腸道集聚性大腸桿菌基因組脫氧核糖核酸提取方法比較與改進(jìn)

楊煥蝶，楊金玉，陳相艷，王易芬，鄭琳琳，陳蕾蕾

(1. 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a. 農(nóng)產(chǎn)品研究所，b. 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,c. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100； 3. 山東省濟(jì)南生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東濟(jì)南250101)

致瀉性腸桿菌是一類(lèi)重要的食源性病原菌，是細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌。腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)于1987年被首次分離自一名患有頑固性腹瀉的智利兒童，是一類(lèi)新型的致瀉性大腸桿菌[1]。EAEC的形態(tài)與一般大腸桿菌無(wú)異，為革蘭氏陰性短桿菌，最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，無(wú)特殊的營(yíng)養(yǎng)要求[2]。EAEC不侵入腸道上皮細(xì)胞，但能引起腸道液體蓄積，定植于腸道黏膜；不產(chǎn)生熱穩(wěn)定性或熱不穩(wěn)定性腸毒素，也不產(chǎn)生志賀毒素；能分泌腸毒素及細(xì)菌毒素，可誘導(dǎo)黏膜炎癥。由于EAEC能對(duì)Hep-2細(xì)胞形成集聚性黏附，因此也被稱(chēng)為Hep-2細(xì)胞黏附性大腸桿菌[3-5]。EAEC感染是發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家暴發(fā)和非暴發(fā)環(huán)境中腹瀉的重要原因，導(dǎo)致兒童及成人急性或持續(xù)性腹瀉[6-7]。EAEC感染也與沒(méi)有腹瀉的兒童營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)[8]，除了腸產(chǎn)毒性大腸桿菌感染外，EAEC也是旅行者腹瀉的主要原因[9-10]。EAEC以食物和水為主要傳播媒介，通過(guò)糞口途徑傳播，人類(lèi)普遍易感，成年人的中毒癥狀表現(xiàn)為中度腹瀉，嬰幼兒感染后多表現(xiàn)為2周以上的持續(xù)性腹瀉[11-13]。目前，EAEC已在世界范圍內(nèi)由散發(fā)轉(zhuǎn)為暴發(fā)流行。

食源性致病菌引起的食品安全問(wèn)題嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全，科學(xué)、快速、準(zhǔn)確的食源性病原菌檢測(cè)是預(yù)防和控制食源性病原菌引起的食品安全問(wèn)題的重要手段。食源性病原菌檢測(cè)的傳統(tǒng)方法是微生物學(xué)培養(yǎng)鑒定法，操作繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，特異性不足，靈敏度低。另一種檢測(cè)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，適用范圍廣。PCR技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定方法相比靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)更短，與其他新興的檢測(cè)技術(shù)相比操作簡(jiǎn)單，成本低，因此得到廣泛的應(yīng)用[14-15]。目前在我國(guó)國(guó)家參考物質(zhì)資源共享平臺(tái)上適用于食品微生物檢測(cè)的核酸參考物質(zhì)較少，基本停留在由菌種保藏機(jī)構(gòu)提供純培養(yǎng)物的階段，因此，針對(duì)食源性病原菌聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性，對(duì)照或定量標(biāo)準(zhǔn)的基因組脫氧核糖核酸(DNA)參考物質(zhì)較為匱乏的這一現(xiàn)象，建立食源性病原菌檢測(cè)用核酸參考物質(zhì)的快速制備方法尤為重要。

目前，市場(chǎng)上可供細(xì)菌基因組提取的試劑盒多種多樣，但是不同的試劑盒各有特點(diǎn)，適用范圍也各有不同，需要大量制備基因組樣品，并且針對(duì)不同菌株的特點(diǎn)進(jìn)行篩選，甚至是優(yōu)化。本文中通過(guò)比較4種細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)EAEC基因組DNA的提取效果，并根據(jù)所得基因組DNA的濃度和純度，對(duì)其中的2種細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行優(yōu)化，以提高EAEC基因組DNA的濃度和純度，為大量制備EAEC核酸參考物質(zhì)提供高效的提取方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

