病毒定量檢測新技術(shù)研究進展

韓 瑞，楊艷麗，師偉偉，郝成武，賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830032）

病毒類產(chǎn)品已經(jīng)越來越多的應用于疫苗、基因治療、癌癥治療等領(lǐng)域。由于其尺寸大、結(jié)構(gòu)復雜、穩(wěn)定性差的特殊結(jié)構(gòu)特征，病毒類生物制品的制備過程相比單體蛋白更具有挑戰(zhàn)性。在病毒類生物制品開發(fā)的過程中，病毒的準確定量至關(guān)重要。病毒的定量方法可以分為四類：（1）測定病毒的感染水平；（2）檢測病毒功能性的結(jié)構(gòu)蛋白；（3）檢測病毒基因組核酸或標記核酸；4）對病毒顆粒進行計數(shù)。測定病毒感染水平是傳統(tǒng)的病毒定量方法，例如空斑形成單位（PFU）、50%組織細胞感染量（TCID50）、以及流式細胞術(shù)測定病毒轉(zhuǎn)導效率等。然而這類檢測方法往往檢測時間長，且只能對具有感染活性的病毒進行檢測，無法滿足滅活后病毒的測定需要。抗體技術(shù)的發(fā)展使得病毒測定的特異性和靈敏度都有顯著提升。但酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）無法區(qū)分完整病毒與降解產(chǎn)物，且是否有合適的抗體是ELISA方法準確性的關(guān)鍵。聚合酶鏈式反應（PCR）和基于結(jié)構(gòu)蛋白的檢測技術(shù)已經(jīng)大大提高了病毒的檢測速度和準確性。近年來，逐漸出現(xiàn)了一些新的技術(shù)，已經(jīng)開始應用于病毒的分析和定量檢測中。這些技術(shù)檢測速度快，并提供更多的病毒信息。本文就近年來出現(xiàn)的病毒定量檢測新技術(shù)，尤其是基于分離和病毒顆粒計數(shù)定量的新技術(shù)及其應用進行介紹，并對這些新技術(shù)在獸用疫苗開發(fā)中的應用作了進一步展望。

1 基于病毒核酸定量的液滴數(shù)字PCR

實時熒光定量PCR方法（RT-qPCR）是能夠定量檢測病毒目的基因擴增數(shù)量的PCR技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展成為廣泛用于多種病毒檢測的技術(shù)，具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點。液滴數(shù)字PCR（ddPCR）是在RT-qPCR基礎(chǔ)上發(fā)展出的新技術(shù)。兩種PCR的原理都是在PCR體系中加入熒光染料或熒光分子標記的寡核苷酸鏈，在PCR擴增過程中與擴增產(chǎn)物結(jié)合并被激發(fā)產(chǎn)生熒光，通過熒光信號探測器監(jiān)測熒光信號的變化來測定目的基因的拷貝數(shù)量，反映病毒含量。二者的區(qū)別主要在于對基因拷貝絕對值的定量方法。常規(guī)RT-qPCR的定量需要采用參照基因的質(zhì)粒DNA作為標準品，稀釋不同濃度后分別作為模板進行PCR，并根據(jù)標準品的Ct值和拷貝數(shù)來繪制標準曲線，然后將病毒樣品所測得的Ct值代入標準曲線獲得相應拷貝數(shù)，因此定量結(jié)果在很大程度上取決于標準物質(zhì)的質(zhì)量。而ddPCR檢測主要采用微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至儀器的微反應器或微滴中，使每個反應器中只存在1個或0個核酸模板。經(jīng)過PCR循環(huán)之后，含有一個核酸分子模板的反應器會檢測到熒光信號，沒有模板的反應器則沒有熒光信號。進一步根據(jù)相對比例和反應器的體積，可以推算出原始溶液中的核酸拷貝數(shù)。目前ddPCR已經(jīng)被報道用于口蹄疫病毒（FMDV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、新型冠狀病毒等的定量。與RT-qPCR比較，ddPCR具有更高的準確度、靈敏度和重現(xiàn)性，并可以實現(xiàn)真正意義上的絕對定量。在采用PCR定量檢測時，引物的設(shè)計，以及RNA病毒的核酸的反轉(zhuǎn)錄過程都需要一定的優(yōu)化和考量，以提高結(jié)果的準確性。此外，由于測得的病毒核酸不一定是病毒顆粒的一部分，可能會大大高估存在的病毒數(shù)。

