石油烴降解菌降解性能及其對含油土壤的修復(fù)

李敏，李婷婷，彭湃，王恩彪，孟垚，李彥成，侯欣園，楊思宇，魏小娜＊

（1. 遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001； 2. 沈陽化工研究院有限公司，遼寧 沈陽 110021）

據(jù)統(tǒng)計，全世界每年進入環(huán)境的石油烴累計約800 萬t，大量石油烴最終歸口于土壤，其帶來的土壤污染問題日益突出。因此，石油烴污染土壤修復(fù)備受關(guān)注[1]。

微生物修復(fù)技術(shù)不會引起土壤結(jié)構(gòu)改變和二次污染，被廣泛應(yīng)用于含油土壤的修復(fù)[2]。但是，單一菌株降解效果差，且降解速率隨著時間延長不斷降低。構(gòu)建復(fù)合菌群可利用不同菌株的協(xié)同作用，獲得較好的石油烴降解效果[3]。然而以游離菌形式進入土壤的大部分外源降解菌易受土壤微環(huán)境變化、污染物本身的影響，不易定殖，難以達到預(yù)期效果。微生物固定化技術(shù)通過將微生物固定在相應(yīng)的載體上，使微生物在適宜條件下能夠快速、大量增殖并保持生物活性[4]。選擇適宜的固定化載體還可對土壤產(chǎn)生一定的保水作用，提高土壤營養(yǎng)物質(zhì)含量，提高微生物對有機質(zhì)、全氮和速效磷的利用率[5]。

本研究考察了篩選出的3 株石油烴降解菌去除石油烴的性能，采用吸附法制備固定化菌劑，比較了降解菌不同引入方式對污染物的去除性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 污染物

所用石油為大慶油田原油，密度為0.858 g·cm-3（20 ℃），凝固點為25.6 ℃，黏度為20.9 mPa·s（50 ℃），該石油中飽和烴、芳香烴和膠質(zhì)瀝青質(zhì)所占比例分別為60.5%、33.5%和6.0%。

1.1.2 供試土壤

土壤取自遼寧省彰武縣無污染的土壤，采集20～40 cm 土層樣品，經(jīng)風(fēng)干、碾碎，去除殘根等雜質(zhì)，過2 mm 篩，后續(xù)用于微生物修復(fù)實驗。土壤的理化性質(zhì)見表1。

石油烴污染土壤制備：取石油50 g 溶解于500 mL 丙酮，分散均勻后，邊攪拌邊添加到1 000 g土壤中；25 ℃避光條件下通風(fēng)老化，每日早晚各攪拌一次；待丙酮揮發(fā)完全后繼續(xù)通風(fēng)老化10 d，進行滅菌處理，初始石油烴質(zhì)量分數(shù)為44.32 g·kg-1，備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 為0.5 g·L-1，CaCl2為0.02 g·L-1，KH2PO4為1.0 g·L-1，NH4Cl 為2.0 g·L-1，F(xiàn)eCl3為0.05 g·L-1，pH=7。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨為10 g·L-1，酵母膏為5 g·L-1，氯化鈉為10 g·L-1，瓊脂粉為15 g·L-1， pH=7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.4 供試菌株

采用前期實驗從油田含油污泥中篩選出的C3、C4、C5 3 株具有石油烴降解性能的菌株作為供試菌株，經(jīng)16S rDNA 序列與Gene Bank 中已知序列進行比對，并結(jié)合生理生化實驗結(jié)果，確定 C3 為Pseudomonas putida ， C4 為Acinetobacter calcoaceticus，C5 為Sphingomonas sp.。

1.2 實驗方法

1.2.1 原油降解率測定

按正交優(yōu)化條件下的最佳接種比例將3 株單菌的菌懸液進行混合得復(fù)合菌劑。將活化至對數(shù)生長期的單菌株和復(fù)合菌懸液（約109 cfu·mL-1）2 mL接入100 mL 含0.5%石油烴的無機鹽培養(yǎng)基中，以不接菌的100 mL 含0.5%石油烴的無機鹽培養(yǎng)基作為對照，于30 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩搖床分別培養(yǎng)28 d。用三氯甲烷萃取培養(yǎng)基中的殘余油分，采用紅外分光光度法測定石油烴質(zhì)量分數(shù)。細菌生長以波長600 nm 處的濁度OD600 表示。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。

