新型含有1,4-苯并二噁烷骨架化合物的設計合成與ROCK2抑制活性研究

杜國新，張東蕾

（1. 遼寧何氏醫(yī)學院藥學院， 遼寧 沈陽 110163； 2. 沈陽眼產業(yè)技術研究院有限公司， 遼寧 沈陽 110163）

青光眼是一組引起視神經損傷和視力喪失的眼病，以視網膜神經節(jié)細胞進行性變性為特征。幾種不同類型的青光眼都有視網膜神經節(jié)細胞的死亡，神經元的細胞體在視網膜內部，它們的長軸突形成視神經，這些神經元的退化導致一系列形態(tài)改變，其中最顯著的是視盤的“凹陷”(視神經損傷)，視力永久喪失[1]。青光眼影響著全世界7 000 多萬人，其中10%為雙側失明，是引起世界上不可逆失明的主要原因[2]。在青光眼的幾種亞型中，原發(fā)性開角型青光眼和原發(fā)性閉角型青光眼在亞洲地區(qū)均較為常見，前者占比近2.3%后者占比近1.1%。由于亞洲人口規(guī)模較大，全球原發(fā)性開角型青光眼的50%以上以及原發(fā)性閉角型青光眼的75%以上發(fā)生在亞洲[3]。鑒于青光眼發(fā)病率與高齡的正相關關系，隨著中國老齡化的到來，青光眼預計成為中國老年眼科疾病亟待解決的重大問題[4]。

青光眼的危險因素包括眼壓升高、家族病史和高血壓等。目前，青光眼的藥理學治療主要是通過減少房水的產生或改善房水的流出降低升高的眼壓，降低眼壓是治療青光眼為數不多的方法之一[5]。在人眼中，有60%～80%房水經由前房角的小梁網-施萊姆式管通道流出眼外，另有約15%房水經由葡萄膜鞏膜通道流出眼外[6]。但是目前臨床上常見的治療青光眼的藥物，例如，β受體阻滯劑、碳酸酐酶抑制劑和前列腺素F2α類似物，它們均是通過增強葡萄膜鞏膜通道的房水流出來降低眼壓[7]。從現有的研究成果來看，開發(fā)一種新型的經由小梁網-施萊姆式管通道增加房水外流的藥物，是對現有抗青光眼藥物不同作用機制的有利補充。

ROCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是Rho GTPase 的重要下游效應因子，在調節(jié)平滑肌組織的收縮張力中起著關鍵作用[8]。ROCK 有兩種亞型(ROCK1 和ROCK2)，兩者都在人類小梁網和睫狀體肌細胞中表達。多項實驗證據表明，使用選擇性抑制劑調節(jié)房水流出通道中的ROCK 活性，對青光眼患者眼壓升高的治療有非常顯著的好處，這些抑制劑可以增加房水通過小梁網的引流，導致眼壓下降[9]。截至2020年7月，目前全世界已經有兩款ROCK 抑制劑治療青光眼的藥物成功上市[10]。一個是于2014年在日本上市的Ripasudil (圖1)，其ROCK1 和ROCK2 的IC50分別為51 nM 和19 nM；另一個是于2017年在美國上市的Netarsudil (圖1)，其ROCK2 的IC50為10 nM。通過查閱相關專利文獻，發(fā)現化合物II (圖1)報道有一定的ROCK2 活性，其IC50為10 μM[11]。

圖1 已上市ROCK 抑制劑藥物和化合物Ⅱ的結構

為了開發(fā)具有中國自主知識產權的，能夠治療青光眼的創(chuàng)新藥，本論文試圖找到具有全新骨架藥效團的新化合物，具有一定的體外ROCK2 抑制劑活性，即可滿足自主知識產權的需求，同時又能有力抵抗專利藥知識產權的爭奪戰(zhàn)，為進一步開發(fā)我國治療青光眼的創(chuàng)新藥打下基礎。

1 結果與討論

1.1 目標化合物的設計

將化合物II 的骨架進行翻轉，將活性基團與原二噁烷相連，轉換成與苯環(huán)相連，與此同時活性基團由Netarsudil 的類似活性基團替代(圖2)。這些活性基團包括苯甲酰基、苯乙酰基、氨基甲?；鹊?，另外為了考察伯胺對活性大小的意義，還設計了伯胺被甲磺酰基取代的化合物。

