fēng)味前體物質(zhì);再結(jié)合微生物本身的其他代謝產(chǎn)物,后期發(fā)酵中,所有物質(zhì)之間錯綜反應(yīng),產(chǎn)物復(fù)雜,呈現(xiàn)特別的風(fēng)味。
酒類飲品的風(fēng)味決定于醇、醛、酸、酯等物質(zhì)。這些物質(zhì)的含量比或濃度高低決定了酒體的風(fēng)味,甚至決定該產(chǎn)品是否無毒害。由于生化反應(yīng)的復(fù)雜多變,各物質(zhì)相互牽制,含量變化息息相關(guān),因此通過探究整個風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑可以從根本上指導(dǎo)風(fēng)味物質(zhì)的調(diào)控。
乙酸是酒類重要的呈味物質(zhì),而一些高級醇和乙醛在含量過高時有害人體健康,有研究通過強化乙酸的合成或外加乙酸從整體上達(dá)到調(diào)控醇、醛、酸、酯等風(fēng)味物質(zhì)生成的目的,適當(dāng)增加了乙酸的含量,減少了釀酒酵母高級醇及乙醛等微量風(fēng)味物質(zhì)的生成[64]。在針對櫻桃酒酒品優(yōu)化的研究中,證明發(fā)酵工藝條件中的溫度、pH值、SO2及酵母添加量等分別與不同特征風(fēng)味物質(zhì)含量成正(負(fù))相關(guān)[65]。
因此,通過改變發(fā)酵條件或外加某種化合物均可影響到整體風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑,進(jìn)一步達(dá)到控制風(fēng)味物質(zhì)含量的目的。
微生物菌群及其代謝途徑是發(fā)酵工藝的核心,除了原料乳質(zhì)量和發(fā)酵工藝條件的控制,掌握發(fā)酵過程中微生物的代謝途徑對風(fēng)味控制具有重要作用。以酸奶為例,其主要風(fēng)味物質(zhì)如乙醛、雙乙酰等是由乳酸菌的糖酵解產(chǎn)物乳酸通過進(jìn)一步的代謝反應(yīng)生成的。有研究詳細(xì)論述了雙乙酰、乙醛的生成途徑及調(diào)控方法,并簡述了通過此種調(diào)控方式改變這兩種風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)量從而達(dá)到改善乳品風(fēng)味的目的[66-67]。
上述調(diào)控部分風(fēng)味物質(zhì)的方式有一定效果,但若根據(jù)需要任意改變風(fēng)味則會受到限制。為了確定各風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑,最根本的方式是清楚它們的基因及表達(dá)。然而由于發(fā)酵中微生物種類的復(fù)雜多樣,是無法得知每種微生物的代謝途徑并將它們聯(lián)系在一起的。利用宏基因組學(xué)的技術(shù)便能夠簡化這個問題。改變環(huán)境條件以控制基因的表達(dá)即可達(dá)到調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)含量的目的。有研究[68]將基因表達(dá)、風(fēng)味物質(zhì)代謝以及優(yōu)勢菌群密切結(jié)合,全面論述了多組學(xué)技術(shù)聯(lián)用在乳品風(fēng)味代謝調(diào)控中的應(yīng)用。一項關(guān)于瑞士奶酪風(fēng)味調(diào)控的研究中,利用宏基因組學(xué)技術(shù)證明溫度的高低及催熟的時長能夠影響相關(guān)基因的表達(dá),從而改變該種奶酪的風(fēng)味[69]。
針對傳統(tǒng)發(fā)酵乳品的調(diào)控,將更大程度傾向確定微生物功能基因表達(dá)與風(fēng)味物質(zhì)代謝途徑間的聯(lián)系,這也同樣適用于其他發(fā)酵食品。
豆制發(fā)酵食品的風(fēng)味亦取決于微生物的代謝活動以及酶催化的反應(yīng)。以傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬為例,其風(fēng)味物質(zhì)形成主要受到原料、發(fā)酵菌種、制曲酶系等內(nèi)部因素,以及紫外線照射、pH 值和溫度等外界條件的影響。這些因素與微生物代謝和酶反應(yīng)聯(lián)系密切,因此可利用其進(jìn)行風(fēng)味調(diào)控。原料中加入有益發(fā)酵的輔料如小麥,小麥麩皮中富含的亞油酸[70]等物質(zhì)可參與酯類物質(zhì)形成,能夠強化后期小分子風(fēng)味物質(zhì)的生成,從而達(dá)到風(fēng)味優(yōu)化的目的。
