電針對骶上脊髓損傷后逼尿肌亢進大鼠逼尿肌中環(huán)腺苷酸和蛋白激酶A含量及肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化的影響

艾坤，許明，劉瓊，鄧石峰，劉繼生，祁芳，易細芹，瞿啟睿，張泓

湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙市410208

神經源性膀胱是一類由于神經系統病變導致膀胱和尿道功能障礙，進而產生一系列下尿路癥狀的疾病總稱。脊髓損傷是導致神經源性膀胱發(fā)生的主要原因之一[1]。

骶上節(jié)段損傷是脊髓損傷最常見的類型，占全部脊髓損傷患者的80%以上[2]。因骶上節(jié)段橫斷性損傷，同時骶髓排尿中樞的反射弧保存完整，高位排尿中樞對骶髓排尿中樞的抑制作用消失，骶髓排尿中樞反射活動增加，逼尿肌反射亢進，出現無抑制性收縮，膀胱內壓增高，這是導致膀胱功能障礙的主要原因。臨床上，抑制逼尿肌收縮的一些藥物被證實可有效改善骶上脊髓損傷所致的膀胱功能障礙，緩解其癥狀[3]。

臨床及實驗研究證實[8-9]，電針干預骶上脊髓損傷后神經源性膀胱，可增大膀胱最大容量，降低膀胱內壓，改善膀胱的順應性。且因電針具有操作簡便、無明顯副作用及費用低廉等獨特優(yōu)勢，目前已在臨床廣泛應用于該病的治療。近年來關于該領域的機制研究越來越多，大部分針灸作用機制的研究主要集中在脊髓及周圍神經通路上，選取逼尿肌作為研究靶點的較少。

逼尿肌由平滑肌細胞構成，平滑肌收縮是一種鈣依賴的過程，胞漿內游離Ca2+濃度增高，可使肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)活化，引起平滑肌收縮[4]。目前研究認為，平滑肌細胞的舒張主要與細胞內環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的作用密切相關，其下游蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)可使MLCK磷酸化(p-MLCK)而失去活性，影響MLCK 和Ca2+-鈣調蛋白(calmodulin,CaM)復合物的親和力，使其對鈣離子失敏，引起平滑肌舒張[5-7]。

本實驗觀察脊髓T10水平損傷大鼠脊髓休克期后，經電針干預，逼尿肌內cAMP、PKA 含量及p-MLCK水平的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級Sprague-Dawley 雌性大鼠60 只，體質量200～230 g，月齡2～3個月，購自湖南斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SCXK(湘)2013-0004。所有動物分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度24～26°C、濕度50%～70%，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗，使用許可證號SYXK(湘)2013-0005。動物實驗過程獲得湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，所有實驗動物按照國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》予以護理及使用。

1.2 主要試劑和儀器

水合氯醛，產品批號20131031：國藥集團化學試劑有限公司。青霉素鈉，產品批號15050401-2：哈藥集團。橡皮生肌膏，產品批號20150413：湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院自制藥。Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅、大鼠cAMP、PKA 酶聯免疫試劑盒：美國SIGMA公司。HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗鼠IgG：美國PROTEINTECH 公司。RIPA 裂解液：北京普利萊基因技術有限公司。SuperECL Plus 超敏發(fā)光液：美國THERMO PIERCE 公司。顯影液、定影液：中國WELLBIOLOGY公司。p-MLCK抗體：英國ABCAM 公司。無水乙醇、二甲苯、蘇木素染液、中性樹膠等試劑均系國產分析純，所有實驗用水均為DEPC處理過的無菌雙蒸水。

WZ-50C6微量注射泵：浙江史密斯醫(yī)學儀器有限公司。MP150-WSW 多通道生理記錄儀：美國BIOPAC 公司。SDZ-V 型華佗牌電針治療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。TGL-18R 臺式冷凍離心機：深圳黑馬公司。QL-901 旋渦混合器：江蘇其林貝爾公司。164-5050 電泳儀：美國BIO-RAD 公司。DYCZ-24EN電泳槽、DYCZ-40A 轉膜儀：北京六一生物科技有限公司。PW-812 全自動酶標洗板機、MB-530 多功能酶標分析儀：深圳匯松科技發(fā)展有限公司。

1.3 動物分組

動物分組采用二次隨機法，60只大鼠按隨機數字表抽取12 只作為空白組，12 只作為假手術組。空白組不予造模，假手術組僅于相應部位做皮膚和肌肉切開處理，不切斷脊髓。剩余36只采用脊髓橫斷法制作神經源性膀胱模型，經后肢運動功能及膀胱排尿情況評價確定成功的神經源性膀胱模型大鼠二次隨機抽取12只作為模型組、12只作為電針組。

