鷺鷥草組織培養(yǎng)再生體系的建立

朱恒星，戴前莉，盧 敏，黃飛逸，雷光祥，陳本文

（1.重慶市林業(yè)科學(xué)研究院，重慶市 400036；2.重慶市巴南區(qū)退耕還林管理中心，重慶市 401320）

鷺鷥草（Diuranthera major）又名鷺鷥蘭，為我國特有的百合科（Liliaceae）鷺鷥草屬多年生草本植物，有較高的觀賞和藥用價(jià)值。迄今，該屬僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)物種：鷺鷥草、小鷺鷥草（D.minor）和南川鷺鷥草（D. inarticulata）[1]，根內(nèi)均含鷺鷥蘭甙A、B、C、D和E 等藥用化學(xué)成分[2-4]；其中，鷺鷥草在我國方劑產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用。由于生境遭到破壞，鷺鷥草僅零星分布于我國四川、云南和貴州等野外地區(qū)[5]，目前以野生采挖為主要來源，急需開展該瀕危物種的保護(hù)，對于發(fā)展鷺鷥草民族醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)意義重大。

近年來，百合科植物的組織培養(yǎng)技術(shù)已相對成熟，可實(shí)現(xiàn)工廠化育苗，多以鱗莖[6]和種子[7]等為外植體實(shí)現(xiàn)無性快繁[8-9]。鷺鷥草肉質(zhì)根污染率高，種子后代分化較大，不宜進(jìn)行優(yōu)系繁育。 目前，已有花序軸成功建立組培再生體系的報(bào)道[10-11]，鷺鷥草花量較大，便于取材繁殖，其相關(guān)研究未見報(bào)道，僅有少量與種子萌發(fā)有關(guān)的研究[12]。本研究通過鷺鷥草花序軸無菌離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽，從而建立鷺鷥草組織培養(yǎng)再生體系，可以高效快速地繁殖種苗，緩解野生資源瀕危的現(xiàn)狀，為鷺鷥草產(chǎn)業(yè)大規(guī)模發(fā)展提供種苗以及技術(shù)支撐，對該物種的可持續(xù)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

供試材料由重慶市林業(yè)科學(xué)研究院提供，鷺鷥草植株為從酉陽縣引種至溫室大棚馴化栽培的成熟植株。2019年7月上旬，選取健康植株的未開放花序軸為外植體（圖1）。

1．2 方法

1．2．1 花序軸的無菌處理

以未開放花序軸為外植體，剝?nèi)セㄝ啵?/1 000肥皂水溶液震蕩清洗兩遍后流水漂洗干凈，放入75%的酒精溶液浸泡10 s，再以1/1 000 氯化汞（Hg?Cl2）溶液震蕩消毒（表1）。無菌水清洗3 遍后瀝干水分，切出新的接觸面接種于MS 培養(yǎng)基。每個(gè)消毒處理50 段，每瓶接種1 段，重復(fù)3 次，1 800 lx 光照下（25±1）℃培養(yǎng)，光照時(shí)間為每天12 h，15 天后統(tǒng)計(jì)花序軸污染率、死亡率和成活率。

1．2．2 不定芽誘導(dǎo)

將獲得的無菌花序軸段轉(zhuǎn)接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）。每瓶接種1段，每個(gè)配方60瓶，3個(gè)重復(fù)。置于1 800 lx 光照下，光照時(shí)間為每天12 h，（25±1）℃室溫下培養(yǎng)25 ～40 天。統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)和誘導(dǎo)周期，記錄芽長勢，計(jì)算誘導(dǎo)率。

圖1 未開放花序軸Fig.1 Unopened rachis

1．2．3 不定芽的增殖培養(yǎng)

待不定芽長至1．5 ～2 cm 左右，切下轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基（表3）。每瓶4 個(gè)芽，10 個(gè)重復(fù)。和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件一致，培養(yǎng)25 ～35天。統(tǒng)計(jì)增殖的小芽個(gè)數(shù)及小苗長勢，記錄葉片顏色，計(jì)算增殖系數(shù)。

