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    巨噬細胞ABCG1介導的氧化固醇外流的研究

    2021-03-05 02:59:24劉平原沈思琪武燕翔陳連鳳嚴曉偉
    中國心血管雜志 2021年1期

    劉平原 沈思琪 武燕翔 陳連鳳 嚴曉偉

    100730 中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科

    動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)以內(nèi)皮下脂質(zhì)蓄積、粥樣斑塊形成及動脈管腔狹窄為特征,可引起冠心病、腦梗死、外周血管病等一系列疾病,是世界范圍內(nèi)最常見的疾病和死亡原因[1]。ABCG1是跨膜半轉(zhuǎn)運體,在巨噬細胞中高表達并介導膽固醇外流,對體內(nèi)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)有重要作用。本課題組前期臨床研究提示人類巨噬細胞ABCG1的表達可能具有促AS作用[2],其機制尚待進一步研究。近來研究發(fā)現(xiàn)氧化固醇,如7β-羥基膽固醇(7β-hydroxycholesterol,7β-OHC)和7-酮基膽固醇(7-ketochlesterol,7-KC)等[3],與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。本實驗通過構(gòu)建ABCG1敲低單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株,測定其氧化固醇外流情況,以探究ABCG1影響AS發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    THP-1細胞(ATCC細胞庫),RPMI1640培養(yǎng)基、FBS(GIBCO公司),引物(上海生物工程公司),慢病毒表達載體、DH5α、轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE2000、NBD-膽固醇(Invitrogen公司),DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas公司),質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司),兔抗人ABCG1抗體(Abcam公司),兔抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)IgG(中杉金橋生物公司),PMA、HDL(Sigma公司),ox-LDL(北京協(xié)生生物公司),質(zhì)粒測序由Invitrogen公司完成。

    1.2 穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

    根據(jù)ABCG1基因序列設(shè)計shRNA oligo,將其連接到pGMLV-SC5RNAi載體構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒,選取測序正確的質(zhì)粒進行病毒包裝;按照MOI=80利用慢病毒感染THP-1細胞,經(jīng)有限稀釋法篩選出穩(wěn)定敲低細胞株;提取穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞總蛋白,并進行Western blot鑒定ABCG1表達。ABCG1 shRNA上游序列5’-gatccGGACCTGCTGAATGGACATCTT TCAAGAGAAGATGTCCATTCAGCAGGTCCTTTTTTg-3’,下游序列5’-aattcAAAAAAGGACCTGCTGAA TGGACATCTTCTCTTGAAAGATGTCCATTCAGCAGG TCCg-3’。陰性對照上游序列5’-gatccGTTCT CCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTT CGGAG-3’,下游序列5’-aattcACGCGTAAAAAA GTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGAC ACGTTCGGAGAACg-3’。

    1.3 巨噬細胞氧化固醇外流測定

    1.3.1 細胞處理及樣本收集 THP-1細胞以3×105/孔的密度接種于24孔板,以100 ng/ml PMA促進巨噬化。72 h后更換培養(yǎng)基,以無血清培養(yǎng)基饑餓8 h,以50 μg/ml 氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)干預。24 h后,PBS洗滌細胞三次,加入50 μg/ml 高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)作為外流接受體誘導外流4 h,并設(shè)置空白對照組。收集外流液,12 000 rpm離心10 min,去除細胞碎片。PBS洗滌細胞三次,每孔加入10%甲醇水溶液+1%乙酸處理細胞5 min,收集裂解液。向外流液與細胞裂解液中加入3倍體積沉淀劑沉淀蛋白,10 000 rpm離心10 min,取5 μl進行脂質(zhì)分析。

    1.3.2 樣本分析 通過LC-MS/MS(DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀 Thermo Q EXACTIVE)進行樣本分析。將收集到的樣本經(jīng)ACQUITY BEH C18色譜柱分離 (1.7 μm,2.1×50 mm)。隨后進行一個從70%水-30%乙腈到100%乙腈的8 min梯度洗脫,設(shè)定流速為0.25 ml/min。采用電噴霧正離子源,以二級數(shù)據(jù)依賴性掃描的檢測模式,對樣本進行定性與定量分析。7β-OHC和7-KC標準品繪制標準曲線用于樣本定量。

    1.4 統(tǒng)計學方法

    2 結(jié)果

    2.1 ABCG1基因小干擾RNA慢病毒表達載體構(gòu)建及穩(wěn)轉(zhuǎn)株ABCG1蛋白表達情況

    轉(zhuǎn)染后,細胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光,表明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常,目的質(zhì)粒熒光標記基因表達正常(圖1);ABCG1敲低組(ABCG1-sh)ABCG1蛋白表達水平(0.173 5±0.034 35,n=3)明顯低于陰性對照組(0.755 6±0.044 54,n=3),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),見圖2,提示ABCG1穩(wěn)定敲低細胞株構(gòu)建成功。