1.4 方法

1.4.1手術方法

大鼠術前24 h 禁食不禁水，于術前2 h 腹腔注射青霉素鈉20 萬U，預防感染。10%水合氯醛300 mg/kg 腹腔麻醉后，大鼠以俯臥位捆綁于鼠板上固定備皮，采用Hassan Shaker脊髓橫斷法基礎上加以改良制作骶上脊髓損傷模型[10]。脊髓橫斷部位以浮肋連接的T13椎骨作為骨性標志向上定位T8椎骨以定位脊髓T10節(jié)段。確定手術部位后做標記并消毒皮膚，以標記點為中心行背正中切口，長約3 cm，依次切開表皮和皮下筋膜，使用玻璃分針鈍性分離兩側豎脊肌，充分暴露棘突和椎板。用顯微咬骨器從尾側向頭側咬除T8椎板直至兩側椎弓根，充分暴露脊髓，用牙科鉤沿橫斷椎間隙橫向小幅度鉤出脊髓，手術刀切斷脊髓后反復刮掃以確定脊髓完全橫斷，確定無神經纖維殘留。由內向外逐層縫合。手術過程嚴格無菌操作，術后觀察大鼠的生命體征是否平穩(wěn)。

1.4.2術后護理

手術后置于電熱毯上保溫，使肛溫維持37 ℃以上。術后傷口及周圍碘伏消毒，每天3 次；術后48 h內每12 h 腹腔注射青霉素鈉20 萬U，48 h 后每24 h 注射青霉素鈉20萬U，直至術后第7天；7 d后若有大鼠出現血尿、膿尿時，每24 小時腹腔注射青霉素鈉20萬U，直至尿液澄清。大鼠單籠飼養(yǎng)，每日總飲水量＜30 ml，防止因膀胱大量尿潴留導致腎臟及膀胱壁損傷。每8小時(早、中、晚)用Crede法對大鼠進行人工輔助排尿，注意手法和力度，密切觀察大鼠的生命體征，防止損傷膀胱。50%乙醇溶液擦拭大鼠的身體(腹部及雙下肢)以防止壓瘡，有壓瘡形成的用橡皮生肌膏涂抹以促進傷口愈合。因手術后大鼠下肢感覺缺失，為防止其自噬，在其下肢涂上苦蘋果噴霧劑。

1.4.3成模及剔除標準

術后第12 天對模型大鼠脊髓橫斷情況進行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)運動評分。將動物放入開口盆，輕敲盆壁，使其爬行，觀察動物的臀、膝、踝關節(jié)行走、軀干運動及其協調情況。滿分21 分。0 分為無可見雙后肢活動；分數增加，大鼠軀干及雙后肢運動功能逐漸改善；21分為持續(xù)性掌面移動、持續(xù)性協調步態(tài)、足趾持續(xù)抓地、尾巴翹起、軀干穩(wěn)定、活動過程中身體與主動爪位置始終平行。兩人采用單盲法對評價結果分別進行記錄。

成模標準：①前肢行走時后肢處于拖動狀態(tài)，BBB 評分為0 分；②手術麻醉及脊髓休克期，出現潴留，需手法輔助排尿；脊髓休克期過后逼尿肌出現無抑制性收縮，膀胱脹大不明顯，且大鼠下腹部及籠內墊料潮濕。

剔除標準：出現雙后肢自主運動，脊髓休克期后大量尿潴留或自主排尿、自噬或死亡的情況。

1.5 腧穴與電針

參照“十五”國家規(guī)劃統編教材《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜定位，并模擬人體腧穴骨度分寸法量取次髎、中極、三陰交。

電針組于造模后第19 天[9]開始電針干預，每天1次，共7 次。大鼠仰臥位固定于鼠板上，用30 號1 寸針，直刺中極和三陰交(三陰交左右兩穴隔日交替進行)，深5 mm，接SDZ-V 型電針治療儀(華佗牌)，疏密波10/50 Hz、電流0.1 mA，強度以肢體輕顫并耐受為度，留針20 min。隨后將大鼠俯臥位固定，直刺次髎15 mm (次髎左右兩穴隔日交替進行)和大鼠尾根部，重復以上操作。

1.6 標本采集與處理

電針治療結束后各組行尿流動力學檢查，后將動物斷頸處死，取逼尿肌組織，4 ℃生理鹽水漂凈，濾紙吸干，-80 ℃冰箱凍存待用。

1.7 指標檢測

1.7.1組織病理學觀察

肉眼觀察膀胱的大體情況，如大小、膀胱壁厚??；檢查上尿路情況。將逼尿肌組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，間斷連續(xù)切片，厚4 μm，HE 染色后在光鏡下觀察逼尿肌的組織形態(tài)學改變。