圖2 目標化合物10a-g, 13a-c 分子設計示意圖

1.2 目標化合物的合成

化合物10a-g 按照圖示1 的方法進行合成。

圖示1 目標化合物10a-g 的合成路線

用TIPS-OTf 對4-羥基苯乙酸甲酯(1)進行保護，得到羥基被保護的中間體2 (91.3%)[12]，中間體2 與N-溴甲基鄰苯二甲酰亞胺進行烷基化反應，得到中間體3 (77.0%)[13]，該中間體隨后在氫氧化鋰的作用下水解甲酯鍵和亞胺環(huán)，得到中間體4 (80.0%)[14]，在DMAP 和EDCI 的存在下，中間體4 與2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-胺發(fā)生縮合反應，得到1,4-苯并二噁烷類似物酰胺中間體5 (68.8%)[15]，而環(huán)亞胺完好無損。中間體5 在水合肼的作用下得到伯胺中間體6 (84.5%)，隨后在Boc2O 作用下得到氨基被Boc基團保護的中間體7 (83.0%)，用四丁基氟化銨去除硅基保護基團，得到N-Boc 保護的苯酚中間體8(75.5%)[16]。中間體8 分別與相應的酰氯、羧酸和鹵代烴得到中間體9a-g，隨后在三氟乙酸的作用下脫掉Boc 保護基[17]，得到目標化合物10a-g。

化合物13a-c 按照圖示2 的方法進行合成。用中間體6 與甲磺酰氯發(fā)生胺基的酰化反應得到中間體11 (75.1%)，隨后用四丁基氟化銨去除硅基保護基團，得到胺甲磺?；谋椒又虚g體12 (78.9%)，中間體12 分別與相應的羧酸和鹵代烴得到目標化合物13a-c。所得目標化合物均經過1H NMR、13C NMR、LR MS 和HR MS 進行結構鑒定確認結構正確，經過LC MS 確認質量分數均達到95%。

圖示2 目標化合物13a-c 的合成路線

1.3 目標化合物ROCK2 抑制活性測定

用經典的 ROCK2 酶活性測試方法[18]，以Netarsudil 為陽性對照品[19]，測試了目標化合物10a-g和13a-c 的體外ROCK2 酶抑制劑活性，每個化合物IC50的測試結果見表1。結合化合物II 的活性結果，化合物10e 和10f 表現出了一定的體外ROCK2 酶抑制劑活性，其IC50達到了94.14 μM 和169.69 μM。從10a-g 和13a-c 的活性數據來看，藥效團骨架的A環(huán)為脂肪環(huán)時活性不如芳香環(huán)；從表中可以看到13a-c 的活性不佳，說明側鏈伯胺基被取代則活性下降，保留伯胺基團活性增高；在10a-g 的化合物結構中，側鏈有芳香環(huán)時的活性要明顯好于脂肪環(huán)的活性，且芳香環(huán)在3 位和6 位同時有取代基時，活性增加明顯。

表1 化合物的ROCK2 活性結果

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Bruker Ascend 400、Varian S 400 MHz 型核磁共振儀, 以CDCl3、DMSO-d6、CH3OD 為溶劑, TMS 為內標; Shimadzu LC-20AB 型 HPLC; Agilent Technologies 1200 series 型 LCMS; Agilent 6210 time-of-fight LC/MS; Agela-FL-H600G 型Pre-HPLC。

2.2 實驗方法

2.2.1 4-三異基硅氧基苯乙酸甲酯(2)的合成

稱量4-羥基苯乙酸甲酯(1) 55.0 g 加入反應瓶中，用二氯甲烷280 mL 溶解，0 °C 攪拌下加入二甲基吡啶77.1 mL，同時加入三異丙基硅基三氟甲磺酸酯97.9 mL, 于15 °C 下攪拌反應15 h，反應液變成黃色。TLC 顯示已達反應終點，加入飽和氯化銨溶液500 mL 和二氯甲烷150 mL×2 萃取，將有機層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1 to 10/1)純化得到中間體(2)，淺黃色油狀物97.5 g，收率91.3%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ: 7.11 (d,J= 8.38 Hz, 2 H), 6.78 (d,J=8.38 Hz, 2 H), 3.62～3.53 (m, 5 H), 1.26～1.15 (m, 3 H),1.03 (d,J= 7.28 Hz, 18 H); LCMS (ESI): calcd. for C18H30O3Si [M+H]+: 323.2; found: 323.1 [M+H]+。

2.2.2 3-(N-鄰苯二甲酰亞胺基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酸甲酯(3)的合成

稱量中間體(2) 30.0 g 加入反應瓶中，用四氫呋喃300 mL 溶解，-70 °C 攪拌下加入雙三甲基硅基胺基鋰(1M) 97.7 mL，-70 °C 攪拌1 h，加入N-溴甲基鄰苯二甲酰亞胺24.6 g，并在-70 °C 攪拌反應2 h，反應液變成黃色。TLC 顯示已達反應終點，加入飽和氯化銨溶液500 mL 和乙酸乙酯200 mL×3 萃取，有機層用飽和食鹽水150 mL 洗滌，將有機層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯=100/1 to 10/1)純化得到中間體(3)，白色固體34.5 g，收率77.0%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:7.77(d,J =0.88 Hz, 4 H), 7.08 (d,J =8.60 Hz, 2 H), 6.72 (d,J =8.60 Hz, 2 H), 4.14～4.08 (m, 1 H), 4.04～3.99 (m, 2 H), 3.58 (s, 3 H), 3.31 (s, 2 H), 1.12 (br d,J =7.50 Hz,3 H), 0.94 (dd,J =7.28, 4.85 Hz, 18 H); LCMS (ESI):calcd. for C27H35NO5Si [M+H]+: 482.2; found: 482.2[M+H]+。