1．2．4 壯苗培養(yǎng)

增殖苗長至1．5 ～2 cm，即可轉(zhuǎn)接入壯苗培養(yǎng)基（表4）。每瓶10 株，5 個(gè)重復(fù)。和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件一致，培養(yǎng)20 天。觀察對比小苗長勢、葉色轉(zhuǎn)綠程度、葉片健壯程度及舒展程度。

1．2．5 生根培養(yǎng)

挑選高度2 ～3 cm 的健壯小苗，切成單芽轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基（表5）。每瓶10 株，5 個(gè)重復(fù)。置于1 800 lx 光照下，光照時(shí)間為每天12 h，（28 ± 1）℃下培養(yǎng)30 天。統(tǒng)計(jì)分析生根周期和生根率，觀察根部生長狀態(tài)（生根數(shù)量、粗細(xì)程度、整齊度）及小苗長勢。生根周期為轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基到開始出現(xiàn)白色根點(diǎn)的時(shí)間。

1．2．6 煉苗移栽

小苗根長至1．5 ～2．0 cm，即可煉苗移栽。洗凈根部瓊脂，用1/1 000多菌靈（50%可濕性粉劑）浸泡15 min，即可進(jìn)行移栽?；|(zhì)為草炭、珍珠巖和沙以3∶1∶0．5（體積比）的比例混合均勻，定植于32 孔穴盤中，澆透生根水（LS7，不添加卡拉膠和蔗糖），罩上塑料薄膜，置于（25 ± 1）℃室溫下，通風(fēng)半遮陰。3 天后每天半揭膜透氣1 h，6 天后全揭膜，保持基質(zhì)濕潤，長出新根后噴施1/1 000 磷酸二氫鉀溶液，小苗長高至10 ～15 cm，即可換盆移栽定植。統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

圖2 花序軸培養(yǎng)出的種子Fig.2 Seed cultured on rachis

圖3 誘導(dǎo)的不定芽Fig.3 Induced adventitious shoots

圖4 增殖叢芽Fig.4 Proliferative cluster shoots

圖5 壯苗培養(yǎng)前Fig.5 Before strong seedling culture

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 和SPSS v17．0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 無菌材料的獲得

在其他處理相同的情況下，隨著流水沖洗和HgCl2消毒處理時(shí)間的增加，污染率下降，死亡率上升（表1）。 除了P1 處理，其他處理的污染率均在50%以下。在同樣的流水沖洗時(shí)間下，增加HgCl2消毒時(shí)間，污染率顯著下降（P＜0．05），死亡率顯著上升（P＜0．05），成活率先增后降，在消毒8 min時(shí)達(dá)到最高，之后顯著下降（P＜0．05），因此HgCl2消毒時(shí)間不宜超過8 min；相比同一HgCl2消毒時(shí)間下增加流水處理時(shí)間，其污染率下降更顯著，但死亡率大幅上升。P5 處理的污染率和死亡率較低，分別為15．33%和16．00%，成活率最高（68．67%）。

圖6 壯苗培養(yǎng)后Fig.6 After strong seedling culture

圖7 生根培養(yǎng)Fig.7 Rooting culture

圖8 組培幼苗移栽20天后Fig.8 20 Days after transplanting of tissue culture seedlings

表1 不同消毒處理對鷺鷥草無菌培養(yǎng)的影響Tab.1 Effects of different sterilization treatments on aseptic culture of D.major

續(xù)表1 Continued

2．2 不定芽的誘導(dǎo)

