減重平板訓(xùn)練對脊髓損傷大鼠神經(jīng)病理性疼痛及脊髓后角谷氨酸脫羧酶-65/67表達(dá)的影響

李向哲，丁潔，王慶華，董傳明，王彤，吳勤峰

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院，江蘇蘇州市 215153；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院，浙江杭州市 310016；3.南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通市 226001；4.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通市 226001；5.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心，江蘇南京市210029

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)是脊髓損傷后常見的并發(fā)癥之一，可多方面損害患者的身心健康，降低生活質(zhì)量[1-2]。雖然目前的診療技術(shù)和治療手段不斷進(jìn)展，但由于發(fā)病機制的復(fù)雜性，NPP 的治療效果仍不盡如人意[3-6]。脊髓損傷后，脊髓內(nèi)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)合成減少可能是導(dǎo)致NPP 的主要原因之一[7]。動物實驗表明[8-9]，坐骨神經(jīng)損傷后，運動訓(xùn)練可通過增加脊髓后角內(nèi)GABA 合成酶——谷氨酸脫羧酶-65/67 (glutamate decarboxylase-65/67,GAD65/67)的合成以改善NPP。

本研究觀察減重平板訓(xùn)練對脊髓損傷大鼠機械性痛閾和熱痛閾的影響，以及遠(yuǎn)端脊髓內(nèi)GAD-65/67 的表達(dá)，探討運動訓(xùn)練改善脊髓損傷大鼠NPP 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

成年雌性Sprague-Dawley 大鼠24 只，體質(zhì)量210～230 g，隨機分為假手術(shù)組(Sham 組)、脊髓損傷-不運動組(SCI-Sed 組)和脊髓損傷-運動組(SCI-Ex 組)，每組8 只。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫環(huán)境(22±2)℃，濕度50%～60%，自由飲食，自然光照。

本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過(No.2019-792)。

1.2 模型制作

采用Allen 法制作T10不完全性脊髓損傷模型[10-11]。損傷裝置采用NYU脊椎沖擊損傷儀Model I型(美國新澤西州立大學(xué)神經(jīng)科學(xué)聯(lián)合中心實驗室提供，打擊頭直徑2.5 mm)，損傷劑量為10 g×25 mm。Sham 組僅暴露脊髓。術(shù)后膀胱按摩輔助排尿，每天2 次，連續(xù)5～7 d，直至形成自主排尿。

1.3 減重平板訓(xùn)練

SCI-Ex 組于脊髓損傷后第8 天進(jìn)行減重平板訓(xùn)練[10]。每次運動訓(xùn)練前手法按摩膀胱區(qū)排空尿液。跑臺速度6 m/min，每次訓(xùn)練20 min，每天2 次，每周5 d，共4周。訓(xùn)練時根據(jù)大鼠的功能狀態(tài)，減重范圍設(shè)為20%～40%，隨大鼠后肢運動恢復(fù)逐漸減小減重程度。

1.4 疼痛評估

1.4.1機械性痛閾

采用Chaplan 等[12]改良的評估法。室溫、安靜環(huán)境中，先將大鼠放置于透明隔籠中適應(yīng)15 min。隨后將一系列von Frey 細(xì)絲(0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g 和15.0 g)從2.0 g 力度開始垂直刺激大鼠后肢腳掌中部皮膚，每次刺激持續(xù)6～8 s，依大鼠的反應(yīng)依次進(jìn)行評估(up-down 法[13])，大鼠出現(xiàn)縮足或舔足反應(yīng)記為陽性(×)，無反應(yīng)記為陰性(○)，每只大鼠評估時間應(yīng)小于1 min。以von Frey單絲刺激強度小于4 g 時考慮NPP 的存在[14]。評估時間點：脊髓損傷術(shù)前，脊髓損傷后7 d、14 d、21 d、28 d和35 d。

1.4.2熱痛閾

使用熱刺激痛覺測試儀進(jìn)行熱痛閾評估。參照Hargreaves[15]提供的評估方法進(jìn)行。評估前將大鼠置于樹脂玻璃評估籠中適應(yīng)15 min，每只大鼠評估3次，取縮足反應(yīng)平均值作為每只大鼠的熱痛閾，每次評估間隔10 min，熱刺激強度設(shè)定為20%，最長刺激時間20 s[16]。評估時間點與機械性痛閾評估相同。

