不同肝癌細胞懸液兔移植瘤模型建立的比較

格桑卓瑪 金海 董燕 邊巴卓瑪 胡志文★,

1 林芝市人民醫(yī)院功能科 西藏林芝 860000

2 華南理工大學附屬第二醫(yī)院 廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科 廣東廣州 510180

VX2 是目前應用較廣泛的惡性腫瘤瘤株，通過將該瘤株接種到兔的肺、肝、腎、軟組織、骨骼肌和腦中來建立動物模型，用于研究多種腫瘤生物學行為，如腫瘤血管生成、發(fā)病機制和治療評估[1-4]。目前，肝癌兔原位移植瘤模型是人體外較為接近人類肝癌的整體實驗模型,因此成為肝癌實驗研究理想的動物模型,尤其利用肝癌細胞直接注射肝細胞接種建立肝癌原位移植瘤模型。但是，有關肝癌細胞接種前采用何種液體制懸未見明確報道。為此，在這項研究中我們選用VX2 兔肝腫瘤細胞，以不同的液體對肝癌細胞稀釋制懸后經超聲引導接種于兔肝癌原位瘤模型建立兔肝VX2 的移植瘤模型，探討模型制備的最佳肝癌細胞制懸方法，為肝癌研究提供有效的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

44只重量為2.6kg～3kg的新西蘭大白兔，雌雄各半，由暨南大學動物實驗中心提供。瘤株類型為VX2 鱗狀細胞癌。

1.2 方法

1.2.1 VX2 肌肉荷瘤種兔的制作

在制作前事先將水浴鍋恒溫在37 度，超凈臺紫外線照射滅菌，從液氮中取出凍存的VX2 腫瘤細胞液，在37 度水浴鍋中快速溶解，溶解后立刻轉移到放有DMEME 培養(yǎng)基的離心管內，進行離心，離心轉速為1000rpm/min，室溫下離心3 分鐘，棄掉上清液，收集沉淀細胞，用DMEM 培養(yǎng)基重懸后轉移到細胞培養(yǎng)瓶內，鋪散均勻轉到細胞培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。

由于接種到兔肌肉內的細胞要達到一定的數(shù)量，因此對細胞進行傳代繁殖：首先待細胞密度達到90%左右時，棄掉細胞培養(yǎng)液，用PBS 液潤洗細胞1～2 遍，棄掉PBS 液，加入0.05%胰酶，放于37℃細胞培養(yǎng)箱中進行胰酶消化，細胞形態(tài)發(fā)生改變時，吸棄胰酶，加入DMEM 完全培養(yǎng)基進行吹打混勻，細胞全部消化下來后轉移到離心管中，1000rpm/min，3min，室溫狀態(tài)下離心，收集細胞沉淀，加入培養(yǎng)基制成VX2 細胞懸液，再將細胞懸液轉移到2～3 個細胞培養(yǎng)瓶內擴大培養(yǎng)，繼續(xù)待細胞增殖到一定數(shù)量后進行荷瘤種兔的制作。取4 只重量在2.6kg-3.0kg（雌雄不限）的新西蘭大白兔，肌注麻醉后，用剃剪將后腿大腿外側皮膚剃毛，消毒，常規(guī)消化細胞收集細胞懸液，將細胞懸液在Matrigel 的混合下注射到大白兔后腿肌肉內成瘤。

1.2.2 VX2 肝移植瘤模型的建立

成瘤2～3 周后，待腫瘤直徑達到2cm 左右時，進行腫瘤移植。將大白兔肌注麻醉并固定在兔臺上，常規(guī)消毒，用眼科剪小心剝離肌肉內腫瘤。將剝離的腫瘤組織塊放入培養(yǎng)皿內，再用眼科剪和鑷去除腫瘤組織周圍的肌肉組織、脂肪組織和血管，用生理鹽水清洗組織1～2次，然后用眼科剪將腫瘤組織剪碎至0.5 mm3 的組織碎塊，并將組織碎塊轉移到分別加有PBS 和Matrigel 混合溶液、無血清DMEM 和Matrigel 混合溶液、PBS 緩沖液和無血清DMEM 溶液的培養(yǎng)皿內制成腫瘤組織懸液。將40 只健康的重量相當?shù)男挛魈m大白兔（雌雄不限）隨機分為4 組，每組10 只。肌注麻醉后將大白兔固定在臺上，常規(guī)消毒，鋪設洞巾，準備好PTC 穿刺針和邁瑞M7 便攜彩色多普勒超聲儀、生理鹽水、明膠海綿顆粒、青霉素和手術器械。介入模型（如圖1），在邁瑞超聲引導下用18g 的PTC 穿刺針經皮穿刺入肝臟內，然后抽出穿刺針的針芯，用鑷子夾取組織碎塊放入到穿刺針的針尾，用針芯緩慢將腫瘤組織碎塊推注至肝內，然后撤出穿刺針，后用青霉素40萬u/d肌肉注射，連續(xù)3天，防止感染，后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料應用x±s 表示。計數(shù)資料應用率表示計量資料的比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1：介入建模超聲圖像 A：超聲引導下18g 的PTC 穿刺針經皮穿刺入肝臟內；B：PTC 穿刺針針尖處的高回聲團為推注入肝臟內的腫瘤組織碎塊及伴隨的少量氣體。

