一種基于硅氧鍵斷裂氟離子熒光探針的合成與研究

王金，徐亞杰，喬助，任君

(湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

氟化物在廣泛的生物、醫(yī)學(xué)和化學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，如牙科保健、骨質(zhì)疏松治療、供水治療，甚至化學(xué)武器.此外，氟化物很容易被人體吸收，但卻是緩慢吸收的.但是，過量的氟化物可能會(huì)引起蛋白質(zhì)損害，骨骼和甲狀腺活動(dòng)紊亂方面的疾病[1-2].考慮到這些有害的因素，探尋一種簡單高效的方法來識(shí)別和檢測F-在實(shí)際應(yīng)用中是必不可少的.因此，開發(fā)用于環(huán)境和生物系統(tǒng)中F-的特異性傳感和識(shí)別的有機(jī)小分子成為了一個(gè)非常熱門的課題.其中，熒光探針具有成本低、靈敏度高、檢測限低、合成簡單等優(yōu)點(diǎn)，還可用于活體細(xì)胞和體內(nèi)的檢測，在生物、化學(xué)和環(huán)境過程中的應(yīng)用引起了人們的極大興趣[3-6].之前已經(jīng)有很多人報(bào)道過多種氟離子的熒光探針，但是大多數(shù)都是基于去質(zhì)子化的識(shí)別原理[7-11]，很難在含水相的體系中完成對(duì)氟離子的有效識(shí)別.而實(shí)際應(yīng)用中，氟離子都是存在于含水體系中，因此，這一類氟離子熒光探針并沒有非常好的應(yīng)用價(jià)值.而反應(yīng)型的氟離子熒光探針[12-13]由于在含水的體系中仍然能夠很好地檢測氟離子，因此是我們的重點(diǎn)研究對(duì)象.基于此我們成功合成出了一種基于硅氧鍵的反應(yīng)型氟離子熒光探針A，通過2-苯甲酰基吡啶和4-二乙胺基水楊醛合成出熒光探針分子A的熒光母體，我們以叔丁基二甲基氯硅烷作為我們熒光探針分子A的識(shí)別位點(diǎn)，通過各種表征和測試研究，驗(yàn)證了其對(duì)于氟離子有著高效，高靈敏度的識(shí)別效果，并且具有裸眼識(shí)別的能力.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器試劑：2-苯甲?；拎?；4-二乙氨基水楊醛；醋酸銨；濃硫酸；冰乙酸；叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)；N-N二甲基甲酰胺；咪唑等試劑均為市售分析純，均無純化.

儀器：核磁測試中使用WIPM核磁共振波譜儀(中科院400 MHz)和Varian UNITY INOVA核磁共振波譜儀(美國600 MHz)，核磁測試中TMS作為我們的指定內(nèi)標(biāo)物，測試核磁時(shí)全部采用氘代試劑.熒光測試時(shí)使用LS-55熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測試(美國Perkin-Elmer公司)；質(zhì)譜測試時(shí)使用質(zhì)譜用1260-6224 LC-MS TOF(安捷倫液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測試儀)進(jìn)行檢測.

1.2 合成過程如Scheme1所示，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將4-二乙氨基水楊醛(0.96 g，5 mmol)溶解在10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室溫下持續(xù)攪拌直到4-二乙氨基水楊醛完全溶解，等到溶液澄清之后立即加入咪唑(0.544 g，8 mmol)，室溫下繼續(xù)攪拌半個(gè)小時(shí)，最后加入TBDMSCl(1.2 g，8 mmol)，油浴升溫至60 ℃反應(yīng)4 h.TCL監(jiān)測待反應(yīng)完成之后加入乙酸乙酯20 mL，然后用飽和氯化鈉溶液連續(xù)洗滌有機(jī)相3次(30 mL×3)，用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相過夜，經(jīng)過抽濾，減壓旋蒸，最后將樣品通過洗脫液石油醚/乙酸乙酯(V∶V=10∶1)經(jīng)柱層析提純得到最后產(chǎn)物棕色油狀液體1.54 g，計(jì)算產(chǎn)率為78%.1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ=10.02(s,1H),7.61(d,J=8.00 Hz,1H),6.24(d,J=12.00 Hz,1H),5.88(s,1H),3.26～3.31(q,J=6.00 Hz,4H),0.93(s,9H),0.83(s,6H),0.19(s,6H);13C NMR(100 MHz,DMSO):δ=187.35,161.14,153.65,129.97,116.18,105.56,104.44,100.37,44.72,25.74,18.29,18.03,12.53,4.27.