1.5 免疫組化染色

痛閾評估結(jié)束后，每組取4 只，10%水合氯醛3 ml/kg深度麻醉大鼠，打開胸腔暴露心臟，使用灌注泵生理鹽水250 ml 進(jìn)行心臟灌注，后使用4%多聚甲醛250 ml 灌注，取出脊髓后，分離L4～L5脊髓節(jié)段，放入4%多聚甲醛4 ℃后固定過夜。酒精梯度脫水，石蠟包埋。石蠟切片機連續(xù)水平橫切，厚5 μm，每隔5 張收1 張，每個樣本收取3 張。脫蠟水化、H2O2孵育、微波修復(fù)、封閉液封閉后，滴加兔抗GAD65 多克隆抗體(ab203063，1∶200，美國ABCAM 公司)和鼠抗GAD67 單克隆抗體(MAB5406，1∶1000，德國MINIPORE 公司)，4 ℃過夜孵育。次日PBS 沖洗后，使用生物素標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗在37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗片、DAB 顯色、封片。攝片后使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行光密度分析。

1.6 Western blotting

痛閾評估結(jié)束后，每組取4 只，10%水合氯醛3 ml/kg 深度麻醉大鼠，斷頭處死，離斷L4～L5脊髓節(jié)段，在液氮中研磨破碎后，加入適量RIPA 裂解液，4 ℃冷庫搖床上消化30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液，BCA 法測定蛋白濃度，按照測定濃度加入4×上樣緩沖液使得樣品濃度相同。沸水中變性10 min，分裝后-80 °C 保存?zhèn)溆谩?2% SDSPAGE 膠，上樣蛋白80 μg，20 mA 恒流電泳至目的條帶區(qū)分開，100 V 恒壓轉(zhuǎn)膜80 min。封閉并加入兔抗GAD65 多克隆抗體(ab203063，1∶1000，美國ABCAM 公司)和鼠抗GAD67 單克隆抗體(MAB5406，1∶5000，德國MINIPORE 公司)和鼠抗GAPDH 單克隆抗體(ab181602，1∶5000，美國ABCAM 公司)，4 ℃孵育過夜。次日用山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜。ECL 法顯影，攝片后使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示。機械痛閾和熱痛閾數(shù)據(jù)建立一般線性模型，進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，后采用Tukey's POST hoc 對3 組大鼠同一時間點數(shù)值進(jìn)行兩兩比較。免疫組化和Western blotting 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，若單因素方差分析有統(tǒng)計學(xué)差異，再使用POST hoc進(jìn)行兩兩分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 痛閾

脊髓損傷后各時間點，三組機械性痛閾和熱痛閾的時間、分組和交互效應(yīng)均顯著(P＜0.001)。脊髓損傷后各時間點，SCI-Ex 組和SCI-Sed 組機械性痛閾和熱痛閾均顯著低于Sham 組(P＜0.001)。脊髓損傷后21 d、28 d 和35 d，SCI-Ex 組的機械性痛閾和熱痛閾均明顯高于SCI-Sed 組(P＜0.01)。脊髓損傷后7 d 和14 d，SCI-Sed 組和SCI-Ex 組機械性痛閾和熱痛閾均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、表2。

2.2 Western blotting

三組間損傷遠(yuǎn)端脊髓內(nèi)GAD-65 和GAD-67 表達(dá)量均有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。與Sham 組相比，SCI-Sed組和SCI-Ex組的GAD-65和GAD-67表達(dá)量減少(P＜0.05)。與SCI-Sed 組比較，SCI-Ex 組GAD-65 和GAD-67 表達(dá)量升高(P＜0.05)。見 圖1、表3。

表1 各組von Frey機械性痛閾比較(g)

圖1 各組GAD65和GAD-67的Western blotting相對表達(dá)量

2.3 免疫組化染色

在脊髓后角，GAD-65 和GAD-67 主要表達(dá)于Lamina I-III。SCI-Sed 組和SCI-Ex 組GAD-65 和GAD-67 相對免疫強度明顯低于Sham 組(P＜0.01)。SCI-Ex組GAD-65 和GAD-67 相對免疫強度顯著高于SCI-Sed組(P＜0.001)。見圖2、表4。