2.2.3 3-(N-(2-氨甲酰苯甲酸))-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酸(4)的合成

稱量中間體(3) 124.0 g 加入反應瓶中，用四氫呋喃620 mL 溶解，同時稱量氫氧化鋰一水合物27.0 g用純化水620 mL 溶解，并在20 °C 下加入到四氫呋喃溶液中，并于20 ℃攪拌反應16 h，反應液變成黃色。TLC 顯示已達反應終點，加入1 N 鹽酸500 mL調節(jié)pH 為4，用乙酸乙酯600 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(二氯甲烷/四氫呋喃 = 10/1 to 2/1)純化得到中間體(4)，黃色固體100.0 g，收率80.0%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:13.00～ 12.32 (m, 2 H),8.43～8.33 (m, 1 H), 7.75～7.70 (m, 1 H), 7.52 ～7.43 (m,2 H), 7.20 (d,J =8.56 Hz, 3 H), 6.85 (d,J =8.56 Hz, 2 H), 3.90～3.82 (m, 1 H), 3.69～3.64 (m, 1 H), 3.54～3.44(m, 1 H), 1.30～1.19 (m, 3 H), 1.06 (d,J =7.34 Hz, 18 H); LCMS (ESI): calcd. for C26H35NO6Si [M+H]+: 486.2;found: 486.2 [M+H]+。

2.2.4 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(1,3-鄰苯二甲亞酰-2-基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(5)的合成

稱量中間體(4) 47.0 g加入反應瓶中，用吡啶235 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-胺14.6 g，繼續(xù)加入DMAP 11.8 g 和EDCI 36.9 g，并于25 °C 攪拌反應2 h，反應液變成紅色。TLC 顯示已達反應終點，將反應液旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(5)，黃色油狀物40.0 g，收率68.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.02 (s, 1H),7.80～7.71 (m, 4H), 7.17 (dd,J= 3.0, 5.6 Hz, 3H), 6.90(dd,J= 2.4, 8.8 Hz, 1H), 6.71 (dd,J= 3.4, 8.7 Hz, 3H),4.23～4.08 (m, 6H), 3.94 (dd,J= 6.5, 13.3 Hz, 1H),1.13～1.05 (m, 3H), 0.93 (dd,J= 5.5, 7.3 Hz, 18H);LCMS (ESI): calcd. for C34H40N2O6Si [M+H]+: 601.3;found: 601.3 [M+H]+。

2.2.5 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(6)的合成

稱量中間體(5) 39.0 g加入反應瓶中，用乙醇390 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入水合肼(98%) 6.61 g，并于80 °C 攪拌反應12 h，反應液變混濁。TLC 顯示已達反應終點，反應液過濾后旋蒸后得到殘余物中間體(6)，白色固體29.0 g，收率84.5%。1H NMR (400 MHz, MeOD)δ: 7.25 (d,J= 8.6 Hz, 2H), 7.14 (d,J=2.4 Hz, 1H), 6.91～6.83 (m, 3H), 6.72 (d,J= 8.8 Hz,1H), 4.22～4.16 (m, 4H), 3.74 (dd,J= 5.6, 8.7 Hz, 1H),3.36～3.31 (m, 1H), 2.96 (dd,J= 5.5, 12.8 Hz, 1H),1.30～1.21 (m, 3H), 1.09 (d,J= 7.3 Hz, 18H)。

2.2.6 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(叔丁氧羰基胺基)-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(7)的合成

稱量中間體(6) 28.0 g 加入反應瓶中，用二氯甲烷140 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入Boc2O15.6 g，并于25 °C 攪拌反應2 h，反應液變混濁。TLC 顯示已達反應終點，反應液過濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(7)，白色固體29.0 g，收率83.01%。1H NMR (400 MHz, CH3OD)δ: 7.26 (br d,J =8.4 Hz, 2H),7.13 (d,J =2.4 Hz, 1H), 6.92～6.80 (m, 3H), 6.74 ～6.69(m, 1H), 4.23～4.16 (m, 4H), 3.84 (dd,J =6.2, 8.6 Hz,1H), 3.61～3.52 (m, 1H), 3.43～3.34 (m, 1H), 1.40 (s,8H), 1.28～1.21 (m, 3H), 1.10 (d,J =7.3 Hz, 18H);LCMS (ESI): calcd. for C31H46N2O6Si [M+H]+: 571.3;found : 571.5[M+H]+。

2.2.7 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-(叔丁氧羰基胺基)-2-(4-羥基苯基)丙酰胺(8)的合成