1.7.2尿流動力學檢測

大鼠10%水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉。取仰臥位固定，輕壓腹部，排凈膀胱內尿液，會陰部用絡合碘消毒。將F3 導尿管經三通管與微量灌注泵及MP150 多通道生理記錄儀連接，排凈儀器和管內空氣，在示波模式下標定零點。石蠟油棉球潤滑F3 導尿管前端，將其經尿道緩慢插入膀胱并用膠帶固定。待壓力曲線穩(wěn)定后，記錄此時膀胱內壓。然后100 μl/min 膀胱灌注溫生理鹽水(25～35 ℃)，同步記錄膀胱壓力曲線變化及灌注液首次自尿道口漏出時的灌注時間；繼續(xù)灌注直至出現4～5 個穩(wěn)定波形，完成尿流動力學檢測。導尿管進入膀胱的起始壓力為膀胱基礎壓，膀胱最大容量為尿道口首次流出液體時的灌注容積，此時壓力為漏尿點壓力，膀胱順應性為膀胱容量的變化與壓力變化的比值。

1.7.3ELISA法檢測逼尿肌cAMP、PKA蛋白含量

取逼尿肌組織1×1×1 cm，切片后，加入0.1 mol/L冰冷磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)，混合比例1∶9。冰上10 000 r/min 離心，取上清液，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩２捎肊LISA 試劑盒檢測樣本cAMP、PKA水平。

1.7.4Western blotting法檢測逼尿肌p-MLCK水平

剪取逼尿肌組織250 mg，RIPA 裂解提取組織總蛋白；配制BCA 工作液測量蛋白濃度；進行電泳，當溴酚藍電泳到達膠底，結束電泳；分別切膠p-MLCK (211 kDa)、β-actin (42 kDa)進行轉模；采用脫脂奶粉封閉1 h；分別加入p-MLCK (1∶1000)和β-actin(1∶4000)一抗，4 ℃下孵育過夜；1×TBST洗3次，每次15 min；采用1×TBST 稀釋HRP(1∶3000)標記的二抗，孵育45～60 min；1×TBST洗3次，每次15 min；ECL 顯色曝光。采用BIO-RAD 凝膠成像系統拍照，以QuantityOne 軟件分析p-MLCK 和內參β-actin 蛋白的灰度值，以兩者灰度比值作為p-MLCK 的相對表達水平。

1.8 統計學分析

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據處理。計量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示，多組間均數比較，如滿足正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析，方差不齊采用Tamhane's T2 多重比較；不滿足正態(tài)性則采用非參數檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況

空白組和假手術組一般情況良好。模型組術后后肢完全癱瘓，隨意運動喪失，呈拖動爬行；膀胱脹大且有尿潴留，需手法輔助排尿；術后第19天，大部分模型大鼠渡過脊髓休克期，表現為尿失禁，膀胱無脹大，無需手法排尿，會陰部及籠內墊料保持經常性潮濕。大鼠飲食量較前減少，體質量有所下降。經過電針治療后，電針組尿失禁癥狀有所好轉，會陰部及籠內墊料潮濕程度減輕，飲食量增加，但后肢運動功能無明顯改善。

2.2 逼尿肌組織形態(tài)學改變

2.2.1肉眼觀察

與空白組和假手術組比較，模型組和電針組膀胱體積增大，膀胱壁粗糙、增厚，部分大鼠的輸尿管出現明顯擴張，腎盂有少量積水，尤以模型組明顯。

2.2.2光鏡下觀察

空白組和假手術組膀胱組織的移行上皮細胞整齊緊密排列，固有膜完整，無炎性細胞浸潤及組織水腫；肌纖維束排列層次較清晰，肌間隙充滿彈性纖維，無增生及纖維化改變。

模型組膀胱組織的移行上皮細胞排列紊亂，固有膜被破壞，細胞間隙明顯增大，同時伴有大量單核細胞浸潤，組織水腫明顯，部分區(qū)域伴有微血管破裂出血改變，肌纖維排列層次欠清晰，結締組織增生明顯，呈纖維化趨勢。

與模型組比較，電針組逼尿肌組織的炎癥反應程度有所好轉，單核細胞浸潤數量減少，組織的水腫程度有所減輕。見圖1。

2.3 尿流動力學

與空白組和假手術組比較，模型組膀胱基礎壓和漏尿點壓均明顯升高(P＜0.01)，而膀胱最大容量和膀胱順應性均明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，電針組膀胱最大容量、膀胱順應性均明顯增加(P＜0.01)，膀胱基礎壓和漏尿點壓均降低(P＜0.05)。見表1。

