刺萼龍葵與少花龍葵植物內(nèi)生菌比較研究

張喜葦 張伊凡 張玉瑤 徐雯 黃婷 張晶

摘要：外來植物入侵對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的危害極大，已成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。利用可培養(yǎng)方法，從入侵植物刺萼龍葵及其近緣非入侵植物少花龍葵體內(nèi)分別分離出11株和5株內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌種類居多，兩者共有的種類包括貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌3種;不同內(nèi)生菌在兩類植物體內(nèi)根、莖、葉不同部位分布具有一定的差異性。研究結(jié)果為闡明入侵植物刺萼龍葵的入侵機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌;植物入侵;刺萼龍葵;少花龍葵

中圖分類號：S451;R284? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1674-1161（2021）01-0027-03

外來生物入侵威脅農(nóng)田環(huán)境生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類健康，因此受到各國研究者的廣泛關(guān)注。刺萼龍葵（Solanum rostratum）又稱刺茄、黃花刺茄，是茄科茄屬的一種有嚴(yán)重危害的惡性植物，在我國被列為具有較大入侵危險性的檢疫植物。少花龍葵（Solallum nigrum）別名白花菜，是茄科一年生草本植物，其為刺萼龍葵的近緣非入侵種。植物內(nèi)生菌與高等植物在長時間的協(xié)同進(jìn)化中，與植物體內(nèi)物質(zhì)或根際分泌物等相互作用，提高宿主植物養(yǎng)分吸收能力、抗逆性、抗氧化性及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力等，通過促進(jìn)宿主植物的生長來提高其入侵能力。

目前，國內(nèi)外對刺萼龍葵的研究多集中在傳粉機(jī)制、生物學(xué)特性、萌發(fā)特性、除草劑篩選及土壤根際微生物群落的影響等方面，很少探討入侵植物和其近緣非入侵植物內(nèi)生菌多樣性的差異，以及其對植物入侵能力或過程的影響等。本課題主要通過可培養(yǎng)分離方法，探討比較入侵植物刺萼龍葵和其近緣非入侵植物少花龍葵植物內(nèi)生菌種類的差異，以揭示植物內(nèi)生菌在植物入侵過程中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用刺萼龍葵、少花龍葵種植于常熟理工學(xué)院溫室大棚內(nèi)，種植時間為2018年5月27日—8月25日，于2018年8月植株成年時期采集，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行內(nèi)生菌的分離。Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技股份有限公司;Taq酶：日本Takara（寶）生物股份有限公司。內(nèi)生菌分離選用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP9162電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司;PCR擴(kuò)增儀：美國BIO-RAD公司;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 內(nèi)生菌的分離、純化 將植株切碎塊研磨成勻漿菌懸液，依次用生理鹽水梯度稀釋，得到菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，做2個重復(fù)，進(jìn)一步培養(yǎng)觀察。根據(jù)肉眼觀察，對菌落進(jìn)行分類、標(biāo)記。多次純化直至得到單一菌落，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴(kuò)增 提取內(nèi)生菌基因組總DNA，并以其為模板，采用細(xì)菌通用引物Eu-bac 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和Eu-bac 1492R （5'-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3'）對細(xì)菌基因組的16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.3 菌株序列測定與比對 將內(nèi)生菌菌株送至蘇州金唯智測序公司進(jìn)行測序，得到序列結(jié)果分別與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫中親緣關(guān)系相近的菌種利用BLAST軟件進(jìn)行比對，查找相似度最高的序列，確定菌株的分類學(xué)地位，并在此基礎(chǔ)上利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

將測得的序列與NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，找出相似度最高的完整序列，最終歸類、確定內(nèi)生菌的種類。從刺萼龍葵中分離出11株內(nèi)生菌，其中10株為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、米虎芽孢桿菌，1株為微小桿菌屬（見表1）。從少花龍葵分離出5株內(nèi)生菌，其中3株內(nèi)生菌為芽孢桿菌屬，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，2株分別為泛菌屬和微桿菌屬（見表2）。

由表1和表2可知：入侵植物刺萼龍葵中內(nèi)生菌的種類多于其近緣非入侵植物少花龍葵。刺萼龍葵與少花龍葵共有的菌有3種，分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌。芽孢桿菌是一類植物根際促生菌，對植物生長具有重要作用。很多研究都從不同種類入侵植物內(nèi)分離到了芽孢桿菌。石青等人發(fā)現(xiàn)，入侵植物黃頂菊聚集對自身有益的功能性細(xì)菌（耐寒短桿菌和巨大芽孢桿菌），并通過化感物質(zhì)直接或間接地促進(jìn)生長，同時對一些病源微生物（尖孢鐮刀菌等）有抑制作用，從而成功入侵。以往研究顯示，貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生生防因子，防治植物病害，促進(jìn)生長;枯草芽孢桿菌具有促生長效果和產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）能力;解淀粉芽孢桿菌分泌脂肽類抗菌物質(zhì)，產(chǎn)生拮抗作用，通過營養(yǎng)與空間的競爭，誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長。這3種菌均具有抗病促生、改良土壤微環(huán)境的作用。