稱量中間體(7) 18.0 g 加入反應瓶中，用四氫呋喃90 mL 溶解，0 °C 攪拌下加入四丁基氟化銨(1M)31.5 mL，并于0 °C 攪拌反應0.5 h，反應液變成紅色。TLC 顯示已達反應終點，加入乙酸乙酯200 mL，用純化水100 mL×3 萃取，有機層旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 50/1 to 0/1)純化得到中間體(8)，類白色固體10.0 g，收率75.5%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.85 (s, 1H),9.28 (s, 1H), 7.22 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.11 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 6.93 (dd,J= 2.4, 8.6 Hz, 1H), 6.84 (br t,J=5.4 Hz, 1H), 6.69 (dd,J= 8.5, 16.0 Hz, 3H), 4.16 (q,J=4.9 Hz, 4H), 3.76 (br t,J= 7.5 Hz, 1H), 3.44～3.36 (m,1H), 3.15 (td,J= 6.3, 13.0 Hz, 1H), 1.33 (s, 9H); LCMS(ESI): calcd. for C22H26N2O6[M+H]+: 415.2; found:415.1[M+H]+。

2.2.8 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(4-硝基苯甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10a)的合成

稱量中間體(8) 850 mg 加入反應瓶中，用二氯甲烷/吡啶(10/1) 20 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺608 mg 和DMAP25.0 mg，并加入4-硝基苯甲酰氯483 mg，并于40 °C 攪拌反應15 h，TLC 顯示已達反應終點，加入飽和碳酸氫鈉20 mL，用二氯甲烷40 mL 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯= 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9a)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9a)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入三氟乙酸2 mL，并于15 °C 攪拌反應3 h，LC-MS顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10a)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10a)，淺黃色固體36 mg，收率13.8%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.20 (s, 1H), 8.43 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 8.36 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.98 (br s, 3H), 7.50 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.38(m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.28 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 6.98 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.79 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.13～4.27(m, 4H), 4.05 (dd,J= 9.2, 5.2 Hz, 1H), 3.48～3.55 (m,1H), 3.07～3.17 (m, 1H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 168.68 (s, 1 C), 163.59 (s, 1 C), 151.13 (s, 1 C),150.41 (s, 1 C), 143.41 (s, 1 C), 140.10 (s, 1 C), 135.41(s, 1 C), 134.86 (s, 1 C), 132.89 (s, 1 C), 131.76 (s, 1 C),129.54 (s, 1 C), 124.50 (s, 1 C), 122.67 (s, 1 C), 117.23(s, 1 C), 113.12 (s, 1 C), 109.12 (s, 1 C), 64.67 (s, 1 C),64.43 (s, 1 C), 49.58 (s, 1 C), 41.50 (s, 1 C); LCMS[M-H]+= 462.1; HR-MS calcd. for C24H21N3O7[M+H]+:464.1; found: 464.148 10 [M+H]+。

2.2.9 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(4-甲基哌嗪甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10b)的合成

稱量中間體(8) 100 mg 加入反應瓶中，用二氯甲烷3 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺146 mg 和DMAP2.95 mg，并加入4-甲基哌嗪甲酰氯102 mg，并于40 °C 攪拌反應15 h，TLC 顯示已達反應終點，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷30 mL 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯= 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9b)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9b)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入三氟乙酸3 mL，并于15 °C 攪拌反應2 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10b)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10b)，無色油狀物36 mg，收率43.7%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:10.19 (s, 1H), 8.00 (br s, 3H), 7.41 (m,J=8.4 Hz, 2H), 7.26 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.17 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.14～4.24 (m, 4H), 4.01 (br dd,J= 9.2, 5.2 Hz,1H), 3.30～3.52 (m, 9H), 3.06 (br d,J= 9.4 Hz, 1H),2.83 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 168.73 (s, 1 C), 152.98 (s, 1 C), 150.91 (s, 1 C), 143.37(s, 1 C), 140.03 (s, 1 C), 134.57 (s, 1 C), 132.92 (s, 1 C),129.19 (s, 1 C), 122.59 (s, 1 C), 117.21 (s, 1 C), 113.07(s, 1 C), 109.06 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.41 (s, 1 C),52.41 (s, 1 C), 49.50 (s, 1 C), 42.85 (s, 1 C), 41.47 (s, 1 C), 40.66～40.70 (m, 1 C); LCMS [M+H]+= 441.1;HR-MS calcd. for C23H28N4O5[M+H]+: 441.2; found:441.201 84 [M+H]+。

2.2.10 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(N-乙基甲基氨基甲酰氧基)苯基)丙酰胺(10c)的合成

