千層紙素A 抗腫瘤機制的研究進展

周 聰，柴效科，宋愛琳

蘭州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，甘肅 蘭州730030

黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 是我國的傳統(tǒng)中藥材，在臨床上應(yīng)用廣泛。千層紙素A（oroxylin A）是從黃芩根中提取的一種黃酮類化合物，具有廣泛、強大的生物學(xué)活性，其中抗腫瘤效應(yīng)近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的熱切關(guān)注。千層紙素A 抗腫瘤活性表現(xiàn)為抑制癌細胞增殖、重建癌細胞代謝、誘導(dǎo)癌細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)癌細胞對化療藥的耐藥性等方面，作用的信號通路廣泛且多層次。

千層紙素A，由SHAH、MEHTA、WHEELER 首先從木蝴蝶的根皮中分離而得［1］。千層紙素A 是一種黃色針狀結(jié)晶，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C16H12O5，分子量為284.27，密度是1.42 g/cm3，熔點在195～197℃，在760 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa）下 沸 點 為540.9 ℃。研究表明，千層紙素A具有廣泛強大的生物活性，在神經(jīng)保護［2，3］、抗炎［4-6］、抗瘙癢［7］、抑制宮縮［8］、保護血管內(nèi)皮細胞［9］、抗腫瘤［10-11］等方面發(fā)揮重大作用，是目前研究的熱點。筆者從Pubmed 中文數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)中搜索近十年關(guān)于千層紙素A 的文獻，對其在抗腫瘤方面的研究進行了小結(jié)，現(xiàn)綜述如下。

1 千層紙素A與肺癌

郭小龍［12］在研究A549 非小細胞肺癌細胞時發(fā)現(xiàn)，千層紙素A 可以抑制癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用呈時間依賴性和劑量依賴性。為了進一步探討千層紙素A 誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的機制，研究者后續(xù)選擇了B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族進行研究。Bcl-2蛋白家族是調(diào)控細胞凋亡的最主要蛋白家族之一。研究者發(fā)現(xiàn)千層紙素A 可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 和 促凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）之間的比值來調(diào)控細胞凋亡。除此之外，端粒酶與抗細胞凋亡之間存在密切聯(lián)系，進一步的研究表明，千層紙素A 也能通過抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達，從而降低端粒酶活性，調(diào)控肺癌細胞凋亡。Snail 是一種上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Snail 的過表達常常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及較差的預(yù)后。WEI等［13］研究者利用非小細胞肺癌細胞系95D 細胞和A549細胞發(fā)現(xiàn)千層紙素A可以通過抑制MAPK/ERK信號通路的激活，從而抑制GSK-3β 信號的激活，導(dǎo)致Snail 的表達抑制，減少腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。同時研究者利用A549 細胞構(gòu)建小鼠腫瘤模型進行體內(nèi)實驗，發(fā)現(xiàn)用千層紙素A 處理的小鼠的腫瘤質(zhì)量更小、轉(zhuǎn)移病灶更少，驗證了其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的功能。

2 千層紙素A與胃癌

YANG 等［14］發(fā)現(xiàn)千層紙素A 可以抑制人胃癌細胞BGC-823 細胞的增殖能力。細胞周期依靠細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，Cdk）和細胞周期蛋白（cyclin）共同調(diào)控，cyclin B 和Cdc2 精確調(diào)控G2/M 周期轉(zhuǎn)化。為了探索千層紙素A 是否在細胞周期中發(fā)揮作用，研究者們利用流式細胞術(shù)檢測各周期細胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用千層紙素A 處理細胞后，處于G2/M 期的細胞比例明顯增加。接著研究者們檢測了調(diào)控細胞周期的蛋白，發(fā)現(xiàn)cyclin B1、cyclin A、Cdc2 和Cdk7 四個細胞周期蛋白表達明顯下降。蛋白免疫印跡實驗的結(jié)果驗證了流式細胞術(shù)的發(fā)現(xiàn)，再次證明千層紙素A 對胃癌細胞BGC-823 細胞周期的阻滯作用。