1.2.2 固定化菌劑制備

取2.0 g 粒徑為0.25 mm 的生物炭作為載體，高壓滅菌后加入到100 mL LB 培養(yǎng)基中，接入6 mL復(fù)合菌懸液，30 ℃、150 r·min-1震蕩培養(yǎng)36 h，離心得到的菌體用生理鹽水洗滌2 次，即得固定化菌劑[6]。

1.2.3 不同菌劑加入方式對含油土壤的修復(fù)

稱取1 kg 經(jīng)過滅菌處理的石油烴污染土于花盆（直徑 18 cm、高 25 cm）中，保持土壤35%的濕度。試驗共設(shè)5 組處理：滅菌污染土（CK）、添加生物炭（BC）、添加游離復(fù)合菌劑（TB）、添加固定化菌劑（CTB）、添加游離復(fù)合菌+生物炭（TB+BC），其中游離復(fù)合菌和固定化菌劑含同等生物量（約3×109～8×109cfu·g-1），每個添加生物炭的處理生物炭添加量相同，每個處理設(shè)置3 個平行。分別于第 0、7、14、21、28 天進行取土樣，測定土壤中石油烴質(zhì)量分數(shù)，試驗結(jié)束時測定土壤中的微生物量。

1.3 測試方法

采用梯度稀釋法對固定化菌劑和游離復(fù)合菌劑生物量進行測定，具體方法為：將1.0 g 固定化菌劑加入錐形瓶中，加入100 mL 無菌水，180 r·min-1培養(yǎng)30 min。取菌液1 mL 進行梯度稀釋后，進行涂布平板計數(shù)。游離復(fù)合菌劑培養(yǎng)液中細菌數(shù)量的確定亦取1 mL 生長至對數(shù)期的菌液進行梯度稀釋，涂布平板計數(shù)[7]。計算1 mL 游離微生物菌液與1 g 固定化菌劑數(shù)量之間的關(guān)系[8]。

采用柱層析法分離石油烴族組分[9]，采用紅外分光測油儀測定分離出的族組分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的生長曲線及石油烴降解性能

如圖1 所示，在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中石油烴的質(zhì)量分數(shù)隨著菌體密度的增加而逐步降低。菌株C3的對數(shù)生長期為0～16 d，C4 的對數(shù)生長期為0～18 d，C5 的對數(shù)生長期為0～14 d。培養(yǎng)14 d 時，C3、C4、C5和復(fù)合菌石油烴降解率分別為30.58%、35.76%、29.45%、42.73%。菌株進入凋亡期后，對培養(yǎng)基中的石油烴降解速率放緩。培養(yǎng)28 d 時，C3、C4、C5 和復(fù)合菌對石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。結(jié)果表明，3 株菌均可以石油烴作為唯一碳源和能源生長，對數(shù)生長期石油烴去除率與菌體生長密度呈正相關(guān)，前14 d 對石油烴的降解能力復(fù)合菌＞C4＞ C3＞C5。14～28 d 期間，C3、C4對石油烴的降解率僅增加14.23%和12.25 %，C5 和復(fù)合菌對石油烴的降解率增加了24.45%和37.00%。

圖1 石油烴降解菌生長曲線及石油烴殘留率變化

通過降解菌對石油烴不同組分的去除率（圖2）分析，可見C3、C4 對飽和烴的去除率高于對芳香烴的去除率，C5 對芳香烴的利用能力要優(yōu)于C3、C4，對烷烴的去除率在3 株菌種中最低。復(fù)合菌劑對飽和烴和芳香烴的去除率分別達到 84.93%和82.08%。這一現(xiàn)象可能與菌種對石油烴不同組分的選擇性降解有關(guān)。如Pseudomonas細菌可利用石油烴各組分，而Acinetobacter對石油組分的降解能力為烷烴＞環(huán)烷烴＞芳香烴[10]，Sphingomonas則被認為對多種芳香族化合物具有高效降解能力[11]。通過對3 株菌的復(fù)配對石油烴各組分去除具有協(xié)同的效果，可大大提高石油烴去除率。