2.4 逼尿肌內cAMP、PKA含量

與空白組和假手術組比較，模型組逼尿肌內cAMP 和PKA 含量明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，電針組逼尿肌內cAMP 和PKA 含量增加(P＜0.05)。見表2。

圖1 各組逼尿肌組織形態(tài)學情況(光鏡，×400)

2.5 逼尿肌內p-MLCK表達

與空白組和假手術組比較，模型組逼尿肌內p-MLCK 表達明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，電針組逼尿肌內p-MLCK 表達升高(P＜0.05)。見表3、圖2。

3 討論

針對骶上脊髓損傷后逼尿肌反射亢進，抑制逼尿肌收縮是有效的治療手段，如給予巴氯芬[13]，或逼尿肌局部注射A 型肉毒毒素[3,14]、毒蕈堿受體拮抗劑[15]均可有效抑制膀胱過度收縮，改善膀胱癥狀。

表1 各組大鼠膀胱尿流動力學指標比較

表2 各組逼尿肌cAMP含量比較(pg/ml)

表3 各組逼尿肌內p-MLCK相對灰度值比較

圖2 各組逼尿肌內p-MLCK蛋白表達(Western blotting)

前期研究發(fā)現[9]，T10水平橫斷損傷的大鼠，脊髓休克期后經電針干預，可增大膀胱最大容量，降低膀胱內壓，改善膀胱的順應性。已有研究證實[5-7]，cAMP 及其激酶PKA 在平滑肌舒張的生理過程中起著非常重要的作用。cAMP 通過激活其激酶PKA，可使MLCK 磷酸化而失去活性，引起平滑肌舒張。本研究發(fā)現，T10水平脊髓橫斷損傷大鼠脊髓休克期后經電針干預，大鼠逼尿肌cAMP和PKA 含量明顯升高，膀胱尿流動力學參數得到明顯改善。表明cAMP/PKA 信號通路可能是電針治療逼尿肌亢進型神經源性膀胱的重要分子信號途徑。

骶上脊髓損傷后的逼尿肌反射亢進型膀胱在臨床上根據括約肌是否協同既可表現為尿失禁，又可表現為尿潴留，屬中醫(yī)學“遺溺”“癃閉”范疇。中國古代醫(yī)集中有關針灸治療該病的記載頗多。程潔等[16]基于數據挖掘探討針灸治療脊髓損傷尿潴留的臨床選穴規(guī)律，發(fā)現中極、次髎、三陰交是治療該病最常用穴位。中極與膀胱體表投射區(qū)接近，由T12～L1脊髓節(jié)段支配，與支配膀胱的交感節(jié)后纖維盆神經、腹下神經和陰部神經的脊髓節(jié)段部分重疊。穴下為交感支配膀胱的傳出神經分支髂腹下神經，針刺中極可能對膀胱及尿道內括約肌的交感支配產生影響[17-18]。次髎位于S2后孔內，位于S2神經肌支下方。S2～S4前角細胞是排尿的調節(jié)中樞，膀胱副交感神經節(jié)通過節(jié)后纖維支配逼尿肌和膀胱括約肌。骶神經調節(jié)對非梗阻性尿潴留患者有效[19-20]。電針刺激次髎可能直接影響S2神經根，引起膀胱節(jié)律性收縮，松弛膀胱肌肉，從而有利于自主排尿和自主排尿反射的重建[21]。三陰交下有來自于L4～S3神經根的脛神經通過，深刺該穴可通過反射弧傳到脊髓后根，調節(jié)骶髓排尿中樞，調節(jié)膀胱的順應性[22]。