稱量中間體(8) 150 mg 加入反應瓶中，用二氯甲烷3 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入三乙胺110 mg 和DMAP4.42 mg，并加入N-乙基甲基氨基甲酰氯66.0 mg，并于40 °C 攪拌反應12 h，TLC 顯示已達反應終點，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷30 mL萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(9c)，直接用于下步反應。將得到的中間體(9c)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應5 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10c)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10c)，白色固體31 mg，收率15.5%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.94～10.08 (m, 1H), 7.34(m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.27 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.06 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 6.97 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.75 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.19 (q,J= 4.8 Hz, 4H), 3.65 (dd,J= 8.8,5.36 Hz, 1H), 3.40 (q,J= 6.8 Hz, 1H), 3.29 (q,J=6.8Hz, 1H), 3.17 (br dd,J= 12.0, 9.2 Hz, 1H), 3.00 (s,2H), 2.88 (s, 3H), 2.78 (br dd,J= 12.4, 5.2 Hz, 1H),1.01～1.20 (m, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ:ppm 171.08 (s, 1 C), 154.10 (br d,J=10.90 Hz, 1 C),150.63 (s, 1 C), 143.34 (s, 1 C), 139.69 (s, 1 C), 136.34(s, 1 C), 133.37 (s, 1 C), 128.98 (s, 1 C), 122.19 (s, 1 C),117.13 (s, 1 C), 112.86 (s, 1 C), 108.79 (s, 1 C), 64.64 (s,1 C), 64.38 (s, 1 C), 55.85 (s, 1 C), 45.97 (s, 1 C), 43.92(s, 1 C), 34.18 (br d,J=34.88 Hz, 1 C), 13.11 (br d,J=79.20 Hz, 1 C); LCMS [M+H]+= 400.1; HR-MS calcd.for C21H25N3O5[M+H]+: 400.2; found: 400.185 53[M+H]+。

2.2.11 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-硝基苯乙酰氧基)苯基)丙酰胺(10d)的合成

稱量中間體(8) 150 mg 和3-硝基苯乙酸78.6 mg加入反應瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌滴加三氯氧磷55.5 mg，并于15 °C 攪拌反應12 h，TLC顯示已達反應終點，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用二氯甲烷30 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到中間體(9d)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9d)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應5 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10d)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10d)，淺黃色固體20 mg，收率9.23%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.16 (s, 1H),8.26～8.37 (m, 1H), 8.18 (br d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.95 (br s, 3H), 7.86 (br d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.67 (t,J= 8.0 Hz,1H), 7.43 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.13～7.30 (m, 3H), 6.95(dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.14～4.26 (m, 6 H), 4.00 (br dd,J= 8.8, 5.2 Hz, 1H),3.48 (br s, 1H), 3.00～3.15 (m, 1H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ: ppm 169.99 (s, 1 C), 168.68 (s, 1 C),150.45 (s, 1 C), 148.24 (s, 1 C), 143.39 (s, 1 C), 140.07(s, 1 C), 137.07 (s, 1 C), 136.62 (s, 1 C), 135.02 (s, 1 C),132.87 (s, 1 C), 130.30 (s, 1 C), 129.43 (s, 1 C), 124.93(s, 1 C), 122.58 (s, 1 C), 117.21 (s, 1 C), 113.10 (s, 1 C),109.10 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.41 (s, 1 C), 49.52 (s, 1 C), 41.50 (s, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M+H]+= 478.0; HR-MS calcd. for C25H23N3O7[M+H]+: 478.1;found: 478.159 05 [M+H]+。

2.2.12 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-硝基-6-甲氧基苯甲氧基)苯基)丙酰胺(10e)的合成

稱量中間體(8) 150 mg 加入反應瓶中，用乙腈30 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入3-硝基-6-甲氧基芐基溴93.5 mg 和碳酸鉀55.0 mg，并于40 °C 攪拌反應12 h，TLC 顯示已達反應終點，加入乙酸乙酯50 mL 后過濾，濾液旋蒸得到中間體(9e)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9e)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸1.0 mL 和二氯甲烷4.0 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應12 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10e)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10e)，類白色固體53 mg，收率26.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.10 (s, 1H), 8.28 (br s, 2H), 7.93 (br s, 3H), 7.32 (br d,J= 8.8 Hz, 2H), 7.27(br d,J= 12.4 Hz, 1H), 7.07 (br d,J= 8.4 Hz, 2H),6.88～7.01 (m, 1H), 6.77 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.12 (s,2H), 4.19 (br d,J= 4.0 Hz, 4H), 3.90～ 4.04 (m, 4H),3.46 (br s, 1H), 3.05 (br s, 1H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6)δ: ppm 169.10 (s, 1 C), 162.42 (s, 1 C),158.16 (s, 1 C), 143.35 (s, 1 C), 141.09 (s, 1 C), 139.95(s, 1 C), 133.01 (s, 1 C), 129.89 (s, 1 C), 129.50 (s, 1 C),126.63 (s, 1 C), 126.15 (s, 1 C), 124.21 (s, 1 C), 117.20(s, 1 C), 115.53 (s, 1 C), 112.99 (s, 1 C), 111.99 (s, 1 C),108.97 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.40 (s, 1 C), 64.32 (s, 1 C), 57.18 (s, 1 C), 49.30 (s, 1 C), 41.55 (s, 1 C); LCMS[M+H]+=480.2; HR-MS calcd. for C25H25N3O7[M+H]+:480.1; found: 480.163 90 [M+H]+。

2.2.13 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-(3-氟苯甲氧基)苯基)丙酰胺(10f)的合成

