冷凍電鏡技術(shù)在白酒微觀形態(tài)觀測中的應(yīng)用

程鐵轅

（成都海關(guān)技術(shù)中心宜賓分部國家酒類檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

當(dāng)前，在白酒微觀形態(tài)觀測等領(lǐng)域，主要應(yīng)用的觀測儀器有原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM）等，其中，原子力顯微鏡在液體樣品微觀觀測方面存在一個(gè)很大的不足之處，需要在無塵臺(tái)上自然風(fēng)干后方可用于顯微鏡觀察[1]，致使白酒中大多數(shù)揮發(fā)性微量成分無法被觀測到，損失了大量重要的樣品信息，因此，該方法僅能觀測到白酒樣品中部分信息。冷凍電子顯微鏡技術(shù)（cryo-electron microscopy）簡稱冷凍電鏡，近年來，隨著樣品制備觀測等技術(shù)[2-3]的持續(xù)進(jìn)步以及冷凍電鏡軟硬件[4-5]的改進(jìn)，冷凍電鏡技術(shù)獲得了飛躍式發(fā)展[6]，其在生物大分子復(fù)合體和細(xì)胞（細(xì)胞器）超微結(jié)構(gòu)觀測方面的技術(shù)優(yōu)勢，極大地推動(dòng)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的飛速發(fā)展。相較于其他技術(shù)，冷凍電鏡技術(shù)具有一個(gè)重要優(yōu)勢，即樣品經(jīng)過低溫冷凍后，能夠最大限度地保存樣品中包含的信息。冷凍電鏡成像獲取的照片信息，需要結(jié)合圖像分析技術(shù)才能挖掘出更多的有價(jià)值信息，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Convolutional Neural Network，CNN）作為一種前饋型的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是目前深度學(xué)習(xí)技術(shù)領(lǐng)域中極具代表性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之一，近年來，在圖像分析和處理領(lǐng)域取得了一系列突破性的研究成果[7-8]，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有強(qiáng)大的特征學(xué)習(xí)與分類能力，在圖像分類等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其特點(diǎn)是不需要針對具體特征，即可實(shí)現(xiàn)特征提取的封裝。當(dāng)前，透射電鏡技術(shù)在晶體結(jié)構(gòu)觀測上應(yīng)用廣泛[9-10]，卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于中藥材等顯微特征圖像識(shí)別研究方面[11]已有相關(guān)報(bào)道，本研究主要采用冷凍透射電子顯微鏡技術(shù)，擬將冷凍電鏡技術(shù)與深度學(xué)習(xí)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片信息進(jìn)行鑒別分類，以期為白酒微觀形態(tài)觀測等領(lǐng)域提供一種全新的研究思路和分析視角，本文將冷凍電鏡技術(shù)與深度學(xué)習(xí)技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用，主要針對國內(nèi)市場上普遍存在的白酒摻假實(shí)際，但該技術(shù)在白酒及液體食品中的應(yīng)用范圍絕不會(huì)僅限于此，未來，該技術(shù)應(yīng)該會(huì)在白酒微觀形態(tài)基礎(chǔ)研究、白酒酒質(zhì)評價(jià)研究、白酒年份酒研究、白酒產(chǎn)地追溯研究、白酒摻假鑒別研究及液體食品相關(guān)研究等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

試驗(yàn)樣：購自川南某白酒企業(yè)固態(tài)發(fā)酵法原酒（樣品編號(hào)為1#—5#），購自國內(nèi)市場的某類別摻假白酒（樣品編號(hào)為6#、8#），購自國內(nèi)市場的四川某知名白酒企業(yè)的高端成品酒（樣品編號(hào)為7#、9#、10#），其中，1#：2009 年產(chǎn)一級(jí)原酒；2#：2018 年產(chǎn)一級(jí)原酒；3#：2018 年產(chǎn)優(yōu)級(jí)原酒；4#：2019 年產(chǎn)一級(jí)原酒；5#：2019 年產(chǎn)優(yōu)級(jí)原酒；6#：摻假白酒a；7#：成品酒a；8#：摻假白酒b；9#：成品酒b；10#：成品酒c。

儀器設(shè)備：200 kV 冷凍透射電子顯微鏡（浙江大學(xué)冷凍電鏡中心），儀器型號(hào)：Talos F200C 200 kV（荷蘭FEI 公司）。儀器性能：加速電壓為20～200 kV 高壓，場發(fā)射電子槍；點(diǎn)分辨率≤0.3 nm；信息分辨極限0.15 nm；低溫樣品臺(tái)（可傾轉(zhuǎn)70 度）；配置Ceta 4 k×4 k 相機(jī)；安裝EPU 和FEI Xplore3D數(shù)據(jù)收集軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將2.5 μL 白酒樣品置于銅網(wǎng)（Quantifoil R1.2/1.3）上，通過vitrobot和液態(tài)乙烷將溶劑迅速冷凍成玻璃態(tài)，在配備有Ceta 4 k×4 k 相機(jī)的透射電子顯微鏡（Talos F200C）上，進(jìn)行冷凍電鏡成像，選取36000×、73000×、120000×3種標(biāo)稱的放大倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