3 千層紙素A與肝癌

LIU 等［15］在前期研究中發(fā)現(xiàn)千層紙素A 對人肝細胞癌細胞系HepG2 細胞的促凋亡效應(yīng)。為此他們進一步研究了其促凋亡機制。研究者們發(fā)現(xiàn)千層紙素A 通過線粒體凋亡通道（mitochondrial apoptosis channel，MAC）途徑發(fā)揮對HepG2細胞的促凋亡作用。研究者們指出，線粒體相關(guān)凋亡途徑最重要的是線粒體外膜的通透性改變，包括兩種機制。1）線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）機 制：MPTP 存在于線粒體內(nèi)膜上，當(dāng)MPTP 開放時，線粒體基質(zhì)滲透性腫脹，外膜破裂，使細胞色素C及其他促凋亡蛋白溢出到細胞質(zhì)中誘導(dǎo)凋亡。2）MAC 機制：在正常細胞中，Bax 以單體形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲鱿嚓P(guān)的刺激信號（如實體腫瘤的缺氧條件）存在時，Bax 被激活，轉(zhuǎn)位至線粒體膜，并形成低聚狀態(tài)的同源聚合物，允許細胞色素C 和其他促凋亡蛋白通過聚合物通道釋放到細胞質(zhì)中發(fā)生凋亡反應(yīng)。實驗證明，選擇性PTP 阻滯劑環(huán)孢霉素A 并不能阻止千層紙素A 誘導(dǎo)的細胞凋亡過程，而在細胞中檢測到Bax 的活化、轉(zhuǎn)位、聚合，以及Bcl-2 過表達可抑制千層紙素A 的凋亡誘導(dǎo)作用，證明千層紙素A 通過MAC 途徑促進人肝細胞癌細胞HepG2 的促凋亡作用。

此外，ZHU等［16］發(fā)現(xiàn)千層紙素A可以通過Akt/PI3K 信號通路途徑下調(diào)整合蛋白（Integrinβ1）的表達，逆轉(zhuǎn)HepG2細胞對紫杉醇的耐藥性。缺氧是很多實體腫瘤的共同特征，在研究缺氧條件下的人肝細胞癌細胞代謝中，DAI等［17］發(fā)現(xiàn)千層紙素A不僅通過抑制HIF-1α相關(guān)的糖酵解通路，還能通過降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平，來抑制人肝癌細胞HepG2 細胞在缺氧條件下糖酵解功能。WEI 等［18］研究發(fā)現(xiàn)千層紙素A 可以上調(diào)M1 型丙酮酸激酶和M2 型丙酮酸激酶的比例，從而激活肝細胞核因子HNF-4α，調(diào)控目的基因的表達，促進肝細胞癌細胞的分化。

4 千層紙素A與結(jié)腸癌

解偶聯(lián)蛋白2（recombinant uncoupling protein 2，UCP2）是線粒體膜上的陰離子轉(zhuǎn)運超家族的一種蛋白。前期的研究認(rèn)為，UCP2在癌細胞，尤其是結(jié)腸癌［19］中高表達。QIAO 等［20］研究者發(fā)現(xiàn)UCP2在CaCo-2結(jié)腸癌細胞中高表達可以減少活性氧ROS 的生成，進而改變MPTP 狀態(tài)。MPTP 是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一組蛋白復(fù)合體，是線粒體相關(guān)凋亡途徑的一個重要分子。而千層紙素A正能通過線粒體相關(guān)凋亡途徑抑制UCP2 表達、激活MPTP、在細胞內(nèi)富集ROS，最終導(dǎo)致CaCo-2 細胞的凋亡。但在HepG2 肝癌細胞研究中，MPTP 并沒有被激活，激活的MAC 促進肝癌細胞的凋亡。