EAEC菌株菌種保藏號(hào)為CICC24186，其特征基因引物序列如表1所示，特征毒力基因引物參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.6—2016[5]。

表1 集聚性大腸桿菌(EAEC)特征基因及其引物序列

1.2 試劑與儀器

主要試劑包括：腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Tris-硼酸(TBE)緩沖粉劑，生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂糖，北京全式金生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)；脫氧核糖核酸分子量標(biāo)記D15000+2000，天根生物技術(shù)有限公司；GelStain核酸染料，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

細(xì)菌基因組提取試劑盒為OMEGA細(xì)菌基因組提取試劑盒(D3350-01)、天根細(xì)菌基因組提取試劑盒(DP302)、全式金細(xì)菌基因組提取試劑盒(EE161-01)及寶生物細(xì)菌基因組提取試劑盒(9763)。

主要儀器包括：立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；雙人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯(北京)有限公司；Eppendorf離心機(jī)，德國(guó)埃德本公司；水浴鍋，北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司；制冰機(jī)，北京德天佑科技公司；ThermoNanodrop 2000/2000c型超微量紫外分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司；凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

稱(chēng)取腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基干粉24.5 g，溶于1 L蒸餾水中，分裝后于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后以10 mL/L接種量接種集聚性大腸桿菌，放置于37 ℃的搖床上以轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)約12 h。

2.2 試劑盒法提取細(xì)菌基因組

細(xì)菌基因組提取步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取到的基因組樣品保存溫度為-20 ℃。

2.3 基因組濃度、純度及完整性的檢測(cè)

取2 μL基因組樣品與適量的上樣緩沖液混勻后，上樣于含核酸染料GelStain的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠中，以電壓150 V恒壓電泳35 min，緩沖體系采用TBE緩沖液，電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中分析基因組樣品的完整性和純度。

2.4 集聚性大腸桿菌特征毒力基因的檢測(cè)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.6—2016中提供的集聚性大腸桿菌特征毒力基因的引物序列(見(jiàn)表1)合成引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，以集聚性大腸桿菌基因組為模板，克隆其特征毒力基因astA、aggR、pic、uidA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增體系如表2所示，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增程序如表3所示。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物，點(diǎn)樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠中，以電壓175 V恒壓電泳25 min，緩沖體系采用TBE緩沖液。電泳結(jié)束后，于凝膠成像儀中觀察聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果。

表2 集聚性大腸桿菌特征基因聚合酶鏈反應(yīng)體系

表3 集聚性大腸桿菌特征毒力基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序

3 分析與討論

3.1 不同試劑盒對(duì)集聚性大腸桿菌基因組的提取效果

分別吸取1 mL培養(yǎng)過(guò)夜的集聚性大腸桿菌菌懸液，按照4種細(xì)菌基因組提取試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法提取集聚性大腸桿菌基因組，不同試劑盒分別提取的集聚性大腸桿菌基因組純度及濃度見(jiàn)表4?；蚪M質(zhì)量濃度為10.8～30.4 mg/L，其中，天根試劑盒提取的基因組DNA的質(zhì)量濃度最低，只有10.8 mg/L； 寶生物試劑盒提取的質(zhì)量濃度最高，但也僅為30.4 mg/L。純凈的基因組DNA在波長(zhǎng)為260 nm處的吸光度A260與波長(zhǎng)為280 nm處的吸光度A280的比值為1.8，較純凈的基因組DNA的A260與波長(zhǎng)為230 nm處的吸光度A230的比值大于2.0，所提取的基因組DNA的A260/A280的值小于1.66，可能樣品有蛋白質(zhì)污染；A260/A230的值小于1.12，推測(cè)基因組DNA樣品可能含有有機(jī)試劑或鹽離子等污染物。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。4種試劑盒所提取的基因組條帶完整性良好，無(wú)核糖核酸(RNA)污染，但是用4種方法所提取的基因組的濃度均較低。制備核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)前期的基因組樣品提取工作將耗費(fèi)大量的資源，為提高產(chǎn)率，需要對(duì)提取步驟進(jìn)行必要的優(yōu)化。使用4種試劑盒提取EAEC基因組DNA的提取工作耗時(shí)由短到長(zhǎng)的順序是寶生物、天根、全式金、OMEGA，其中OMEGA試劑盒提取過(guò)程耗時(shí)最長(zhǎng)，天根試劑盒提取濃度過(guò)低。從試劑盒購(gòu)買(mǎi)價(jià)格考慮，OMEGA試劑盒(50次)花費(fèi)648.00元，而天根試劑盒(50次)花費(fèi)420.00元；但是該試劑盒需自備RNase A，總費(fèi)用合計(jì)720.00元，在4種試劑盒中價(jià)格最高，因此，后續(xù)研究將對(duì)寶生物試劑盒及全式金試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法進(jìn)行優(yōu)化。