MS 培養(yǎng)基附加一定量的6-BA 和NAA 處理均可誘導(dǎo)出不定芽（表2）。同時(shí)添加6-BA 和NAA 處理（L2、L3、L5、L6、L8和L9）的誘導(dǎo)率顯著高于僅添加NAA 處理（L1、L4 和L7）（P＜0．05）。L5 和L6 處理的誘導(dǎo)率最高（93．33%），不定芽長勢較好。 同時(shí)添加6-BA 和NAA，當(dāng)NAA 濃度相同時(shí)，隨著6-BA 濃度的增加，誘導(dǎo)周期逐漸縮短；當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到2．5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)出的不定芽長勢較差，葉色黃白或黃綠。當(dāng)6-BA 濃度相同時(shí)，隨著NAA 濃度增加，誘導(dǎo)周期不斷下降；除了2．0濃度外，其他濃度處理的誘導(dǎo)率均隨著NAA 濃度增加呈先上升后下降的趨勢；不添加NAA 時(shí)，不定芽均呈現(xiàn)黃白色，長勢差或較差，隨著NAA 濃度增加，長勢好轉(zhuǎn)，而當(dāng)濃度達(dá)到0．50 mg/L 時(shí)，不定芽長勢又轉(zhuǎn)差。 L2、L3 和L5 處理在轉(zhuǎn)接后結(jié)出了果實(shí)（圖2）。綜合考慮，最適宜的不定芽誘導(dǎo)配方為L5 處理（MS+2．0 mg/L 6-BA+0．25 mg/L NAA），誘導(dǎo)時(shí)間為31．97 天，誘導(dǎo)率為93．33%，不定芽長勢良好，呈嫩綠色（圖3）。

表2 不同培養(yǎng)基處理對鷺鷥草不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different culture medium treatments on adventitious shoot induction of D.major

2．3 不定芽的增殖培養(yǎng)

僅添加6-BA和NAA處理（LZ1 ～LZ9）的增殖系數(shù)為4．21 ～5．63；同時(shí)添加6-BA、NAA 和KT 處理（LZ10 ～LZ17），除LZ16 增殖系數(shù)稍低（5．60），其他處理的增殖系數(shù)均高于5．63，最高可達(dá)7．12（LZ13），表明添加KT對增殖有一定的促進(jìn)效果（表3）。未添加KT時(shí)，在NAA濃度相同的情況下，隨著6-BA濃度的上升，小苗的長勢呈下降趨勢；在6-AB 濃度相同的情況下，隨著NAA 濃度的上升，增殖系數(shù)下降；當(dāng)6-AB 濃度達(dá)到2．50 mg/L、NAA 濃度達(dá)到0．60 mg/L時(shí)，小苗出現(xiàn)一定程度的玻璃化。添加KT 的處理中，處理LZ10 ～LZ13 比處理LZ14 ～LZ17 增殖系數(shù)高，長勢也相對較好，可見過高的激素濃度會抑制鷺鷥草的增殖和生長，NAA 濃度宜在0．20 mg/L 以下，6-BA 濃度不宜高于2．00 mg/L。最適宜的增殖培養(yǎng)配方為處理LZ12（MS 培養(yǎng)基+ 1．50 mg/L 6-BA +0．10 mg/L NAA+0．75 mg/L KT），增殖系數(shù)可達(dá)6．8，小苗較健壯，葉色嫩綠（圖4）。

表3 不同培養(yǎng)基處理對鷺鷥草增殖培養(yǎng)的影響Tab.3 Effects of different culture medium treatments on multiplication culture of D.major

2．4 壯苗培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)的小苗較弱，葉色整體偏黃綠色，葉片舒展度不高，直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中會出現(xiàn)黃葉現(xiàn)象（圖5）。 添加土豆汁和硝酸銨（NH4NO3）均可促進(jìn)小苗葉色轉(zhuǎn)綠及葉片舒展，加快長勢（表4）。添加土豆汁對小苗健壯程度影響較大；添加NH4NO3則對葉色轉(zhuǎn)綠及葉片舒展程度影響較大；兩者共同作用，效果更佳。在MS培養(yǎng)基上同時(shí)添加20 g/L 土豆汁和NH4NO3為最佳壯苗培養(yǎng)配方，小苗長勢良好，健壯，葉色翠綠且舒展度高（圖6）。

表4 不同培養(yǎng)基處理對鷺鷥草苗生長的影響Tab.4 Effects of different culture medium treatments on growth of D.major seedlings

2．5 生根培養(yǎng)

轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，15．30 ～25．09天即可生根（表5）。 僅添加NAA 或IBA 的處理中，添加NAA 處理（LS1 ～LS3）的生根率均高于添加IBA 處理（LS4 ～LS6），LS1 和LS2 處理的生根率顯著高于LS4、LS5和LS6 處理。 對比LS1 ～LS3 和LS4 ～LS6，還可以發(fā)現(xiàn)僅添加IBA 的組別，須根更粗壯，根條數(shù)更多，根長勢更整齊；而添加NAA 的組別小苗長勢更快，根更長。 同時(shí)添加NAA 和IBA 處理（LS7 ～LS9）較單一激素處理的生根效果更好，生根周期短，根粗壯且長度適中，小苗長勢快且粗壯。 LS7 處理（1/2 MS+ 0．50 mg/L IBA + 0．20 mg/L NAA）的效果最好，生根率高達(dá)100%，17．16 天即可生根，平均生根數(shù)為7．94條，根粗壯且整齊，小苗長勢快（圖7）。

表5 不同培養(yǎng)基處理對鷺鷥草生根的影響Tab.5 Effects of different culture medium treatments on rooting of D.major

2．6 煉苗移栽

將組培瓶苗洗凈根部瓊脂后，進(jìn)行簡單消毒即可直接移栽。種下后，約3天可長出新根，20 天左右可進(jìn)行換盆移栽，移栽成活率達(dá)100%。 當(dāng)生根苗根部長度過長時(shí)（2 ～3 cm 以上），會造成盤根現(xiàn)象，長出新根需要4 ～6 天，只需保持基質(zhì)濕潤，避免陽光直射，遮陰達(dá)到50%，嚴(yán)格掌握好揭膜時(shí)間，移栽成活率也可達(dá)到100%（圖8）。

3 結(jié)論與討論

無菌材料的獲得是無性系繁殖成功至關(guān)重要的一步。鷺鷥草花序軸花朵與軸的連接處被花萼包裹，容易造成消毒不徹底，導(dǎo)致污染。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)增加流水沖洗時(shí)間，可在一定程度上降低污染率，可作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組織嬌嫩、不耐受HgCl2材料的有效消毒預(yù)處理方式之一，也更加低碳環(huán)保。

在誘導(dǎo)過程中，L1、L2 和L3 處理均出現(xiàn)結(jié)實(shí)現(xiàn)象。李娜等[13]研究發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期的花序軸再生能力與分化方向存在差異。本研究中的花序軸在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)結(jié)實(shí)和不定芽的不同結(jié)果，是否與激素種類和濃度配比有關(guān)[14]，或是不同生長階段差異造成，目前機(jī)制尚不明確。

Filippova 等[15]在繼代培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的KT（5 mg/L）有利于百合科植物的增殖，Tao 等[16]發(fā)現(xiàn)，添加KT 和NAA 后，岷江百合（Lilium regale）的不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，說明KT 對于百合科植物的增殖培養(yǎng)有良好效果，本研究也得到相同的結(jié)果。在整個(gè)組織培養(yǎng)過程中，當(dāng)NAA 含量超過0．25 mg/L 時(shí)，小苗長勢減弱，葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，與Johnson 等[17]的結(jié)論一致。較低濃度的生長激素更適合鷺鷥草組織培養(yǎng)，加入KT 后增殖效果更好。

在鷺鷥草生根培養(yǎng)階段，單獨(dú)添加NAA 處理比添加IBA 處理生根率高，與蔣瑤等[18]研究結(jié)果一致。同時(shí)使用NAA和IBA，生根效果更好。

本研究中，鷺鷥草的生根率較高，在移栽過程中澆透生根水后，無根的幼苗也陸續(xù)長出了新根，且長勢良好。 瓶外生根可以有效地降低生產(chǎn)成本和生產(chǎn)周期[19]，并在無性繁殖育苗中運(yùn)用廣泛[20-22]，后期可開展鷺鷥草瓶外生根研究，進(jìn)一步優(yōu)化鷺鷥草無性高效快繁體系。