發(fā)酵豆醬的風(fēng)味物質(zhì)中,通常酯類物質(zhì)最為豐富,所以酯類物質(zhì)對最終風(fēng)味的影響十分重要。劉超蘭等[71]在關(guān)于豆瓣醬的研究中使耐鹽性乳酸菌與酵母菌協(xié)同作用,發(fā)現(xiàn)隨著陳釀進(jìn)行,耐鹽性乳酸菌成為優(yōu)勢菌,且其代謝產(chǎn)物和來自于酵母菌的乙醇能夠抑制雜菌、促進(jìn)酯化、形成更多呈味氨基酸。
調(diào)味品的種類最為繁雜,包括食鹽、醬油、食醋、蠔油等等,且大多數(shù)豆制品如豆豉、豆瓣醬等也都屬于調(diào)味品。醬油和食醋可以歸為典型的發(fā)酵型調(diào)味品。
醬油由豆類發(fā)酵而成,氨基酸是其重要的營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)。除上述針對豆制品的風(fēng)味調(diào)控方法外,還可以利用生物、化學(xué)甚至物理手段來提高發(fā)酵中的酶活或者減少一些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的損失。添加一些酶制劑如γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,能夠促進(jìn)相關(guān)反應(yīng)(γ-谷氨酰化合物水解等)進(jìn)行,以提升醬油的鮮味;或者加入甜味劑等可以滿足人們感官需求的香辛料[72]。有研究表明,在醬油發(fā)酵過程中進(jìn)行超高壓處理可以提高醬曲蛋白酶的活性,從而有益于呈味氨基酸的形成[73]。
Wang 等[18]利用宏基因組學(xué)技術(shù),篩得到鎮(zhèn)江香醋中與風(fēng)味物質(zhì)密切相關(guān)的核心菌群;Jiang等[74]找出了紅曲霉醋中重要呈味物質(zhì)與優(yōu)勢菌群之間的相關(guān)性,有了這些關(guān)系網(wǎng)絡(luò),對于風(fēng)味的調(diào)控也就有了進(jìn)一步的方向。由于調(diào)味品原料來源的多樣性,針對其風(fēng)味調(diào)控的方法也更為豐富,但始終不能夠脫離對于微生物代謝途徑及風(fēng)味物質(zhì)基因表達(dá)的研究。將基因表達(dá)這種微觀表征與發(fā)酵工藝等宏觀條件越是和諧的聯(lián)用在一起,效果則越好。
泡菜因其口感獨特,深受消費者喜愛。它是以蔬菜為原料經(jīng)由密閉發(fā)酵而制成的發(fā)酵食品。這類食品發(fā)酵過程常常出現(xiàn)在家庭當(dāng)中,發(fā)酵的衛(wèi)生條件對發(fā)酵結(jié)果的影響較大,因此需要格外注意控制。
如果能夠利用測序技術(shù)找出其優(yōu)勢菌群[75],并構(gòu)建核心微生物菌群代謝的途徑,那么可以借此篩選、培養(yǎng)并利用具有功能優(yōu)勢的菌種。這樣不僅能夠得到更高質(zhì)量的蔬菜發(fā)酵制品,還能達(dá)到抑制不利菌生長的目的;如若篩得新的有益菌種,還可以突破原有風(fēng)味和口感,創(chuàng)造更多可能性。張先琴等[76]對中國四川地區(qū)的泡菜制品進(jìn)行了詳細(xì)研究,發(fā)現(xiàn)一種植物乳桿菌在該地的泡菜發(fā)酵中起到重要作用,不僅使這種特色泡菜具有更好的色香味,還明顯抑制了其中亞硝酸鹽的生成。
發(fā)酵食品的風(fēng)味物質(zhì)調(diào)控是通過物理學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)等理論知識綜合應(yīng)用實現(xiàn)的。雖然風(fēng)味物質(zhì)生產(chǎn)調(diào)控可以在發(fā)酵工藝中的每一步進(jìn)行,即可通過改善每一步操作實現(xiàn),但其核心的手段是通過了解微生物菌群狀態(tài)、利用宏基因?qū)W技術(shù)建立風(fēng)味物質(zhì)代謝途徑,從根本上調(diào)控以得到更受人們歡迎的風(fēng)味和口感。
異味并不指某種特定的味道,而是人們品嘗時,所得的與固有的香、味對比之下不協(xié)調(diào)的味道。為滿足人們對食品的感官需求,需要找到合適的調(diào)節(jié)方式來控制異味的產(chǎn)生。異味產(chǎn)生的原理和香味如出一轍,不同點在于是否受人們歡迎。有產(chǎn)生香味的物質(zhì),就有產(chǎn)生異味的物質(zhì);且一些呈味物質(zhì)由于濃度高低可產(chǎn)生不同味道;多種物質(zhì)之間的配比或復(fù)雜的相互作用亦影響著最終味道的呈現(xiàn)。因此產(chǎn)生香味和異味的物質(zhì)難以徹底區(qū)分。