基于對肝癌細胞代謝［16］的研究，NI 等［21］研究者繼續(xù)研究了千層紙素A 對結(jié)腸癌細胞的代謝影響。在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可以上調(diào)脂肪分化相關(guān)蛋白、脂肪酸合成酶、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1，并且下調(diào)肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1，從而促進脂質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運，增加脂肪酸合成，減少脂肪酸氧化。千層紙素A 可以抑制HCT-116 結(jié)腸癌細胞HIF-1α 的表達，降低細胞內(nèi)的脂肪酸水平，進而抑制Wnt 信號通路，使細胞分裂阻滯在G/M 期，抑制癌細胞的增殖。同時進行的體內(nèi)實驗也驗證了千層紙素A延緩腫瘤進展的抗癌作用。

5 千層紙素A與乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的癌癥，約占女性新發(fā)癌癥病例的30%，同時也是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。SUN 等［22］發(fā)現(xiàn)千層紙素A 可以抑制MDA-MB-435 細胞的遷移、侵襲能力，并且具有濃度依賴性?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）中的MMP-2、MMP-9 是癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的兩個關(guān)鍵酶。MMP-2、MMP-9的激活降解細胞外基質(zhì)，破壞完整的基底膜，導(dǎo)致癌細胞侵入血管和淋巴管，向遠處轉(zhuǎn)移。為了研究千層紙素A 對癌細胞侵襲遷移的抑制功能是否與MMPs 有關(guān)，研究者收集了千層紙素A 處理細胞后的上清液，檢測MMP-2、MMP-9 蛋白，結(jié)果顯示基質(zhì)金屬蛋白酶水平明顯下降。MMPs 的表達與MAPK信號通路和PI3K信號通路有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)千層紙素A是通過MAPK/ERK信號通路來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，而PI3K/Akt 信號通路的蛋白表達沒有顯著改變。在后續(xù)的實驗中［23］，研究者們發(fā)現(xiàn)千層紙素A 下調(diào)MMP-9水平的兩種機制：1）通過上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子TIMP-2 的水平，不僅抑制MMP-9 的表達，還減弱其合成酶的活力，從而降低蛋白水平；2）通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)蛋白水平，千層紙素A 可以下調(diào)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族中PKCδ的表達水平，從而減少細胞外源調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）激活，減弱ERK 對三個順式作用元件（Sp-1、NF-κB、AP-1）的激活，其中激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）與MMP-9 表達有關(guān)。AP-1 是由原癌基因蛋白c-Fos（c-fos protooncogene protein，c-Fos）和原癌基因蛋白c-Jun（c-jun proto-oncogene protein，c-Jun）組成的異二聚體。千層紙素A不僅能降低c-Fos水平，還能抑制AP-1 結(jié)合部位的活性，從而降低AP1 的水平和功能，最終下調(diào)MMP-9的表達，形成PKCδ/ERK/AP-1/MMP-9信號通路。

另外，研究者們認(rèn)為千層紙素A 能通過上調(diào)長壽基因SIRT3 的表達，使親環(huán)素D 脫乙?；瑢⒓禾羌っ窱I 從線粒體上分離，改變?nèi)橄侔┘毎拇x［24］。后期的實驗［25］證明千層紙素A 能通過SIRT-3 介導(dǎo)的途徑上調(diào)過氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）的表達，并且下調(diào)HIF-1α 的水平，來重建乳腺癌細胞的糖代謝，從而阻礙癌細胞的增殖。千層紙素A 還能通過抑制Notch1 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch1 intracellular domain，N1ICD）與Snail 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，來抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和遷移能力［26］。