2 基于分離技術(shù)的定量方法

2.1 高效尺寸排阻色譜法

高效尺寸排阻色譜（HPSEC）是一種基于尺寸大小分離分子的一種非破壞性技術(shù)。HPSEC的色譜基質(zhì)具有孔穴結(jié)構(gòu)，尺寸大的分子不能滲透到基質(zhì)孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；而小分子可完全滲透入內(nèi)，最后流出色譜柱。HPSEC根據(jù)被分離物質(zhì)的紫外吸收峰面積，對照濃度校正曲線進行定量測定。通過選擇不同孔徑大小的色譜基質(zhì)，HPSEC可以實現(xiàn)不同的分離測定。幾十年來，HPSEC已經(jīng)成為分析抗體等尺寸較小的蛋白質(zhì)的常用方法，但在病毒的檢測中應用相對較少，主要障礙在于HPSEC基質(zhì)的孔徑大小有限，而病毒的尺寸較大，往往會在外水體積被淋洗出來。然而，隨著色譜填料制備技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已有基質(zhì)孔徑大于100nm的商業(yè)分析柱，從而可以分析大多數(shù)大型病毒、病毒樣顆粒，以及10～100nm范圍內(nèi)的聚集體。

目前HPSEC方法已經(jīng)成功用于FMDV、流感病毒、慢病毒等的定量檢測。利用HPSEC定量檢測滅活FMDV，可以在30 min內(nèi)選擇性地檢測完整病毒146S，具有很好的重復性和準確性。HPSEC不僅能實現(xiàn)對FMDV的定量，并能給出純度信息，用于快速篩選純化工藝條件。使用HPSEC定量評估146S的解離率，實現(xiàn)了抗原穩(wěn)定劑的篩選。此外，HPSEC還可與多角度激光光散射（MALLS）探測器耦合，獲得更多病毒信息。MALLS檢測器不僅能給出HPSEC不同吸收峰物質(zhì)的平均摩爾質(zhì)量和平均尺寸，還可計算顆粒數(shù)量實現(xiàn)對病毒進行定量，而無需校準曲線。HPLC設(shè)備的普及、簡單和自動化操作以及HPSEC各種規(guī)格的分析柱使其對研究機構(gòu)、制藥公司和監(jiān)管機構(gòu)的產(chǎn)品開發(fā)或質(zhì)量監(jiān)控非常有吸引力。

2.2 非對稱場流分級

非對稱流場流動分級（AF4）是適用于表征納米和微米系統(tǒng)的分離技術(shù)。與HPSEC不同，AF4不需要分離基質(zhì)，而是將病毒等樣品進樣至一個底部為多孔膜的、有連續(xù)流的狹窄通道。通過水平方向和垂直方向上的力，在層流方向產(chǎn)生一個拋物線的流速曲線，中間的流速最快，通道的邊緣流速最慢。這種形式使得小分子比大分子先洗脫。相比HPSEC，AF4檢測更加無損生物樣品結(jié)構(gòu)。通過調(diào)整進樣的時間，層流流速及外場力的大小等參數(shù)，AF4可以在很寬的尺寸范圍內(nèi)分離分子（103～109Da；粒徑從2nm～0.5～1μm），因此特別適合病毒和聚集體的分析。AF4除了根據(jù)分離樣品的紫外吸收峰面積定量，同樣可與MALLS聯(lián)用，對顆粒數(shù)進測定實現(xiàn)對病毒顆粒的定量。Tatiana等采用AF4-MALLS對細胞培養(yǎng)液中的流感病毒進行定量測定，具有很好的重復性，RSD為1.9%。與其他技術(shù)包括HPSEC-MALLS、q-PCR、TCID50等比較，結(jié)果具有可比性，證明AF4-MALLS是檢測流感病毒的一種可靠技術(shù)，具有靈敏度和重復性。與此同時，由于AF4的操作靈活性，對操作人員的專業(yè)要求也更高。

2.3 毛細管電泳

毛細管電泳（CE）是一類以毛細管為分離通道，以高壓電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品組分之間電泳淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的新型液相分離技術(shù)。其中毛細管區(qū)帶電泳（CZE）根據(jù)物質(zhì)在緩沖溶液中表現(xiàn)的荷質(zhì)比產(chǎn)生不同的電遷移速率從而進行分離，在具有大尺寸的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、病毒、病毒樣顆粒、脂質(zhì)體的分析上具有獨特的優(yōu)勢。