電針對神經源性膀胱有很好的療效。王彥彬等[23]利用S3神經電針治療脊髓損傷后逼尿肌反射亢進，患者排尿次數、漏尿次數、充盈末期逼尿肌壓減少。劉春茹等[24]認為電針聯合膀胱功能訓練能顯著改善脊髓損傷后逼尿肌反射亢進型神經源性膀胱患者的臨床癥狀，其機制與抑制逼尿肌的反應亢進，促進逼尿肌與尿道外括約肌的協調性活動，提高膀胱順應性有關。電針結合膀胱功能訓練可以明顯改善骶上脊髓損傷患者的膀胱功能，與對照組比較，治療組膀胱容量、膀胱順應性顯著增加，殘余尿量、膀胱壓力、直腸壓力、逼尿肌壓力顯著降低[25]。本項目組臨床研究亦發(fā)現[8]，電針聯合膀胱綜合訓練治療骶上脊髓損傷后神經源性膀胱(逼尿肌反射亢進型)患者，治療4 周后，觀察組24 h 自主排尿次數、充盈期逼尿肌壓力、殘余尿量及生活質量精簡問卷評分均明顯低于對照組水平，而最大膀胱測壓容積及最大尿流率均明顯高于對照組水平。本研究使用T10脊髓橫斷后逼尿肌反射亢進型神經源性膀胱大鼠模型再次驗證了臨床研究的發(fā)現。相較于模型組，電針組膀胱最大容量、膀胱順應性均顯著增加，膀胱基礎壓、漏尿點壓均明顯降低，表明電針次髎、中極、三陰交等穴可有效降低模型大鼠的膀胱內壓，提高膀胱順應性，增加膀胱容量。

逼尿肌的收縮是一種鈣和ATP 依賴的過程[4]，胞漿內游離Ca2+濃度增高，形成Ca2+與CaM 復合物，結合MLCK后使MLCK活化，引起其下游肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)的磷酸化水平增高，MLC 磷酸化過程分解足夠的ATP，將化學能轉變?yōu)闄C械能，從而引起平滑肌收縮。

cAMP 與平滑肌舒張之間存在密切聯系，這一作用是通過其底物PKA 實現的。有研究發(fā)現[5-7,26]，cAMP 通過PKA 使MLCK 磷酸化，從而影響與Ca2+-CaM 復合物的親和力，使其對Ca2+失敏，降低其下游MLC 磷酸化水平，引起平滑肌舒張。此外，cAMP 促進平滑肌舒張的作用可能與肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphotase,MLCP)有 關[27]。cAMP 的底物PKA 可使MLCP 的調節(jié)亞基MYPT1 等發(fā)生磷酸化，進而激活MLCP?；罨腗LCP可使MLC去磷酸化，使ATP 分解減少，導致平滑肌舒張。另外，cAMP 還促使K+通道磷酸化，使細胞膜超極化，從而間接抑制膜上的L 型電壓依賴性鈣通道(L-type voltage-dependent calcium channel,L-VOC)的活動，阻止胞外Ca2+進入肌細胞內，降低胞漿內Ca2+離子濃度[28]。以上研究表明，cAMP/PKA 信號通路在調節(jié)平滑肌舒張中起著非常重要的作用。結合尿流動力學指標，我們觀察到模型組逼尿肌cAMP、PKA 含量較空白組明顯降低，這說明cAMP、PKA 參與調控逼尿肌收縮活動。而電針組cAMP、PKA 含量較模型組明顯增加，這表明cAMP、PKA 可能是電針發(fā)揮抑制逼尿肌收縮作用的關鍵信號途徑。

MLCK 是一個公認的調節(jié)平滑肌收縮信號通路上的關鍵蛋白。MLCK 可被PKA 磷酸化[6,26]。本研究顯示，相較于空白組，模型組p-MLCK 水平明顯降低，反映出骶上脊髓損傷后，逼尿肌反射性收縮活動明顯增加，與尿流動力學指標表現一致。相較于模型組，電針組p-MLCK 水平明顯增加。電針可以促進MLCK磷酸化使其失活，從而抑制逼尿肌反射性收縮，促進其舒張，同樣與尿流動力學指標一致。同時p-MLCK水平與cAMP、PKA 含量變化一致。說明電針對p-MLCK 水平的調節(jié)可能是通過調節(jié)cAMP/PKA 信號通路實現的。

目前，我們尚未發(fā)現從cAMP/PKA 信號通路角度研究電針促進逼尿肌舒張的機制研究，本研究首次發(fā)現電針可通過cAMP/PKA 信號通路調節(jié)p-MLCK 水平，改善骶上脊髓損傷后神經源性膀胱的逼尿肌無抑制性收縮狀態(tài)，改善膀胱功能，為針灸治療逼尿肌反射亢進型膀胱提供一定的證據支持。

確定cAMP/PKA 信號通路在電針治療骶上脊髓損傷后逼尿肌反射亢進型膀胱的作用機制，有待通過設置其信號通路上關鍵蛋白的阻斷劑或激動劑展開進一步研究。另外，K+通道及MLCP可能是cAMP/PKA 信號通路調節(jié)平滑肌舒張信號通路的中間環(huán)節(jié)，針灸是否可通過cAMP/PKA調節(jié)K+通道及MLCP發(fā)揮促進逼尿肌舒張的作用有待進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。