稱量中間體(8) 150 mg 加入反應瓶中，用四氫呋喃10 mL溶解，25 °C 攪拌下加入3-氟芐基溴68.4 mg和碳酸銫124 mg，并于40 °C 攪拌反應12 h，TLC顯示已達反應終點，加入乙酸乙酯50 mL 后過濾，濾液旋蒸得到中間體(9f)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9f)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸0.5 mL 和二氯甲烷4.5 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應5 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10f)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10f)，白色固體120 mg，收率57.6%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.94 (br d,J= 10.0 Hz,1H), 7.39～7.47 (m, 1H), 7.22～7.32 (m, 5H), 7.07～7.18(m, 1H), 6.97 (br d,J= 8.8 Hz, 3H), 6.75 (d,J= 8.8 Hz,1H), 5.10 (s, 2H), 4.19 (q,J= 4.8 Hz, 4H), 3.58 (br dd,J= 8.8, 5.50 Hz, 1H), 3.14 (br dd,J= 12.4, 9.2 Hz, 1H),2.68 (br s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 171.41 (s, 1 C), 163.88 (s, 1 C), 161.45 (s, 1 C), 157.54(s, 1 C), 143.32 (s, 1 C), 140.66 (s, 1 C), 140.59 (s, 1 C),139.62 (s, 1 C), 133.46 (s, 1 C), 132.06 (s, 1 C), 130.96(s, 1 C), 130.88 (s, 1 C), 129.31 (s, 1 C), 123.88 (s, 1 C),123.85 (s, 1 C), 117.12 (s, 1 C), 115.15 (s, 1 C), 112.79(s, 1 C), 108.71 (s, 1 C), 68.81 (s, 1 C), 64.63 (s, 1 C),64.38 (s, 1 C), 55.68 (s, 1 C), 45.95 (s, 1 C); LCMS[M+H]+= 423.1; HR-MS calcd. for C24H23N2O4[M+H]+:423.2; found:423.172 72 [M+H]+。

2.2.14 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-胺基-2-(4-環(huán)丙基甲氧基苯基)丙酰胺(10g)的合成

稱量中間體(8) 150 mg 加入反應瓶中，用乙腈40 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入溴甲基環(huán)丙烷58.6 mg和碳酸銫177 mg，并于40 °C 攪拌反應12 h，TLC顯示已達反應終點，加入乙酸乙酯50 mL 后過濾，濾液旋蒸得到中間體(9g)，直接用于下步反應。

將得到的中間體(9g)加入反應瓶中，0 °C 攪拌下加入二氯甲烷5.0 mL 溶解，將三氟乙酸1.0 mL 和二氯甲烷4.0 mL 的混合溶液滴加到上述溶液中，并于15 °C 攪拌反應12 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(10g)，加入飽和碳酸氫鈉10 mL，用二氯甲烷15 mL×3 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(10g)，類白色固體50 mg，收率25.4%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:9.92 (br s, 1H),7.17～7.31 (m, 3H), 6.91～7.01 (m, 1H), 6.87 (br d,J=8.4 Hz, 2H), 6.75 (br d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.19 (br d,J=4.4 Hz, 4H), 3.77 (br d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.56 (br dd,J=8.4, 5.6 Hz, 1H), 2.98～3.24 (m, 3H), 2.66～2.79 (m, 1H),1.12～1.34 (m, 1H), 0.55 (br d,J= 7.2 Hz, 2H), 0.29 (br d,J= 4.4 Hz, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ:ppm 171.39 (s, 1 C), 158.05 (s, 1 C), 143.31 (s, 1 C),139.59 (s, 1 C), 133.48 (s, 1 C), 131.35 (s, 1 C), 129.22(s, 1 C), 117.14 (s, 1 C), 114.78 (s, 1 C), 112.74 (s, 1 C),108.65 (s, 1 C), 72.40 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.37 (s, 1 C), 55.47 (s, 1 C), 45.80 (s, 1 C), 10.63 (s, 1 C), 3.56 (s,1 C); LCMS [M+H]+= 369.1; HR-MS calcd. for C21H24N2O4[M+H]+: 369.2; found: 369.164 93 [M+H]+。

2.2.15 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-三異丙基硅氧基苯基)丙酰胺(11)的合成

稱量中間體(6) 6.0 g 和三乙胺1.44 g 加入反應瓶中，用二氯甲烷60 mL 溶解，10 °C 攪拌下滴加甲磺酰氯1.30 g，并于25 °C 攪拌反應12 h，TLC 顯示已達反應終點，將反應液旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(11)，黃色固體3.90 g，收率75.1%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.98 (s, 1H), 7.11～7.27(m, 4H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.79 ～6.87 (m,2H), 6.68～6.77 (m, 1H), 4.15～4.21 (m, 4H), 3.75～3.79(m, 1H), 3.52～3.60 (m, 1H), 3.12～3.17 (m, 1H),3.01～3.02 (m, 1H), 2.83 (s, 3H), 1.18～1.26 (m, 3H),1.04 (d,J= 7.2 Hz, 18H)。