在一定程度上，刺萼龍葵體內(nèi)的內(nèi)生菌種類比少花龍葵多8種，這些內(nèi)生菌除了上述作用外，其中的賴氨酸芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌是解磷生物，可增強(qiáng)植物對磷的利用率，提高營養(yǎng)物質(zhì)、微量元素及礦質(zhì)元素的吸收率，從而促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長;微小桿菌屬、耐熱芽孢桿菌可作為優(yōu)勢菌株調(diào)節(jié)菌群，降解土壤污染有機(jī)物，減少其對植株的毒害作用。此外，少花龍葵中還分離出泛菌屬、微桿菌。研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬具有固氮作用，在一定程度上增強(qiáng)了少花龍葵作為本土植物的抵抗力。

內(nèi)生菌在植物的根、莖、葉中分布規(guī)律略有不同（見表3）。對于入侵植物刺萼龍葵來說，根內(nèi)的微生物種類最多，有除微小桿菌外的10種內(nèi)生菌，莖部有4種內(nèi)生菌，葉部有3種內(nèi)生菌;貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌在3個部位均有分布。對于非入侵植物少花葵來說，根、莖和葉分別有4種、3種和2種內(nèi)生菌;貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌在3個部位具有分布，而泛菌屬僅在莖部分布。與刺萼龍葵不同，解淀粉芽孢桿菌僅在少花龍葵根內(nèi)分離到。解淀粉芽孢桿菌可以產(chǎn)生赤霉素、吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等多種生理活性物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)，起到促進(jìn)植物根系及植株生長、增強(qiáng)植物抗病性的作用，從而間接地減少病害。

兩種植物分離出的所有內(nèi)生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

3 結(jié)論

入侵植物與微生物之間的相互作用顯著影響入侵植物的適應(yīng)性和競爭力，并在其入侵進(jìn)程中發(fā)揮不同的作用。本課題通過可培養(yǎng)方法，比較入侵植物刺萼龍葵和其近緣非入侵少花龍葵根莖葉不同部位內(nèi)生細(xì)菌。從植物刺萼龍葵分離出11種細(xì)菌，其中10種是芽孢桿菌;從少花龍葵中分離出5種細(xì)菌，其中3種是芽孢桿菌。今后將進(jìn)一步通過試驗(yàn)來驗(yàn)證這些細(xì)菌在促生、固氮及解磷等方面的生理功能及其對植物入侵的生態(tài)效應(yīng)，從而深入探索植物內(nèi)生菌如何與植物相互作用及入侵過程的影響機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳志剛，方焱，秦萌，等.刺萼龍葵對中國玉米產(chǎn)業(yè)造成的潛在經(jīng)濟(jì)損失評估[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，20（6）：138-145.

[2] 魏守輝，張朝賢，劉延，等.外來雜草刺萼龍葵及其風(fēng)險評估[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（3）：347-351.

[3] 王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等.植物內(nèi)生細(xì)菌及其對入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（3）：9-12.

[4] 程丹丹，趙菁，田忠賽.入侵植物小蓬草的細(xì)菌群落組成和多樣性研究[J].安全與環(huán)境工程，2019（2）：16-24.

[5] 保朱壽能.紫莖澤蘭根內(nèi)生固氮菌的分離及促生效應(yīng)研究[D].昆明：云南大學(xué)，2017.

[6] 石青.耐寒短桿菌和巨大芽孢桿菌在黃頂菊入侵過程中的作用[D].保定：河北大學(xué)，2018.

Comparative Study on Endophytes of Solanum Nigrum and Solallum Nigrum

ZHANG Xiwei， ZHANG Yifan， ZHANG Yuyao， XU Wen， HUANG Ting， ZHANG Jing*

（School of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Suzhou Jiangsu 215500， China）

Abstract： The invasion of exotic plants is harmful to agricultural production in China and has become one of the main factors restricting the sustainable development of agriculture. Using culturable methods， 11 and 5 endophytic bacteria were isolated from the invasive plant Solanum nigrum and its related non-invasive plant Solanum nigrum， among which bacillus were the most common species， and the common species of the two plants were bacillus belis， bacillus subtilis and bacillus amylolyticus; The distribution of different endophytic bacteria in different parts of root， stem and leaf of the two kinds of plants was different. The results provide a theoretical basis for expounding the invasion mechanism of the invasive plant solanum nigrum.

Key words： endophytic bacteria; plant invasion; Solanum rostratum; Solanum nigrum