Scheme 1 合成熒光探針分子A的路線過程圖

探針分子A的合成：將2-苯甲?；拎?0.8 g，4.37 mmol)，化合物1(1.98 g，6.5 mmol)，醋酸銨(1.7 g，21.9 mmol)溶解于30 mL冰乙酸中，回流反應(yīng)7 h.反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，抽濾，得到大量固體產(chǎn)物，用石油醚/乙酸乙酯(V∶V=4∶1)作為洗脫劑經(jīng)柱層析提純得到墨綠色晶體，產(chǎn)率為42%.1H NMR (600 MHz,CDCl3):δ=8.14(d,J=12.00 Hz,2H),7.97(d,J=6.00 Hz,1H),7.88(d,J=12.00 Hz,1H),7.61～7.66(m,3H),7.43(t,J=6.00 Hz,1H),6.90(t,J=6.00 Hz,1H),6.65(d,J=6.00 Hz,2H),6.41(s,1H),3.53～3.57(m,J=6.00 Hz,4H),1.38(t,J=6.00 Hz,6H),0.92(s,9H);13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ=169.27,154.92,154.12,137.47,135.42,131.28,130.04,129.13,129.02,128.42,127.65,123.71,123.25,122.95,115.12,113.68,112.91,43.00,28.07,25.72,18.31,4.26;HR-MS(ESI):Calcd for C29H37N3OSim/z[M+H]+472.2706，F(xiàn)ound 472.120 8.

2 結(jié)果與討論

2.2 熒光探針A的選擇性分析對(duì)于熒光探針分子A的選擇性，我們?nèi)?2份1.5 mL的探針分子A的四氫呋喃溶液(2×10-5mol/L)，把其中一份設(shè)置成空白樣品，在剩下的11份探針分子A的四氫呋喃溶液中，同樣分別加入1.5 mL的2×10-4mol/L的11種常見的陰離子PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-).關(guān)于探針分子A的裸眼識(shí)別部分，首先在肉眼下觀察，如圖1所示，可以看到當(dāng)只有加入F-之后樣品瓶中的溶液顏色才變?yōu)辄S綠色，剩下的樣品瓶中的顏色則為墨綠色.通過將樣品瓶放置于365 nm紫外燈下照射，可以得到圖2所示結(jié)果，加入F-之前的樣品瓶中的熒光為青色，而當(dāng)加入F-之后熒光發(fā)生變化，變?yōu)辄S綠色.進(jìn)一步探究探針分子A的選擇性分析，我們?nèi)?2份1.5 mL 2×10-5mol/L的探針分子A的四氫呋喃溶液，同樣把其中一份設(shè)置為空白樣品，在剩下的11份探針分子A的四氫呋喃溶液中，分別加入1.5 mL 2×10-4mol/L的11種常見陰離子的PBS buffer溶液(F-、SO42-、Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、H2PO4-、NO3-、AcO-、CN-)，通過熒光分光光度計(jì)分別進(jìn)行掃描測試最后得到選擇性分析圖，如圖3所示，可以知道探針分子A對(duì)氟離子具有很高的選擇性識(shí)別能力.

圖1 探針分子A在不同離子下的比色變化圖

圖2 探針分子A在不同離子下的熒光變化圖

圖3 在THF/PBS buff(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對(duì)F-的選擇分析圖

2.3 熒光探針A的抗干擾能力分析為了探究探針分子A對(duì)氟離子的識(shí)別能力是否容易受到體外環(huán)境中離子的干擾，我們接下來進(jìn)行了探針分子A的抗干擾實(shí)驗(yàn)，干擾離子均是常見的Cl-、Br-、I-、HSO4-、ClO4-、NO3-、AcO-、SO42-、H2PO4-、CN-等，通過配置不同濃度的常見離子PBS buffer溶液和探針分子A的四氫呋喃溶液，保證在我們的測試體系當(dāng)中(THF/PBS=1∶1)探針分子A的當(dāng)量∶氟離子的當(dāng)量∶干擾離子的當(dāng)量為1∶10∶100.首先我們分別量取1 mL探針分子A的四氫呋喃溶液11份，將其中一份設(shè)置為空白樣品，加入PBS buffer溶液1 mL，分別向剩下的10份樣品中加入等體積100當(dāng)量的不同干擾離子溶液，用熒光分光光度計(jì)然后進(jìn)行熒光強(qiáng)度掃描測試.同上，我們同樣取11份等體積的探針分子A的四氫呋喃溶液，設(shè)置一份空白樣，向其中加入0.5 mL PBS溶液，再向其中剩下的10份樣品瓶中分別加入等體積不同的干擾離子溶液，最后向每一份中樣品瓶中加入0.5 mL 的氟離子PBS buffer溶液，再次通過熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描.如圖4所示，結(jié)果表明探針分子A對(duì)氟離子的識(shí)別效果在存在100當(dāng)量濃度的干擾離子之下依舊表現(xiàn)出十分優(yōu)良的檢測抗干擾性能.