3 討論

脊髓損傷后的NPP 多出現(xiàn)在損傷平面以下，可表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、觸誘發(fā)痛或痛覺過敏等[1-2]。脊髓損傷后NPP 的綜合發(fā)生率約為53%[17]，嚴(yán)重影響患者的身心健康[2]。運動訓(xùn)練是脊髓損傷后常用的功能性康復(fù)訓(xùn)練方案，可通過激活脊髓感覺運動神經(jīng)環(huán)路促進(jìn)神經(jīng)可塑性和神經(jīng)功能恢復(fù)[10,16,18]，調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元的興奮性，減輕脊髓損傷后痙攣和NPP[16,19-20]。但運動訓(xùn)練對脊髓損傷后脊髓后角內(nèi)的GABA 合成的影響卻少見報道。

GABA 是脊髓內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，由其限速酶GAD-65/67 合成[21]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GAD-65 主要表達(dá)于軸突終末，而GAD-67 主要表達(dá)于抑制性神經(jīng)元胞體和神經(jīng)終末[21-22]。在大鼠和狗的脊髓內(nèi)，GAD-65 和GAD-67 廣泛表達(dá)于脊髓灰質(zhì)，尤其是點狀分布于腰髓Lamina I-III[21,23]，與本研究免疫組化結(jié)果一致。當(dāng)GABA 與GABAA受體通道蛋白結(jié)合后，可引起突觸后神經(jīng)元的Cl-內(nèi)流和超極化膜電位，發(fā)揮突觸后抑制作用，使神經(jīng)元的興奮性降低[7]。而激活GABAB受體蛋白可通過減少Ca2+內(nèi)流而發(fā)揮突觸前抑制作用，使初級傳入神經(jīng)纖維膜電位超極化，抑制神經(jīng)末梢的遞質(zhì)釋放[7]。

本研究結(jié)果顯示，脊髓損傷可降低大鼠后肢的痛閾，并減少GAD-65/67 的合成，與Meisner 等[23]和Gwak等[7]的研究一致。可能由于在脊髓損傷后，大鼠脊髓后角GABA 能神經(jīng)元丟失或者是缺乏初級出入纖維的刺激所致[7]。運動訓(xùn)練可明顯改善T10不完全性脊髓損傷大鼠的痛覺過敏，并增加脊髓內(nèi)GAD-65 和GAD-67的合成。

表2 各組熱痛閾比較(s)

表3 各組GAD65和GAD-67 Western blotting相對表達(dá)量

圖2 各組GAD-65和GAD-67表達(dá)(免疫組化染色，bar=100 μm)

表4 各組脊髓后角GAD-65和GAD-67相對免疫強度比較

坐骨神經(jīng)損傷后，運動訓(xùn)練可通過增加脊髓后角GAD-65 和GAD-67 合成，調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元興奮性，減輕NPP程度[8-9]。此外，早期運動訓(xùn)練還可通過減少脊髓后角降鈣素基因相關(guān)肽[24]，增加神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子[25]和鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2(potassium chloride cotransporter 2,KCC2)表達(dá)[16]，改善脊髓損傷后NPP。但是也有研究發(fā)現(xiàn)[26]，早期運動訓(xùn)練可通過TrkB 信號通路，增加脊髓后角神經(jīng)元興奮性，促進(jìn)脊髓損傷后NPP的發(fā)生，可能是采用的運動方式不同所致：后者采用的是機械臂輔助下踏步訓(xùn)練，而減輕NPP的運動訓(xùn)練多采用主動運動[27]。

Takeoka 等[28]認(rèn)為，運動訓(xùn)練可通過肌梭感覺傳入途徑改善脊髓損傷后的運動功能恢復(fù)和神經(jīng)功能重組。Li 等[29]發(fā)現(xiàn)，在小鼠出生后阻斷脊髓感覺傳入，可明顯減弱脊髓后角GABA 能神經(jīng)元的可塑性，并可能促進(jìn)NPP的發(fā)生。由此可見，感覺信息的傳入可能對脊髓后角神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的功能及重塑具有重要的調(diào)節(jié)作用。運動訓(xùn)練是否能夠通過影響感覺傳入而改善脊髓損傷后NPP，尚需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，運動訓(xùn)練可增加不完全性脊髓損傷大鼠損傷遠(yuǎn)端脊髓后角GAD-65/67 的合成，并增加大鼠后肢的機械性痛閾和熱痛閾。但運動訓(xùn)練通過何種途徑和機制增加GAD-65/67 的表達(dá)并改善脊髓損傷后的NPP，尚需進(jìn)一步研究證實。