基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討溫中益氣方抗胃潰瘍的作用機(jī)制

馬寶柱，馬晨曦，周國興，遲文成*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

胃潰瘍(Gastric ulcer，GU)是消化系統(tǒng)常見病，以長期反復(fù)發(fā)作的節(jié)律性、周期性的上腹疼痛為主要臨床表現(xiàn)，其發(fā)生是一種或者多種侵襲損害因素對黏膜破壞超過黏膜抵御損傷和自身修復(fù)能力所引起的綜合結(jié)果，是發(fā)生于賁門與幽門之間的炎性壞死性病變[1]。

溫中益氣方是由人參、白術(shù)、大棗、茯苓、黃連、黃芩、半夏、干姜和甘草組成，是臨床治療胃潰瘍的有效經(jīng)驗(yàn)方劑，臨床療效確切，前期實(shí)驗(yàn)研究，也證明該方具有明顯的防治胃潰瘍作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為胃潰瘍屬“胃脘痛”范疇，脾胃虧虛是發(fā)病的根本因素，外感邪氣、飲食不節(jié)、情緒不暢為主要病因，主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以脾胃虧虛為本，痰濕、瘀血、寒熱等為標(biāo)，發(fā)病部位多在脾、胃、肝。臨床治療常用補(bǔ)益藥、理氣藥、清熱藥、止血藥、活血化瘀藥。溫中益氣方具有溫中益氣、清熱燥濕之功效,用于胃炎、胃潰瘍等屬脾胃虛弱證者。

西藥在治療疾病的過程中，具有藥物作用效果明顯、作用途徑單一的特點(diǎn)。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展和藥物研究的深入，發(fā)現(xiàn)阻斷單一通路，生物信號可以通過旁路進(jìn)行傳導(dǎo)，往往只能收效甚微。胃潰瘍的發(fā)病因素和致病機(jī)制繁瑣復(fù)雜，單一的西藥就無法達(dá)到臨床上滿意的治療效果。中藥復(fù)方現(xiàn)對于西藥的單一治療效果來說，具有針對病癥多成分起效、多靶點(diǎn)作用、多通路調(diào)節(jié)的整體作用。中藥復(fù)方在中醫(yī)理論的整體觀和辨證觀的指導(dǎo)思想下，能夠做到因人制宜、因時制宜、因地制宜，將理法方藥與整體觀念和辨證論治相結(jié)合，從而取得良好的治療效果[2]。

1 方法

1.1 溫中益氣方主要化學(xué)成分收集

參考文獻(xiàn)[3]和[4]進(jìn)行收集。溫中益氣方中人參、大棗、甘草、半夏、白術(shù)、干姜、茯苓、黃連、黃芩九味中藥，以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選TCMSP數(shù)據(jù)庫，并將初次篩選的溫中益氣方生物活性成分與PubChem數(shù)據(jù)庫一一查閱對比，最終得到唯一的溫中益氣方有效成份數(shù)據(jù)集。

1.2 胃潰瘍潛在靶點(diǎn)提取

通過Drug Bank數(shù)據(jù)庫，結(jié)合溫中益氣方初步研究成果，逐個驗(yàn)證之前篩選的有效成分分子結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，剔除重復(fù)或非人源以及不規(guī)范的靶點(diǎn)，最終得到溫中益氣方不同活性成分潛在的作用靶點(diǎn)編號(Gene Symbol)。通過對OMIM數(shù)據(jù)庫與GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索篩選胃潰瘍的疾病靶點(diǎn)。以“Gastric ulcer”為檢索關(guān)鍵詞，篩選檢索OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫，獲取基因數(shù)據(jù)綜合匯總后去除重復(fù)基因。利用R3.5.2制作藥物靶點(diǎn)與疾病基因靶點(diǎn)交互的Venn圖，獲得匯總相關(guān)靶點(diǎn)的結(jié)果。

1.3 構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過對溫中益氣方中藥物所有有效成分分析結(jié)果以及所有獲得的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，并用Cytoscape3.7.1構(gòu)建溫中益氣方-靶點(diǎn)-效應(yīng)通路的模型網(wǎng)絡(luò)，通過該模型網(wǎng)絡(luò)闡述溫中益氣方治療胃潰瘍的多成分作用、多靶點(diǎn)、多個相關(guān)信號通路的作用特點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建溫中益氣方與胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

溫中益氣方與胃潰瘍的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protei ninteraction，PPI)采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，研究過程中，利用STRING數(shù)據(jù)庫探索溫中益氣方與胃潰瘍之間已證實(shí)的蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，下載制作蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，從而揭示疾病與藥物之間的蛋白互作關(guān)系。

1.5 生物信息分析

本研究中采用R3.5.2(依托于“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”以及“pathview”程序包)進(jìn)行GO與KEGG基因功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 溫中益氣方主要化學(xué)成分篩選與靶點(diǎn)獲取結(jié)果