圖2 石油烴降解菌生長曲線及石油烴殘留率變化

2.2 不同處理石油烴降解率變化

含油土壤修復(fù)過程中石油烴降解率變化如圖3所示。修復(fù)結(jié)束后，各處理石油烴平均降解率從高到低依次為CTB＞TB+BC＞TB＞BC＞CK。固定化復(fù)合菌對石油烴的去除率為78.32%，遠高于其他處理。游離復(fù)合菌對石油烴平均降解率僅為45.81%，而在其生物量相當(dāng)?shù)那闆r在原油降解試驗中游離復(fù)合菌對石油降解率達到79.73%，這是因為原油降解在理想的培養(yǎng)條件下進行，且石油烴含量相對較低，而土壤環(huán)境要復(fù)雜的多，石油烴易吸附于土壤顆粒上導(dǎo)致其生物可給性差。CK 組最終石油烴去除率為2.96%，可能源于某些組分的揮發(fā)。對比TB+BC、TB、BC 3 組處理可見，復(fù)合菌和生物炭的簡單混合可在一定程度上提高石油烴的降解率，且其降解率要高于TB 和BC 組降解率之和，說明TB 和BC 聯(lián)用對石油烴的去除具有協(xié)同效應(yīng)，高于TB 和CK 的2 個對照組，它們的石油烴降解率為分別為46.81%、2.96%。固定化復(fù)合菌劑之所以能更好地促進石油烴降解，是由于生物炭在吸附大量菌體的同時，石油烴被吸附在生物炭的孔隙中，增加了石油烴降解菌與石油烴的接觸，且生物炭表面的官能團，易解碳源和氮源有助于增強降解菌活性，進而提高石油烴降解率[12-13]。

圖3 修復(fù)過程中石油烴降解率隨時間變化

2.3 微生物數(shù)量

修復(fù)結(jié)束后各處理土壤微生物量如圖4 所示，土壤樣品中微生物數(shù)量由大到小順序依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。這說明，在修復(fù)石油烴污染土過程中，各處理石油烴降解菌株均能夠在污染土壤中有效定殖。其中 CTB 處理組微生物數(shù)量為7.2×1010cfu·g-1，比初始增加了1 個數(shù)量級，TB 處理微生物數(shù)量較初始降低了1 個數(shù)量級，TB+BC 處理較初始略有降低。這說明生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，以固定化微生物方式加入土壤對降解菌的數(shù)量增加最為有利。這可能是由于以生物炭作為載體為降解菌提供了適宜的生存環(huán)境，減少土壤中石油烴對微生物細胞的毒害作用[14-15]，從而有助于石油烴降解菌株的定殖和石油烴的降解。

圖4 修復(fù)結(jié)束后土壤微生物數(shù)量

3 結(jié)論

3 株石油烴降解菌株均能以石油烴為唯一碳源和能源生長， 30 ℃培養(yǎng)28 d 后，C3、C4、C5 和復(fù)合菌對石油烴的降解率分別為45.34%、48.58%、54.56%和79.73%。C3、C4 對飽和烴的去除能力較強，C5 對芳香烴的去除能力較強，3 株菌復(fù)配后的復(fù)合菌對石油烴各組分的去除具有協(xié)同效果。

生物炭與復(fù)合菌聯(lián)用對石油烴的去除具有協(xié)同效應(yīng)，生物炭固定化復(fù)合菌對石油烴污染土壤修復(fù)效果最好，修復(fù)28 d 對石油烴的去除率為78.32%。

修復(fù)結(jié)束后，不同微生物添加方式下土壤中微生物數(shù)量表現(xiàn)出差異性，由大到小依次為CTB＞ TB+BC＞ TB。生物炭的加入有利于降解菌在土壤中的定殖，其中生物炭作為固定化載體加入土壤對降解菌的數(shù)量增加最為有利。