2.2.16 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-羥基苯基)丙酰胺(12)的合成

稱量中間體(11) 3.9 g 加入反應瓶中，用四氫呋喃40 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加四丁基氟化銨(1M)7.11 mL，并于0 °C 攪拌反應0.5 h，TLC 顯示已達反應終點，反應液用乙酸乙酯200 mL 和純化水50 mL 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸后得到殘余物，殘余物通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯 = 5/1 to 0/1)純化得到中間體(12)，白色固體2.2 g，收率78.9%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.93(s, 1H), 9.35 (s, 1H), 7.25 (d,J= 2.4 Hz, 1H), 7.12～7.19 (m, 3H), 6.96 (dd,J= 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.74 (br d,J= 8.8 Hz, 1H), 6.71 (br d,J= 8.4 Hz, 2H), 4.14～4.22(m, 4H), 3.72 (dd,J= 9.2, 5.6 Hz, 1H), 3.54 (ddd,J=13.2, 9.2, 6.0 Hz, 1H), 3.06～3.15 (m, 1H), 2.83 (s, 3H)。

2.2.17 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-(4-硝基苯甲酰氧基)苯基)丙酰胺(13a)的合成

稱量中間體(12) 100 mg 和4-硝基苯甲酸55.4 mg 加入反應瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加三氯氧磷78.2 mg，并于0 °C 攪拌反應3 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(13a)，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用乙酸乙酯20 mL 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(13a)，黃色固體28.0 mg，收率19.6%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:10.11 (br s, 1H), 8.29～8.49 (m, 4H), 7.49 (br d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.21～7.42 (m, 4H), 6.99 (br d,J= 8.0 Hz, 1H),6.77 (br d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.20 (br s, 4H), 3.95 (br s,1H), 3.64 (br s, 1H), 3.15～3.27 (m, 1H), 2.88 (br s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 169.78 (s, 1 C),163.65 (s, 1 C), 151.09 (s, 1 C), 150.04 (s, 1 C), 143.38(s, 1 C), 139.88 (s, 1 C), 136.52 (s, 1 C), 134.88～134.95(m, 1 C), 133.17 (s, 1 C), 131.76 (s, 1 C), 129.51 (s, 1 C),124.47 (s, 1 C), 122.28 (s, 1 C), 117.20 (s, 1 C), 112.89(s, 1 C), 108.83 (s, 1 C), 64.65 (s, 1 C), 64.40 (s, 1 C),52.69 (s, 1 C), 45.35～46.15 (m, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M-H]+=540.1; HR-MS calcd. for C25H23N3O9S[M-H]+: 540.1; found: 540.109 73 [M-H]+。

2.2.18 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-(4-硝基苯乙酰氧基)苯基)丙酰胺(13b)的合成

稱量中間體(12) 100 mg 和4-硝基苯乙酸60.0 mg 加入反應瓶中，用吡啶2 mL 溶解，0 °C 攪拌下滴加三氯氧磷78.2 mg，并于0 °C 攪拌反應2 h，反應液變成棕色，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(13b)，加入飽和碳酸氫鈉2 mL，用乙酸乙酯20 mL 萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(13b)，黃色固體28.0 mg，收率19.8%。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ:10.06 (s, 1H), 8.24 (m,J= 8.8 Hz, 2H), 7.68 (m,J= 8.4 Hz, 2H), 7.42 (m,J= 8.4 Hz,2H), 7.25 (br d,J= 2.0 Hz, 2H), 7.09～7.20 (m, 2H),6.96 (dd,J= 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.76 (d,J= 8.8 Hz, 1H),4.12～4.24 (m, 6H), 3.89 (br dd,J= 8.8, 6.0 Hz, 1H),3.55～3.67 (m, 1H), 3.16～3.27 (m, 1H), 2.85 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 169.78 (s, 1 C),169.74 (s, 1 C), 150.04 (s, 1 C), 147.18 (s, 1 C), 143.36(s, 1 C), 142.31 (s, 1 C), 139.86 (s, 1 C), 136.14 (s, 1 C),133.15 (s, 1 C), 131.51 (s, 1 C), 129.40 (s, 1 C), 123.93(s, 1 C), 122.18 (s, 1 C), 117.19 (s, 1 C), 112.86 (s, 1 C),108.80 (s, 1 C), 64.64 (s, 1 C), 64.39 (s, 1 C), 52.66 (s, 1 C), 45.71 (s, 1 C), 40.69～40.75 (m, 1 C); LCMS [M-H]+= 554.0; HR-MS calcd. for C26H25N3O9S [M+H]+: 556.1;found: 556.138 19 [M+H]+。