采用Matlab 2019a進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原酒微觀形態(tài)

圖1 為2#樣品36000 倍的觀測圖像，多個(gè)圖像中的圓形輪廓是載網(wǎng)1.2/1.3 的孔，由于碳膜上襯度差，一般觀測時(shí)只觀測圓形輪廓內(nèi)部的圖像，圖2為2#樣品73000 倍的觀測圖像，圖3 為2#樣品120000 倍的觀測圖像，圖4 為3#樣品120000 倍的觀測圖像。3 種放大倍數(shù)圖像之間的差異，除了與放大倍數(shù)有關(guān)外，還應(yīng)該與酒體中存在一些懸浮顆粒有關(guān)。如圖所示，深色物質(zhì)為白酒樣品中觀測的目標(biāo)物質(zhì)，從微觀形態(tài)上看，一部分目標(biāo)物呈圓球狀形態(tài)，一部分目標(biāo)物呈鏈狀形態(tài)，圓球狀形態(tài)物質(zhì)在空間觀測上會(huì)有重疊，兩種形態(tài)物質(zhì)在空間上的分布都相對較為均勻。

2.1.2 摻假白酒微觀形態(tài)

圖5 為6#樣品36000 倍的觀測圖像，圖6 為6#樣品73000 倍的觀測圖像，圖7 為6#樣品120000 倍的觀測圖像，圖8為6#樣品73000倍的觀測圖像，均為摻假白酒的微觀形態(tài)圖，從微觀形態(tài)上看，與原酒微觀形態(tài)圖類似，同樣存在一些體積相對較大的圓球狀形態(tài)物質(zhì)和一些體積相對較小的鏈狀形態(tài)物質(zhì)，鏈狀形態(tài)物質(zhì)的分布較為均勻，而圓球狀形態(tài)物質(zhì)分布相對不均。

圖1 2#樣品圖（36000×）

圖2 2#樣品圖（73000×）

圖3 2#樣品圖（120000×）

圖4 3#樣品圖（120000×）

圖5 6#樣品圖（36000×）

圖6 6#樣品圖（73000×）

圖7 6#樣品圖（120000×）

2.1.3 成品酒微觀形態(tài)

圖9 為7#樣品36000 倍的觀測圖像，圖10 為7#樣品73000 倍的觀測圖像，圖11 為7#樣品120000倍的觀測圖像，圖12 為9#樣品36000 倍的觀測圖像。直觀來看，同樣分布了一些體積相對較大的圓球狀形態(tài)物質(zhì)和一些體積相對較小的鏈狀形態(tài)物質(zhì)，與圓球狀形態(tài)物質(zhì)相比，鏈狀形態(tài)物質(zhì)的數(shù)量更多，分布也更加密集均勻。

圖8 8#樣品圖（73000×）

圖9 7#樣品圖（36000×）

圖10 7#樣品圖（73000×）

2.2 數(shù)據(jù)處理

從顯微鏡的照片信息來看，不同類型的白酒樣品在圖像信息上的差異，很難通過肉眼觀察而成功的辨識(shí)區(qū)分，因此，考慮采用深度學(xué)習(xí)算法輔助區(qū)分，提高識(shí)別自動(dòng)化效率，實(shí)現(xiàn)過程為先按照樣品類型將冷凍電鏡圖片進(jìn)行分類，本文共分為3 類，然后采用深度學(xué)習(xí)算法進(jìn)行訓(xùn)練預(yù)測。本文采用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片進(jìn)行鑒別分類時(shí)，相對而言，放大73000 倍和120000倍的圖像較為清晰，同時(shí)，由于采集圖像信息時(shí)，采集的73000 倍的圖像數(shù)據(jù)更為完整，因此，統(tǒng)一選取各白酒樣品的73000 倍的放大倍數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，若采集的120000 倍的圖像數(shù)據(jù)完整，也可用于數(shù)據(jù)處理。

圖11 7#樣品圖（120000×）

圖12 9#樣品圖（36000×）

2.2.1 面向白酒微觀圖像識(shí)別卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

當(dāng)前，基于CNN 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要有LeNet-5、AlexNet、CaffeNet、GoogleNet、DenseNet、VGG、ResNet、MobileNetV2 等，其中，AlexNet、CaffeNet等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，太冗雜，需要大量的時(shí)間和較高的硬件配置去訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且實(shí)測結(jié)果通常不佳。限于篇幅，本文主要采用LeNet-5、ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，對其進(jìn)行微調(diào)改進(jìn)后構(gòu)造白酒微觀圖像分類識(shí)別器。