CZE已被報道分離和測定脊髓灰質(zhì)炎病毒、人鼻病毒（HRV），并能區(qū)分不同血清型的HRV和甲型流感病毒。相比其它檢測方法，CZE具有檢測速度快的優(yōu)勢。Tricht等采用CZE對不同生產(chǎn)過程中的腺病毒進行定量檢測，單個樣品的總運行時間最快在5min以內(nèi)，30個樣品的總運行時間少于4h，而RT-qPCR為3d。在優(yōu)化CZE毛細管類型和緩沖液組成后，CZE方法的定量精密度小于5%RSD，準確度為90%～110%，測定結(jié)果與RT-qPCR等其他方法相當。CZE近期被報道能夠?qū)崿F(xiàn)對多價FMDV疫苗中不同血清型的病毒146S分別定量測定。經(jīng)分析，F(xiàn)MDV A型與O型抗原存在較大的電荷差異，在CZE中具有不同的保留時間，從而實現(xiàn)良好的分離并能分別定量。而超速離心法與HPSEC均無法區(qū)分尺寸相近的兩種血清型病毒，因此只能得出總病毒含量。與ELISA方法相比，ELISA難以完全區(qū)分完整病毒與亞病毒顆粒，而CZE根據(jù)病毒的特征峰可將其與亞病毒顆粒區(qū)分開。以上報道顯示了CE在病毒定量檢測方面的潛力。

3 基于顆粒計數(shù)的定量方法

3.1 納米粒子跟蹤分析

納米顆粒跟蹤分析（NTA）是利用粒子光散射特性的一種非侵入式和非分離檢測技術(shù)，可簡單、快速地表征直徑30～1000 nm的顆粒的尺寸分布和數(shù)量密度。其原理是通過顯微鏡和電荷耦合器件(CCD)照相機，捕獲視野內(nèi)每個粒子的布朗運動隨時間的函數(shù)分布圖，然后將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變?yōu)榱Ｗ拥牧黧w動力直徑和粒子濃度。操作簡單、檢測速度快是NTA的優(yōu)勢。由于NTA方法同時測量單個粒子，因此最快可以在5 min內(nèi)完成檢測。NTA已經(jīng)應用于慢病毒、外泌體、腺病毒、流感病毒的定量檢測。相比其它顆粒檢測技術(shù)，NTA在定量分析的同時，還可分析所得樣品的尺寸分布，提供更多病毒信息。需要注意的是，為了保證檢測結(jié)果的準確性，NTA檢測過程中需要保持顆粒數(shù)在107～109VP/mL。與HPSEC-M ALL相比，NTA對多分散樣品，例如未經(jīng)純化的病毒樣品的表征準確性較差。采用熒光NTA可提高對病毒測定的選擇性。Szakacs等通過熒光標記的病毒特異性受體對病毒進行熒光標記，定量分析了人類呼吸道合胞病毒（RSV）。

3.2 病毒計數(shù)儀

病毒計數(shù)儀（VC）是一種類似流式細胞儀，適用于液體樣本中的病毒定量的設(shè)備，由美國ViroCyt公司開發(fā)。其原理是采用兩種不同的熒光染料分別對病毒的蛋白質(zhì)及核酸進行染色。染色后的病毒通過檢測室時，被激光激發(fā)，被標記的蛋白與核酸分別產(chǎn)生相應熒光信號。通過對同時具有蛋白與核酸熒光信號的病毒顆粒計數(shù)進行定量。該檢測技術(shù)具有分析速度快，樣品制備簡單的優(yōu)點。經(jīng)過30min左右的染色，VC可在10min之內(nèi)，最短5min完成對帶有熒光染料的病毒顆粒分析。VC檢測要求病毒尺寸大于25nm，以保證足夠的檢測信號和可靠的結(jié)果。其可靠的測量范圍是5×105～1×109VP/mL。Stepp等采用VC對一系列病毒包括腺病毒、桿狀病毒、冠狀病毒、單純皰疹病毒等進行定量測定，并將結(jié)果與TCID50、透射電鏡（TEM）進行比較，具有較好的相關(guān)性。楊小蓉等采用了VC對滅活FMDV疫苗的146S進行定量測定，變異系數(shù)為1.15%～3.57%，表明結(jié)果有較好的重復性。作者進一步將VC檢測結(jié)果與超速離心方法進行比較，結(jié)果略有差異但具有一致性，且VC極大的縮短了檢測時間。