2.2.19 N-(2, 3-二氫-1, 4-苯并二氧六環(huán)-6-基)-3-甲磺酰胺基-2-(4-環(huán)丙甲氧基苯基)丙酰胺(13c)的合成

稱量中間體(12) 150 mg 加入反應瓶中，用乙腈40.0 mL 溶解，25 °C 攪拌下加入溴甲基環(huán)丙烷61.9 mg 和碳酸銫187 mg，并于40 °C 攪拌反應12 h，LC-MS 顯示原料已反應完，且發(fā)現產物(13c)，反應液中加入乙酸乙酯20 mL，過濾旋蒸得到殘余物，殘余物通過制備型HPLC 得到目標產物(13c)，白色固體31.0 mg，收率18.0%。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ:9.96 (s, 1H), 7.15～7.32 (m, 4H),6.82～6.99 (m, 3H), 6.74 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 4.18 (q,J=4.8 Hz, 4H), 3.71～3.84 (m, 3H), 3.42～3.65 (m, 1H),3.09～3.19 (m, 1H), 2.84 (s, 3H), 1.13～1.26 (m, 1H),0.48～0.61 (m, 2H), 0.24～0.35 (m, 2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ: ppm 170.28 (s, 1 C), 158.33 (s, 1 C),143.32 (s, 1 C), 139.70 (s, 1 C), 133.32 (s, 1 C), 130.24(s, 1 C), 129.27 (s, 1 C), 117.19 (s, 1 C), 114.90 (s, 1 C),112.72 (s, 1 C), 108.64 (s, 1 C), 72.44 (s, 1 C), 64.63 (s,1 C), 64.37 (s, 1 C), 52.44 (s, 1 C), 45.77 (s, 1 C), 39.81～39.87 (m, 1 C), 10.61 (s, 1 C), 3.55 (s, 1 C); LCMS[M+H]+= 447.2; HR-MS calcd. for C22H26N2O6S [M+H]+:447.2; found: 447.161 70 [M+H]+。

2.2.20 化合物ROCK2 活性測定

利用Echo 移液系統(tǒng)進行化合物稀釋，化合物起始濃度為10 μM，4 倍梯度稀釋，11 個濃度點，每個濃度兩個重復，按照預先設計的布局，用Echo移液系統(tǒng)將每個濃度的化合物中的100 nL 轉移到檢測板相應的孔中，在1 000 r·min-1下離心15 s。用40 mM Tris,7.5、20 mM MgCl2、0.1 mg·mL-1BSA 和50 μm DTT 配制ROCK2 激酶緩沖液。用激酶緩沖液準備含0.4 μg·μL-1S6K 底物和20 μM ATP 的混合液，加2.5 nL 的混合液到實驗板相應孔中，振蕩實驗板15 s，在1 000 r·min-1下離心15 s。用激酶緩沖液稀釋ROCK2 酶濃度至0.12 μg·mL-1，將該ROCK2 酶溶液2.5 μL 到實驗板相應孔(5 μL 反應體系中終濃度為0.3 ng ROCK2, 10 μM ATP 和 0.2 μg·μL-1S6K 底物)。室溫23 ℃下，孵育60 min。加5 μL ADP-Glo? 試劑至實驗板相應孔中, 振蕩實驗板15 s，然后1 000 r·min-1，離心15 s，將實驗板置于23 ℃ 孵育40 min。加入10 uL 激酶檢測試劑，振蕩實驗板15 s，然后1 000 r·min-1，離心15 s，將實驗板置于23 ℃ 孵育30 min。Envision 讀取實驗板的發(fā)光信號，并加以分析。

3 結論

根據本研究的活性數據，總結目標化合物ROCK2 活性構效關系如下：1）由于10a-d、10g 和13a-c 化合物的ROCK2 抑制劑活性一般，同時參考Netarsudil 和化合物II，說明在藥效團的骨架結構中A 環(huán)為脂肪環(huán)時，會導致活性下降的非常明顯，A環(huán)為芳香環(huán)時會保持較高的活性；2）B 環(huán)為脂肪環(huán)時同樣會導致活性的下降，B 環(huán)為芳香環(huán)時活性較好，藥效團的A 環(huán)和B 環(huán)，最好為兩個相鄰的芳香環(huán)組成，與靶點蛋白形成疏水作用，會具有很好的ROCK2 抑制劑活性；3）化合物13a-c 的伯胺被甲磺酰基取代后的活性一般，說明化合物的側鏈結構中，最好有伯胺基團，其氨基上的氫可以和靶點蛋白形成較強的氫鍵，使活性增高；4）側鏈中含有芳香環(huán)的10e 和10f 具有一定的活性，而脂肪環(huán)10b、10c 和10g 的活性結果一般，說明側鏈的結構中最好有一個芳香環(huán)，且該芳香環(huán)在3 位和6 位有取代基的話，會增強活性。本研究結果同時顯示化合物10e 和10f 表現出了一定的體外ROCK2 酶抑制劑活性。接下來的研究會進一步按照該構效關系，以化合物10e 和10f 為基礎設計新的藥效團骨架，試圖找到具備有進一步開發(fā)價值的可用于治療青光眼的新型ROCK2 抑制劑。