表4 不同試劑盒提取的集聚性大腸桿菌基因組純度、濃度及價(jià)格的比較

M—D15000+2000 DNA Marker；1—3—寶生物試劑盒提取的EAEC基因組；4—6—天根試劑盒提取的EAEC基因組；7—9—全式金試劑盒提取的EAEC基因組；10—12—OMEGA試劑盒提取的EAEC基因組。圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.2 寶生物試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

使用寶生物試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法中的革蘭氏陽(yáng)性菌提取方法，并且增加了對(duì)于菌懸液的處理過(guò)程。取1 mL培養(yǎng)過(guò)夜的EAEC菌懸液，離心分離棄上清后加入500 μL的Buffer BS試劑，加入溶菌酶至終質(zhì)量濃度為2 g/L。在第一步的材料處理時(shí)加入蛋白酶K后在56 ℃的孵育時(shí)間由原來(lái)的30 min延長(zhǎng)至40 min。

優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的純度及濃度見(jiàn)表5。優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組的質(zhì)量濃度為34.1 mg/L，與優(yōu)化前的提取質(zhì)量濃度30.4 mg/L相比，濃度提高較少，提取過(guò)程耗時(shí)較優(yōu)化前增加了1.5 h，基因組A260/A280及A260/A230的值低于優(yōu)化前的。電泳分析結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，優(yōu)化后提取的基因組條帶清晰，無(wú)RNA污染，說(shuō)明優(yōu)化后提取基因組效果未能達(dá)到快速提取大量高質(zhì)量基因組的目的。

表5 優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的集聚性大腸桿菌基因組的純度及濃度

M—天根D15000+2000 DNA Marker；1—4—優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的EAEC基因組。圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析優(yōu)化后寶生物試劑盒提取的集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.3 全式金試劑盒提取集聚性大腸桿菌基因組方法優(yōu)化

采用全式金細(xì)菌基因組DNA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)提取方法中革蘭氏陽(yáng)性菌提取方法進(jìn)行集聚性大腸桿菌基因組的提取，并對(duì)提取方法改進(jìn)。

第一步材料處理。在菌液的重懸液中加入200 μL RB11試劑(含溶菌酶4 mg)后在37 ℃的孵育時(shí)間由原來(lái)的1 h改為40 min，加入蛋白酶K后在55 ℃的孵育時(shí)間由原來(lái)的15 min延長(zhǎng)至30 min，洗脫后測(cè)定收集到溶菌酶裂解處理后的基因組DNA樣品的純度及濃度，見(jiàn)表6。由表可以看出，經(jīng)溶菌酶孵育處理后EAEC基因組DNA的提取量增大了近3倍。電泳分析結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，所提取的基因組條帶均一，無(wú)RNA污染。在提取過(guò)程中，加入試劑LB11與蛋白酶K經(jīng)55 ℃孵育30 min后，菌液仍非常黏稠，因此推測(cè)EAEC菌體細(xì)胞成分較為復(fù)雜，可能是蛋白質(zhì)含量較高，加入的蛋白酶K未能完全消化菌體蛋白，導(dǎo)致裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)基因組DNA的提取，后續(xù)實(shí)驗(yàn)提高蛋白酶K的用量至40 mg/L。