基于西北農(nóng)林科技大學(xué)王永華教授開發(fā)的TCMSP數(shù)據(jù)庫，本研究以生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選出人參、大棗、甘草、半夏、白術(shù)、干姜、茯苓、黃連、黃芩九味中藥中OB≥30%并且DL≥0.18的活性成分。將初次篩選的溫中益氣方生物活性成分與PubChem數(shù)據(jù)庫一一查閱對比，最終得到唯一的溫中益氣方有效成份數(shù)據(jù)集，共篩選出233個生物活性成分。

TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取了溫中益氣方對應(yīng)活性成分潛在靶點(diǎn)的全集合，再通過DrugBank數(shù)據(jù)平臺逐一驗(yàn)證之前篩選獲得的有效成分分子結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，剔除非人源或重復(fù)以及不規(guī)范的靶點(diǎn)。最終得到溫中益氣方活性成分的潛在作用靶點(diǎn)編號(Gene Symbol)。再檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫，以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞，最后將搜索所得的基因數(shù)據(jù)綜合匯總后去除重復(fù)靶點(diǎn)，利用R3.5.2繪制疾病基因靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)之間的Venn圖，并得到相關(guān)靶點(diǎn)的匯總結(jié)果，結(jié)果見圖1。

2.2 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)獲得的藥物有效成分與疾病相關(guān)基因靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)匯總結(jié)果以及靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果，采用Cytoscape3.7.1構(gòu)建溫中益氣方-靶點(diǎn)-效應(yīng)通路的模型網(wǎng)絡(luò)，用不同的節(jié)點(diǎn)分別表示溫中益氣方、篩選得到的溫中益氣方有效成分、溫中益氣方潛在抗胃潰瘍基因靶點(diǎn)以及胃潰瘍的病理改變。通過藥物-活性成分-基因靶點(diǎn)-胃潰瘍的相應(yīng)連線表示溫中益氣方中的多種有效成分通過多個靶點(diǎn)對胃潰瘍的進(jìn)展造成不同的影響。并利用該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)闡明溫中益氣方治療胃潰瘍多成分起效、多靶點(diǎn)作用、多通路調(diào)節(jié)作用機(jī)制和特點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

圖2 溫中益氣方-靶點(diǎn)-效應(yīng)通路的網(wǎng)絡(luò)模型

2.3 溫中益氣方與胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究中溫中益氣方與胃潰瘍的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖采用STRING數(shù)據(jù)庫平臺構(gòu)建。利用STRING數(shù)據(jù)庫探索溫中益氣方與胃潰瘍之間已驗(yàn)證的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并下載繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，揭示疾病與藥物之間的蛋白互作關(guān)系以及與其他蛋白互作關(guān)系，結(jié)果見圖3。

圖3 溫中益氣方與胃潰瘍的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO與KEGG富集分析

根據(jù)GO功能富集分析顯示，溫中益氣方抗胃潰瘍的作用機(jī)制主要集中于多種細(xì)胞核因子調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷，泛素/泛素樣蛋白連接酶系統(tǒng)，RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列等多個細(xì)胞內(nèi)生命活動密切相關(guān)。KEGG功能富集分析主要集中NF-κB等信號通路，與炎癥、細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)、自噬、細(xì)胞凋亡、纖維化信號通路、抗氧化應(yīng)激，白細(xì)胞募集等密切相關(guān)，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 溫中益氣方抗胃潰瘍GO富集分析

圖5 溫中益氣方抗胃潰瘍KEGG通路富集分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)認(rèn)為藥物和疾病的作用是一個復(fù)雜體系，涉及多成分起效、多靶點(diǎn)作用、多通路調(diào)節(jié)的分子功能網(wǎng)絡(luò)相互作用的過程，不同疾病更具有不同的復(fù)雜體系又相互聯(lián)系。因此，應(yīng)該針對不同疾病采用多成分藥物協(xié)同作用才能達(dá)到更佳的治療效果，這與中醫(yī)藥理論中的整體觀和辨證觀不謀而合，把網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)理論各自的優(yōu)勢充分結(jié)合，發(fā)揮各自最大的優(yōu)勢[5-6]。

所以，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和中醫(yī)藥的研究相互滲透，兩者共同為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究服務(wù)，共同推動中藥現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展[7-8]?，F(xiàn)代中藥具有“多向藥理學(xué)”的特性，能夠作用于多個靶點(diǎn)和多個信號通路，達(dá)到更好的療效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析技術(shù)為一體，在系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)的指導(dǎo)下，推動中藥現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)展[9-12]。本研究從溫中益氣方類藥性、口服利用度較好的有效成分，并預(yù)測了這些成分治療胃潰瘍的靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為溫中益氣方的深入研究提供參考。