圖4 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對(duì)F-識(shí)別的熒光強(qiáng)度干擾試驗(yàn)圖

2.4 熒光探針A的滴定分析在THF/PBS=1∶1體系中，我們配置了6份1.5 mL的熒光探針分子A的四氫呋喃溶液，測試時(shí)我們分別向其中加入不同當(dāng)量濃度的氟離子的四氫呋喃溶液(0～1 eq，其中1 eq代表2.0×10-5mol/L，下同)，然后通過對(duì)不同的氟離子當(dāng)量濃度下的熒光探針分子A進(jìn)行熒光圖譜掃描測試，最后可以得到如圖5所示的熒光探針分子A熒光強(qiáng)度隨著波長變化的熒光發(fā)射圖譜，可以看到隨著氟離子當(dāng)量的逐漸加入，整個(gè)體系的最大發(fā)射波長發(fā)生了紅移現(xiàn)象，并且很明顯的看到探針分子A的熒光強(qiáng)度在不斷的降低，當(dāng)加入的氟離子含量達(dá)到1 eq時(shí)，我們整個(gè)體系的熒光強(qiáng)度已經(jīng)達(dá)到最低數(shù)值，繼續(xù)增加離子的當(dāng)量濃度，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度基本不發(fā)生改變，結(jié)果表明氟離子與熒光探針分子A是按照1∶1的比例進(jìn)行反應(yīng).為了計(jì)算得到熒光探針分子A對(duì)于氟離子的檢測限(DL)，我們通過origin對(duì)不同氟離子當(dāng)量濃度下的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度進(jìn)行一維線性擬合，如圖6所示，整個(gè)體系擬合的線性回歸方程是y=-233.152 5x+288.1，之中y表示最高熒光發(fā)射峰所代表的熒光強(qiáng)度數(shù)值，x則是為F-的當(dāng)量濃度數(shù)值，整個(gè)一維線性擬合得到的相關(guān)系數(shù)R2為0.994 67，按照IUPAC檢測限(DL)計(jì)算公式，DL=3σ/K[14-15]算得檢測限為4.26×10-8mol/L，這說明探針分子A對(duì)F-具有較低的檢測限.

圖5 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對(duì)F-的滴定分析圖譜

圖6 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A的熒光強(qiáng)度與F-濃度的線性關(guān)系圖

2.5 熒光探針A的響應(yīng)時(shí)間傳感器的響應(yīng)時(shí)間作為能否有更大應(yīng)用價(jià)值的參考因素之一.在加入氟離子之后用LS-55熒光分光度計(jì)對(duì)探針分子A的溶液進(jìn)行循環(huán)掃描測試，最后得到如圖7所示結(jié)果.可以看到探針分子C對(duì)氟離子的響應(yīng)非?？?，響應(yīng)時(shí)間僅需40 s.

圖7 在THF/PBS buffer(V∶V=1∶1)體系下探針分子A對(duì)F-的響應(yīng)時(shí)間

3 識(shí)別機(jī)理分析

通過比較氟離子加入前后的質(zhì)譜峰，可以進(jìn)一步說明熒光探針分子A識(shí)別氟離子的機(jī)理，四丁基氟化銨被我們加入到探針分子A的溶液中，并且進(jìn)行高分辨率質(zhì)譜測試,如圖8結(jié)果顯示探針分子A與四丁基氟化銨混合后在356附近出現(xiàn)了一超強(qiáng)峰.我們推測該峰是[C23H22N3O]的碎片峰(探針分子A的相對(duì)分子質(zhì)量減去含硅部分的相對(duì)分子質(zhì)量剛好是356).該結(jié)果驗(yàn)證了探針分子A氟離子的識(shí)別作用是基于氟離子切斷硅氧鍵這一機(jī)理,與已有文獻(xiàn)[16]報(bào)道相吻合.

圖8 探針分子A(a)及其與四丁基氟化銨混合后(b)的質(zhì)譜圖

圖9 探針分子A對(duì)F-識(shí)別機(jī)理圖

4 結(jié)論

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們以苯甲?；拎ず?-二乙氨基水楊醛成功合成出熒光探針分子A的母體，在母體的基礎(chǔ)上叔丁基二甲基氯硅烷被我們采用作為識(shí)別氟離子的位點(diǎn)，最后通過合理的設(shè)計(jì)合成出了一種基于硅氧鍵斷裂為識(shí)別機(jī)理的熒光探針分子A，通過進(jìn)一步的測試我們發(fā)現(xiàn)熒光探針分子A對(duì)氟離子識(shí)別表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn).此外熒光探針分子A還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氟離子的裸眼識(shí)別，通過比較探針溶液加入氟離子的前后，我們發(fā)現(xiàn)在裸眼狀態(tài)下探針溶液的顏色，由氟離子加入之前的墨綠色變成氟離子加入之后的黃綠色；此外我們通過觀察在365 nm紫外燈下探針溶液加入氟離子的前后的裸眼熒光變化，發(fā)現(xiàn)在裸眼狀態(tài)下探針溶液的熒光由氟離子加入之前的青色變?yōu)榉x子加入之后的黃綠色.經(jīng)過進(jìn)一步熒光分光光度計(jì)檢測熒光探針分子A的性能，結(jié)果表明熒光探針分子A可以很好地識(shí)別選擇氟離子和表現(xiàn)出很好的抗干擾能力，檢測限達(dá)到了DL=4.26×10-8mol/L，并且對(duì)氟離子的識(shí)別十分迅速，響應(yīng)時(shí)間只有40 s.