3.3 可調(diào)電阻式脈沖傳感

可調(diào)電阻式脈沖傳感(TRPS)是Izon公司開發(fā)的一種實時的納米顆粒分析技術(shù)，能夠測量尺寸范圍從60nm～2μm納米粒子，適合尺寸較大的病毒分析。對病毒類產(chǎn)品的檢測不僅包括純度分析和定量，最理想的情況下是實時獲得更多的病毒性質(zhì)參數(shù)，比如尺寸分布、電荷性、濃度等。TRPS相比其它病毒定量方法，不僅能測得病毒的顆粒數(shù)，并能給出樣品的粒度分布并同時測定zeta電位，闡明樣品的電荷性質(zhì)。這項技術(shù)基于庫爾特原理，采用具有一個可調(diào)節(jié)孔隙的納米孔，當充滿電解液的納米孔上下兩邊施加一定的電壓時，納米孔內(nèi)會產(chǎn)生離子電流。當樣品中的分子依次通過納米孔時，會產(chǎn)生電阻脈沖信號，分子流速與其濃度成正比，所以可以準確測定不同尺寸的顆粒濃度；該脈沖信號大小與顆粒的體積成正比，因此可以逐個測得每個顆粒的尺寸。與此同時，通過分析單個顆粒在不同驅(qū)動力下電阻式脈沖的持續(xù)時間，跟已知尺寸、表面電荷和個數(shù)濃度的標準樣品比較，可逐個測定顆粒的表面電荷。

TRPS已經(jīng)被用于定量分子慢病毒和輪狀病毒等。Ikeda等使用TRPS定量測定了慢病毒載體。結(jié)果表明，TRPS所測得的顆粒濃度（7.99×1010VP/mL）明顯高于病毒滴度（1.08×106VP/mL），但低于RT-qPCR法（2.33×1012VP/mL）。這一結(jié)果也表明不同的病毒定量檢測方法之間結(jié)果比較的困難。由于慢病毒滴度檢測受病毒載體及檢測參數(shù)的影響，不同實驗室及操作方法的檢測結(jié)果實際上難以互相比較。但基于顆粒分析的技術(shù)確實有可能受細胞碎片等干擾物的影響而過高的估計了病毒數(shù)量。因此研究者提出經(jīng)過一定分離方法去除干擾性的雜質(zhì)后，獲得的結(jié)果更加準確。Heider等在TRPS檢測前通過SEC去除部分雜質(zhì)，再分析慢病毒載體的濃度，并通過顆粒大小和表面電荷遷移率表征慢病毒載體制劑，用于監(jiān)測病毒的生產(chǎn)和純化。TRPS的結(jié)果不僅檢測到了SEC不同收集組分中的顆粒濃度，還對所收集顆粒的尺寸分布進行了分析，得到的平均尺寸與NTA的結(jié)果具有一致性。通過比較不同種類病毒產(chǎn)品的電荷遷移率，可以反映病毒的表面化學性質(zhì)的改變，因此TRPS可以進一步發(fā)展為鑒定不同病毒類型或狀態(tài)的工具。

4 總結(jié)與展望

病毒的定量檢測對指導病毒類生物制品的研發(fā)和質(zhì)量控制具有重要意義。目前已有多種基于不同原理的病毒定量檢測技術(shù)。正是由于檢測原理不同，不同的定量檢測方法之間往往存在較大差異。例如感染性滴度與總病毒數(shù)的結(jié)果絕對值相差可達10~1000倍。不同的檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點，因此在建立病毒定量方法時，需要基于多個因素進行評估，包括對病毒性質(zhì)的關(guān)注點，樣品純度及濃度，方法的準確性、檢測速度，儀器成本，方法的可得性等，選擇適合本產(chǎn)品的檢測技術(shù)。值得關(guān)注的是，本文介紹的新技術(shù)不僅已經(jīng)在人用疫苗和基因治療產(chǎn)品的研發(fā)中得到應用，ddPCR、HPSEC、VC、CZE等方法也已經(jīng)在獸用疫苗的檢測中嶄露頭角。相信隨著國內(nèi)獸用疫苗研發(fā)和生產(chǎn)水平的提高，這些新技術(shù)會越來越多的在提升疫苗質(zhì)量中發(fā)揮作用。