2 結果

2.1 兔肌肉荷瘤模型

VX2 肌肉荷瘤種兔的制作4 只實驗兔均造模成功。在成瘤3 周后，肝腫瘤的大小直徑達到2cm 左右。

2.2 兔肝癌原位瘤模型成瘤率的比較 見表

表1 4 組兔肝原位瘤大小和成瘤率

3 結論

采用DMEM 和Matrigel 混合制作兔VX2 肝癌細胞稀釋制懸后經超聲引導是一種簡單、成功率高的建立兔肝癌原位瘤模方法。

4 討論

VX2 是目前應用較廣泛的惡性腫瘤瘤株，通過將該瘤株接種到兔的肺、肝、腎、軟組織、骨骼肌和腦中來建立動物模型，用于研究多種腫瘤生物學行為，如腫瘤血管生成、發(fā)病機制和治療評估。在這項研究中，通過超聲引導下的PTC 穿刺針經皮穿刺入肝臟內嵌入瘤組織塊建立兔肝VX2 的移植瘤模型。兔腫瘤模型具有制作簡便易行，價格相對低廉，實驗周期短、成功率高、重復性好、模型性質穩(wěn)定等特點[5-10]。兔肝臟的左葉體積明顯大于右葉，左肝動脈較粗大，大多數(shù)從腹腔動脈直接發(fā)出，而右肝動脈較細。同時為了方便操作，避免栓塞材料等進入膽囊動脈引起不必要的并發(fā)癥[11]。

常規(guī)肋下B 超或CT 掃查待接種兔肝臟,明確兔肝位置并確定待接種部位，選定穿刺點、角度、深度、常規(guī)消毒鋪巾，尖刀挑開穿刺點皮膚（術后瘢痕點可作為B 超或CT 監(jiān)測移植瘤的部位），用尖頭穿刺針沿設定的穿刺角度、方向穿入預定肝位置，助手固定好穿刺針，術者拔出針芯，眼科鑷夾1 塊瘤塊放入針鞘內，穿刺針芯將瘤塊推入肝內，重復1～2 次，在直視下來回在針鞘內推動穿刺針芯，證實瘤塊接種于肝臟[12,13]。如未成功，可再重復上述操作，術后連續(xù)3天青霉素40 萬 U+慶大霉素4 萬U 肌注。采用直接穿刺法復制出的VX2 兔肝癌模型具有方法簡單，成功率高，模型性質穩(wěn)定的特點。同常規(guī)開腹接種法相比具有以下優(yōu)點：不需開腹，無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、術中兔麻醉過淺不易操作，麻醉過深易致意外死亡；術后手術瘢痕影響超聲監(jiān)測等缺點，同懸液注射法相比：形成的腫瘤為孤立結節(jié)型而非彌漫性腫瘤，便于進行肝癌的影像學研究，無腹腔種植，并且可根據(jù)研究需要調整模型，腫瘤在肝的位置。不過，由于兔肝小移動性較大且分葉多，故在選兔時一般選擇體型較大的兔，為提高穿刺接種成功率，要求尖頭穿刺針銳利，穿刺針芯直徑與外套針內徑吻合；穿刺時需一定的技巧：先用尖刀挑開擬穿刺處皮膚，再進針，要求快防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中。

Matrigel 是一種從EHS 小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜成分。1990 年，Kleiman 等首次報道Matrigel可以有力地促進細胞的增殖與分化；隨后，陸續(xù)有人利用Matrigel 將人癌細胞或組織（小細胞肺癌、人乳腺癌、腎癌、鱗癌以及前列腺癌）移植于裸鼠獲得成功[14-17]。本文通過PBS 和Matrigel 混合溶液、無血清DMEM 和Matrigel 混合溶液、PBS 緩沖液和無血清DMEM 溶液組共4 組的兔肝癌VX2 原位瘤模型，發(fā)現(xiàn)采用DMEM 和Matrigel 混合制作兔VX2 肝癌細胞稀釋制懸后經超聲引導是一種簡單、成功率高的建立兔肝癌原位瘤模方法。這為我們以后建立肝原位瘤模型作相關活體研究提供了有力的條件。