    圖1 轉(zhuǎn)染后細胞熒光觀察

    圖2 各組細胞ABCG1蛋白水平

    2.2 ABCG1低表達對氧化固醇外流率的影響

    通過LC-MS/MS技術(shù)對待測樣品進行了氧化固醇定性與定量分析,發(fā)現(xiàn)與無外流接受體的空白對照組相比,HDL作為外流接受體的組別,誘導氧化型膽固醇外流率增加(7-KC:28.6%±2.3%比4.1%±0.7%,P<0.001;7β-OHC:35.5%±5.7%比3.7%±1.1%,P<0.001),見圖3A。與陰性對照組相比,ABCG1敲低組氧化型膽固醇的外流率降低(7-KC:16.1%±3.1%比24.7%±2.3%,P<0.05;7β-OHC:15.7%±0.7%比33.1%±3.7%,P<0.001),見圖3B。

    圖3 巨噬細胞氧化固醇外流率

    2.3 ABCG1低表達對巨噬細胞胞內(nèi)氧化固醇沉積的影響

    胞內(nèi)氧化固醇沉積量通過細胞總蛋白進行校正,結(jié)果顯示,與對照組比較,ABCG1低表達巨噬細胞胞內(nèi)氧化固醇沉積增加[7-KC:(6.61±1.28)μg/mg比(2.13±0.08)μg/mg,P<0.05;7β-OHC:(1.61±0.51)μg/mg比(0.65±0.20)μg/mg,P<0.05],見圖4。結(jié)合圖3結(jié)果表明巨噬細胞ABCG1低表達可抑制氧化固醇7β-OHC及7-KC外流,增加胞內(nèi)氧化固醇沉積。

    圖4 巨噬細胞胞內(nèi)氧化固醇沉積

    3 討論

    巨噬細胞攝取ox-LDL形成泡沫細胞是AS的早期病理標志[1]。構(gòu)建ABCG1敲低巨噬細胞模型可為ABCG1及AS的研究創(chuàng)造條件。本課題組前期通過嘌呤霉素篩選法構(gòu)建了ABCG1敲低混合穩(wěn)轉(zhuǎn)株,其是由多個單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)成的克隆群。因其外源片段的整合位點不同,不同的單克隆表達效率不同[5]。此外,由于體外細胞多屬于病胞系,其基因組呈現(xiàn)不確定的特點,即使是同類細胞,不同細胞個體基因組背景都存在差異。因此,本研究對前期ABCG1敲低細胞模型的構(gòu)建進行改進,通過有限稀釋法獲得了ABCG1敲低單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株,其為含有穩(wěn)定整合外源片段的單個細胞的擴增,ABCG1的表達效率穩(wěn)定,且基因組背景相對單一,可去除細胞群體的干擾因素,進一步減少實驗結(jié)果的干擾因素。

    本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ABCG1低表達巨噬細胞促凋亡基因Bok與Bid表達增高[6],細胞凋亡加快。結(jié)合本實驗結(jié)果,其可能與ABCG1介導的氧化固醇外流密切相關(guān)。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)ABCG1低表達的巨噬細胞7-KC及7β-OHC外流減少,胞內(nèi)氧化固醇沉積增加。氧化固醇由膽固醇通過酶催化氧化途徑及非酶催化氧化途徑形成,在單核細胞/巨噬細胞中沉積可誘導細胞凋亡[7]。Tesoriere等[8-10]發(fā)現(xiàn),當7-KC及7β-OHC與巨噬細胞共孵育時,細胞氧化性DNA損傷增加,p21、Bax及細胞色素C表達水平增強,線粒體凋亡途徑激活,細胞凋亡增加。

    巨噬細胞ABCG1在膽固醇逆轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用,而其對AS的作用,在多項動物及臨床研究中結(jié)果并不一致,目前仍存在爭議[11]。Tarling等[12]發(fā)現(xiàn)ABCG1基因敲除小鼠AS病變區(qū)域巨噬細胞凋亡增加,粥樣斑塊體積縮小。以上研究及本實驗結(jié)果提示我們,巨噬細胞ABCG1低表達造成胞內(nèi)氧化固醇堆積,加速細胞凋亡,可能是ABCG1低表達抗AS的相關(guān)機制。

    利益沖突:無

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