有研究綜合分析了白酒中可能產(chǎn)生的各類型異味物質(zhì)(苦味、澀味、糠味、霉味等)及預(yù)防措施。該研究表明,酒類飲品的異味控制主要從原輔料合理選擇與配比、發(fā)酵各工藝嚴(yán)格控制衛(wèi)生合格、產(chǎn)品創(chuàng)新調(diào)配方式等3 個方面控制酒的異味產(chǎn)生以改變酒的品質(zhì)[77]。白酒發(fā)酵過程中會產(chǎn)生窖泥臭的具體物質(zhì)為4-甲基苯酚(p-cresol PC),針對此類臭味物質(zhì),有專利提出通過生物手段,即控制發(fā)酵菌種(加入功能菌抑制同屬原有菌)來達(dá)到控制白酒中最終PC 含量的目的[78]。Park 等[79]以一種發(fā)酵豆醬為原料進(jìn)行研究。通過對比,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前加入薏苡并與大豆以4∶1 進(jìn)行配比,能夠使該種豆醬異味降到最低。Jeong 等[80]對韓國一種典型水煮泡菜的整個發(fā)酵過程進(jìn)行了分析,揭示了整個過程中微生物的群落演替以及代謝產(chǎn)物變化。他們推測一種無糖酵母可能導(dǎo)致該食品產(chǎn)生異味。為解決這類問題,需要掌握微生物的變化,才能夠探明異味物質(zhì)產(chǎn)生的時間和原因,從而作出相應(yīng)的措施以抑制或剔除異味物質(zhì)。
綜上所述,發(fā)酵食品的風(fēng)味調(diào)控和異味調(diào)控異曲同工,均源自原輔料、發(fā)酵工藝及環(huán)境、微生物代謝活動、產(chǎn)生的各風(fēng)味物質(zhì)之間復(fù)雜的反應(yīng);相應(yīng)的解決措施大同小異,通過物理、化學(xué)、生物學(xué)的手段控制原輔料質(zhì)量、發(fā)酵菌種種類及數(shù)量、發(fā)酵工藝條件,以調(diào)配各風(fēng)味物質(zhì)濃度及配比,從而得到所需要的風(fēng)味。
目前對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的研究比較多,發(fā)酵食品種類繁多,風(fēng)味物質(zhì)以醇類、酸類等為主;異味物質(zhì)以醇類、硫化物、醛類、多肽和氨基酸為主;微生物大多以乳酸菌屬、酵母菌屬、糖多孢菌屬、曲霉菌屬等為主。為更好的研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產(chǎn)香機(jī)制和微生物的相關(guān)性,可利用主成分分析(PCA)等技術(shù)研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)分類以及風(fēng)味分析,為發(fā)酵食品的標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。而對于產(chǎn)品品質(zhì)的把控,主要以風(fēng)味物質(zhì)和異味物質(zhì)的調(diào)控為主,通過控制原輔料質(zhì)量、發(fā)酵菌種種類及數(shù)量、發(fā)酵工藝條件等來達(dá)到所需風(fēng)味。
近年來,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和多組學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,聯(lián)合偏最小二回歸乘法回歸分析等分析方法,使得我們可以進(jìn)一步了解發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的相關(guān)性。今后發(fā)酵食品的主要研究應(yīng)從如下幾個方面著手:(1)應(yīng)用更加先進(jìn)的儀器,更科學(xué)的分析方法,進(jìn)一步深入了解發(fā)酵食品中的風(fēng)味物質(zhì)與微生物之間的相關(guān)性,明確各發(fā)酵食品的主要或特征風(fēng)味物質(zhì)成分;(2)深入研究特征風(fēng)味物質(zhì)與微生物菌群之間的關(guān)系,篩選出主要產(chǎn)香微生物并應(yīng)用到食品發(fā)酵過程中,使得其風(fēng)味口感更加優(yōu)良;(3)將純種發(fā)酵劑運用到食品發(fā)酵過程中,盡量避免異味風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生,提高發(fā)酵食品的風(fēng)味品質(zhì)。