表6 溶菌酶裂解處理后集聚性大腸桿菌基因組提取的純度和濃度

EAEC—集聚性大腸桿菌；M—D15000+2000 DNA Marker；1—3—溶菌酶裂解后提取的EAEC基因組。圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析溶菌酶裂解處理后的集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

增大蛋白酶K的用量后，菌體裂解液黏稠度明顯降低，將其轉(zhuǎn)移到吸附離心柱中離心后，液體易于通過(guò)吸附膜，因此，為了提高基因組的濃度，取3倍體積菌體裂解液用于提取基因組。表7為提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度。由表可知，采用革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA提取方法并增大1倍蛋白酶K的用量后，集聚性大腸桿菌基因組的濃度達(dá)到了197.7 mg/L，較標(biāo)準(zhǔn)方法提取的基因組的濃度增大了約14.5倍，但基因組純度沒(méi)有提高，推測(cè)所提取的基因組中仍有蛋白質(zhì)等碳水化合物或無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)試劑的污染。由于所提取的基因組DNA用于制備定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，因此模板DNA的純度對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因組的特征基因影響較小。瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，所提取的EAEC基因組條帶明顯，未見(jiàn)降解，無(wú)RNA污染，表明該優(yōu)化方法能有效提高基因組DNA的濃度。

表7 提高蛋白酶K用量后提取集聚性大腸桿菌基因組的純度和濃度

EAEC—集聚性大腸桿菌；M—天根D15000+2000 Marker；1—4—EAEC基因組。圖4 瓊脂糖凝膠電泳分析提高蛋白酶用量后的腸道集聚性大腸桿菌(EAEC)基因組

3.4 集聚性大腸桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.6—2016的方法，對(duì)所提取的集聚性大腸桿菌基因組進(jìn)行檢測(cè)。以所提取的集聚性大腸桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增其特征基因astA、aggR、pic和uidA，并對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖5所示。

astA、aggR、pic基因?yàn)榧坌源竽c桿菌的特征毒力基因，uidA基因可在97%的大腸桿菌內(nèi)檢測(cè)到，4個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，PCR產(chǎn)物條帶大小與目的片段大小相符，說(shuō)明所提取的基因組確為集聚性大腸桿菌基因組。盡管所提取基因組的純度指標(biāo)A260/A280和A260/A230均未達(dá)到1.8，但是根據(jù)毒力基因擴(kuò)增結(jié)果可知，所制備的基因組樣品對(duì)于定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響，可用于制備定性核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。

M—全式金D2000+200 bp Marker; 1為astA(102 bp); 2—aggR(400 bp);3—pic (1 111 bp); 4為uidA(1 487 bp)。圖5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)集聚性大腸桿菌(EAEC)的特征毒力基因

4 結(jié)論

對(duì)比使用多種細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取EAEC基因組的提取效果可知，由于EAEC細(xì)胞裂解液非常黏稠，不利于后續(xù)的基因組提取，因此提取到的EAEC基因組的濃度及純度均非常低。4種試劑盒中全式金試劑盒提取步驟簡(jiǎn)便，耗時(shí)少，因此對(duì)該試劑盒提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)增加30 min的溶菌酶孵育、1倍蛋白酶K的用量及2倍體積的菌體裂解液，EAEC基因組的提取濃度提高了14.5倍，以所提取的基因組為模板，PCR檢測(cè)EAEC的特征毒力基因，結(jié)果顯示3個(gè)特征毒力基因均為陽(yáng)性，滿足用于制備食品檢測(cè)用核酸定性參考物質(zhì)的要求。本文中的研究為大量提取核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的前期樣品奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為探索基因組提取困難的細(xì)菌基因組的提取方法提供了參考。