圖13 圖像處理結(jié)果圖

（1）LeNet-5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在白酒微觀圖像識(shí)別中存在的問題及改進(jìn)方法。LeNet-5作為較為小型的CNN 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最早應(yīng)用于數(shù)字圖像的分類識(shí)別，原始的LeNet-5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)主要是針對0～9 共10 個(gè)數(shù)字圖像分類進(jìn)行設(shè)計(jì)，其輸入圖像大小為32*32，數(shù)字圖像較為簡單。本研究中，LeNet-5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在白酒微觀圖像識(shí)別中主要存在的問題為：由于白酒微觀圖像與數(shù)字圖像的復(fù)雜程度差異較大，所需識(shí)別的類型數(shù)目也不一致，需要對各層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)做進(jìn)一步的研究。針對上述問題，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究后，主要改進(jìn)如下：①增加了ReLU 激活函數(shù)：由于ReLU是一種分段線性函數(shù)，其具有計(jì)算求導(dǎo)簡單，能夠避免深層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中發(fā)生梯度發(fā)散的現(xiàn)象，因此，用來替代傳統(tǒng)的tanh 和sigmoid 激活函數(shù)；②輸出層由10個(gè)神經(jīng)元改成3個(gè)神經(jīng)元。

（2）VGG16、ResNet50、GoogLeNet 等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改進(jìn)。VGG 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是輸入層為224*224*3，輸出層是對應(yīng)的1000 個(gè)物體類別，本研究中類別為3類，因此，將最后的輸出層類別由1000 改為3，輸入層圖像統(tǒng)一調(diào)整為224*224*3 大小格式，且由于本實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練樣本較少，本文主要采用遷移學(xué)習(xí)的方式，遷移學(xué)習(xí)就是利用已有的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（VGG16，ResNet，GoogLeNet 等）進(jìn)行簡單的微調(diào)。保留VGG 網(wǎng)絡(luò)前面原始權(quán)重不變，只訓(xùn)練全連接層。由于GoogLeNet 與ResNet50 網(wǎng)絡(luò)輸入及分類類別數(shù)與VGG16 都相同，因此，基于上述操作，分別采用VGG16，GoogLeNet，ResNet50 網(wǎng)絡(luò)對數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。

2.2.2 基于CNN網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的白酒微觀圖像預(yù)處理

LeNet-5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中白酒微觀圖像預(yù)處理，如圖13 所示，將圖片大小由4096*4224 集體歸一化至32*32 尺寸；ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，將圖片大小由4096*4224 集體歸一化至224*224尺寸。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）采用LeNet-5 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，訓(xùn)練各參數(shù)中batch 大小為128，學(xué)習(xí)率為0.001，迭代次數(shù)為100。具體訓(xùn)練過程中訓(xùn)練樣本正確率變化如圖14所示，圖中橫坐標(biāo)代表訓(xùn)練的迭代次數(shù)，縱坐標(biāo)為訓(xùn)練正確率。由圖14可知，本文針對白酒微觀圖像分類識(shí)別所構(gòu)建的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練白酒微觀圖像過程中達(dá)到了較好的效果，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在訓(xùn)練迭代到第30 次左右時(shí)開始接近收斂，在迭代到50 次時(shí)，樣本訓(xùn)練準(zhǔn)確率趨于穩(wěn)定接近88.89%。

（2）采用VGG16 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，訓(xùn)練各參數(shù)中batch 大小為128，學(xué)習(xí)率為0.001，迭代次數(shù)為50，訓(xùn)練結(jié)果如圖15所示，其訓(xùn)練準(zhǔn)確率達(dá)到88%。

圖15 VGG16網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果圖

（3）采用GoogLeNet 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，訓(xùn)練各參數(shù)中batch 大小為128，學(xué)習(xí)率為0.001，迭代次數(shù)為50，訓(xùn)練結(jié)果如圖16 所示，其訓(xùn)練準(zhǔn)確率達(dá)到94%。

圖16 GoogLeNet網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果圖

（4）采用ResNet50 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，訓(xùn)練各參數(shù)中batch 大小為128，學(xué)習(xí)率為0.001，迭代次數(shù)為50，訓(xùn)練結(jié)果如圖17所示，其訓(xùn)練準(zhǔn)確率達(dá)到96%。

3 結(jié)論

圖17 ResNet50網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果圖

本研究通過將冷凍電鏡技術(shù)與深度學(xué)習(xí)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對白酒樣品的冷凍電鏡成像照片信息進(jìn)行鑒別分類，主要采用了LeNet-5、ResNet50、VGG16、GoogLeNet 等網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，針對白酒微觀圖像分類識(shí)別所構(gòu)建的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在訓(xùn)練白酒微觀圖像過程中達(dá)到了較好的效果，相對而言，ResNet50 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的訓(xùn)練效果最佳，結(jié)果顯示，采用ResNet50 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)，樣本訓(xùn)練準(zhǔn)確率達(dá)到96%。本研究首次將冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用于白酒微觀形態(tài)的觀測，客觀來看，該研究存在一些不足，因冷凍電鏡的實(shí)驗(yàn)成本較高，本文選取的樣本量相對較少，準(zhǔn)確率的提升依賴于大數(shù)據(jù)量，因此，在下一步研究中，將進(jìn)一步加大數(shù)據(jù)的收集，應(yīng)該可以通過訓(xùn)練進(jìn)一步提升準(zhǔn)確率。未來，可以預(yù)見，冷凍電鏡技術(shù)與深度學(xué)習(xí)技術(shù)的結(jié)合，除在白酒微觀觀測方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值外，在液體樣品（食品等）觀測方面也將會(huì)有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。