6 千層紙素A與宮頸癌

宮頸癌是全球女性第四大高發(fā)惡性腫瘤，在中國，宮頸癌在女性中的發(fā)病率排名第六位［27］。LI 等［28］用人宮頸癌細胞系海拉（Hela）細胞構(gòu)建小鼠宮頸癌模型，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)千層紙素A 或環(huán)磷酰胺處理的小鼠的腫瘤體積、質(zhì)量較對照組更??；在整個兩周藥物處理過程中，環(huán)磷酰胺組小鼠的體質(zhì)量下降，而千層紙素A 組的小鼠前后體質(zhì)量沒有明顯改變。接著研究者們進行了體外細胞實驗，研究發(fā)現(xiàn)千層紙素A 能抑制Hela 細胞存活率，同時對處理后的Hela 細胞進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)出現(xiàn)凋亡小體，這種抑制存活的功能可能和促進癌細胞凋亡有關(guān)。為了探索千層紙素A 對Hela 細胞誘導(dǎo)凋亡的機制，研究者選取了Bcl-2、Bax、前半胱氨酸蛋白酶3（procaspase-3）、procaspase-8 和procaspase-9 進行蛋白免疫印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)千層紙素A 處理后，線粒體相關(guān)凋亡的蛋白Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9 的表達減少，而Bax 的表達沒有明顯改變；外源性凋亡途徑的蛋白procaspase-8 的表達也減少。結(jié)果說明千層紙素A誘導(dǎo)Hela細胞凋亡可能同時啟動了內(nèi)源性途徑和外源性途徑。

7 千層紙素A與其他癌癥

HUI 等［29］研 究 發(fā) 現(xiàn) 千 層 紙 素A 可 以 通 過PPARγ/RXRα 途徑抑制急性髓系白血病細胞分化并使細胞周期阻滯在G1期。PPARγ是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisomal proliferators activate receptors，PPAR）的其中一個亞型，是MAPK 信號通路的下游底物，MAPK 信號通路激活后可使其磷酸化而失活。千層紙素A可以抑制MAPK信號通路，下調(diào)磷酸化的ERK 水平，激活PPARγ，PPARγ 被激活后與視黃醛X 受體α 結(jié)合，抑制細胞增殖、促使細胞分化。LI 等［30］和ZHANG 等［31］發(fā)現(xiàn)千層紙素A 可以通過CXCL12/CXCR7 信號軸、Hedgehog 信號軸逆轉(zhuǎn)髓系白血病細胞對伊馬替尼的耐藥性。LI等［32］發(fā)現(xiàn)千層紙素A可以減弱腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）治療急性髓系白血病細胞時伴隨的激活磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，Akt/PI3K）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的負(fù)面效應(yīng)。激活的Akt/PI3K 信號通路負(fù)性調(diào)控癌細胞的分化，NF-κB 被激活后促進腫瘤細胞的增殖。千層紙素A 不僅能增強急性髓系白血病細胞對TNFα 的敏感性，增強其抑制增殖、促進分化的功能外，還能減弱其帶來的上述副反應(yīng)。ZOU 等［33］研究結(jié)果顯示千層紙素A 可以通過mTOR 信號通路途徑促進人惡性膠質(zhì)瘤細胞自噬發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。XU 等［34］發(fā)現(xiàn)千層紙素A 通過抑制人惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和促進腫瘤細胞凋亡來緩解腫瘤發(fā)展過程。

8 結(jié)語

千層紙素A 抗腫瘤活性廣泛，具體表現(xiàn)為抑制癌細胞增殖、重建癌細胞代謝、阻滯癌細胞分裂周期、誘導(dǎo)癌細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)癌細胞對化療藥的耐藥性等方面，其作用的信號通路包括線粒體相關(guān)凋亡信號通路、MAPK/ERK 信號通路、Akt/PI3K 信號通路、mTOR 信號通路、Wnt 信號通路、Notch 信號通路等，顯示出非常顯著的抗腫瘤活性。目前對于千層紙素A 的研究并沒有包括藥物療效對比，它是否優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物或者只能用作輔助抗腫瘤藥物仍未清楚；另外，據(jù)陳衛(wèi)衛(wèi)等［35］在文章中所述，目前千層紙素A 相關(guān)的制劑開發(fā)并不全面，尤其千層紙素A 單方制劑更少之又少，其一般作為黃芩或木蝴蝶的有效成分來發(fā)揮療效。因而對其進行藥物對比研究、制劑開發(fā)的研究，對于尋找高效低毒的抗腫瘤藥物、發(fā)揚祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有重大意義。