不同柑橘砧木對(duì)錳過(guò)量脅迫的耐受性及生理響應(yīng)

邱潔雅，袁 夢(mèng)，朱攀攀，凌麗俐，曹 立，付行政，彭良志

（西南大學(xué)柑桔研究所/國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

錳是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，它參與植物體內(nèi)多種生理生化過(guò)程，例如，在光合作用中，它不僅是維持葉綠體結(jié)構(gòu)的必要成分，還直接參與光合放氧過(guò)程[1]。此外，錳還作為酶的活化劑參與植物體一系列酶促反應(yīng)，如磷酸化作用、脫羧基作用、還原反應(yīng)和水解反應(yīng)等[2]。但過(guò)量的錳則會(huì)引起植物中毒，柑橘屬于對(duì)錳毒害較為敏感的植物，當(dāng)柑橘受到過(guò)量錳脅迫時(shí)，不僅嚴(yán)重影響產(chǎn)量，而且果實(shí)品質(zhì)也明顯變差[3]。因此，探究常用柑橘砧木對(duì)過(guò)量錳脅迫的生理響應(yīng)并篩選出對(duì)過(guò)量錳脅迫耐受性較強(qiáng)的砧木品種，對(duì)柑橘生產(chǎn)有重要意義。植物錳元素主要來(lái)源于土壤中三類有效態(tài)錳，即水溶性錳、交換態(tài)錳和易還原態(tài)錳，前兩者均以Mn2+的形式存在，后者則是高價(jià)錳氧化物中易被還原成植物有效Mn2+的部分[4]。影響土壤錳有效性的因素很多，其中，土壤pH是最重要的影響因素，土壤中錳的有效性隨pH降低而升高[5]。因此，酸性土壤上易出現(xiàn)植物錳中毒現(xiàn)象，堿性土壤則易誘發(fā)植物缺錳。我國(guó)柑橘主要分布在南方紅壤、黃壤區(qū)，柑橘園土壤呈酸性或強(qiáng)酸性的比例高，且有部分土壤嚴(yán)重酸化。例如，貴州東南柑橘園絕大部分呈微酸性或酸性[6]，福建84%柑橘園土壤pH ＜ 5.5[7]，廣西66.07%柑橘園土壤pH ＜ 5.5[8]，浙江84.6%柑橘園土壤pH ≤ 6.5[9]。由于我國(guó)柑橘園酸性土壤比例高，導(dǎo)致土壤和柑橘樹體錳過(guò)量普遍。前人研究顯示，湖南和湖北有41.7%[10]、江西贛南有51.6%[11]、浙江有59.0%[9]的柑橘園土壤有效錳含量為高量或過(guò)量水平，湖南和湖北柑橘樹體錳含量偏高的占41.3%[10]，贛南臍橙葉片錳高量和過(guò)量的占28.1%[12]，廣西柑橘葉片錳含量超標(biāo)的占22.2%[13]，南豐柑橘葉片錳過(guò)量高達(dá)78.7%[14]。由此可見，我國(guó)柑橘園土壤和樹體錳過(guò)量問(wèn)題相當(dāng)普遍，在較大程度上影響了柑橘產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。

柑橘樹體為地下部分的砧木品種和地上部分的接穗品種嫁接而成。砧木作為樹體的地下部分，負(fù)責(zé)將土壤中的礦質(zhì)元素吸收并運(yùn)送至地上部，因此砧木吸收利用養(yǎng)分的能力直接影響樹體的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況[15]。研究不同柑橘砧木品種對(duì)錳過(guò)量脅迫的耐受性有助于緩解或克服錳過(guò)量對(duì)柑橘的不利影響。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘砧木對(duì)錳過(guò)量脅迫耐受性的比較研究還未見報(bào)道。我國(guó)柑橘產(chǎn)區(qū)因嫁接品種、氣候和土壤等差異，各產(chǎn)區(qū)的砧木選用也有所不同。習(xí)慣上，我國(guó)大部分產(chǎn)區(qū)的柑類、橘類和甜橙類主要采用枳、紅橘或酸橘做砧木，柚類主要采用酸柚 (近年來(lái)多用沙田柚替代) 和枳做砧木。堿性土為主的四川盆地則主要采用紅橘做砧木，浙江、福建的海涂鹽堿柑橘園一般采用枸頭橙做砧木。資陽(yáng)香橙是近年來(lái)興起的雜交新砧木品種，具有生長(zhǎng)快、投產(chǎn)早、嫁接親和性好、抗裂皮病和碎葉病，在酸性和堿性土壤上均可生長(zhǎng)良好等優(yōu)點(diǎn)，已在生產(chǎn)上得到快速推廣應(yīng)用[16-20]。本試驗(yàn)選用生產(chǎn)上常用的4種柑橘砧木枳、資陽(yáng)香橙、紅橘和沙田柚為材料，比較其對(duì)錳過(guò)量脅迫的耐受性和生理響應(yīng)，以期為柑橘生產(chǎn)上砧木的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

供試的4種柑橘砧木為枳[Poncirus trifoliate(L.)Raf]、資陽(yáng)香橙 (Citrus junos‘Ziyang Xiangcheng’，ZyXc)、紅橘 (Citrus reticulataHort.ex Tanaka，Tanaka)和沙田柚 [Citrus grandis(L.) Osb. ‘Shatianyou’，StY]。選取籽粒飽滿的種子進(jìn)行催芽，在根長(zhǎng)約3 cm時(shí)移栽至基質(zhì)為珍珠巖∶石英砂為1∶1混合的育苗盆中，在25℃、光照12 h/黑暗12 h的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，每天噴施適量蒸餾水。待苗長(zhǎng)出2～3片真葉后，改為每4天澆一次1/2改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液[改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方如下：Ca(NO3)2·4H2O 8 mmol/L、KNO33 mmol/L、NH4H2PO41 mmol/L、MgSO4·7H2O 2 mmol/L、NaFeEDTA 0.05 mmol/L、H3BO30.015 mmol/L、MnSO4·H2O 0.01 mmol/L、ZnSO4·7H2O 0.005 mmol/L、CuSO4·5H2O 0.0015 mmol/L、Na2MoO40.0005 mmol/L]。150天后，選擇生長(zhǎng)狀況相對(duì)一致的4種砧木實(shí)生苗移植到基質(zhì)為珍珠巖∶石英砂為1∶1 混合的長(zhǎng)方體塑料箱中 (59 cm × 45.5 cm × 32 cm)，每個(gè)塑料箱同時(shí)定植4種砧木，每種砧木定植10株，每4天澆一次改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)60天后進(jìn)行不同濃度錳處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)含4種砧木各10株。處理時(shí)，將營(yíng)養(yǎng)液中的MnSO4·7H2O配制為5個(gè)濃度梯度：0.01 (對(duì)照，正常濃度)、0.05、0.25、1.25、6.25 mmol/L，分別記為：Mn0.01 (CK)、Mn0.05、Mn0.25、Mn1.25、Mn6.25，每4天澆一次上述改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。錳處理67天后，最高脅迫濃度處理下植株的死亡率超過(guò)50%，結(jié)束培養(yǎng)。

1.2 毒害情況調(diào)查與生物量的測(cè)定

試驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)常觀察記錄植株錳毒害發(fā)生發(fā)展情況，在結(jié)束處理后取出砧木苗，分為地上部分和地下部分，先后用自來(lái)水、無(wú)離子水、蒸餾水清洗干凈，涼干表面水分，分別稱鮮重，然后置于烘箱中105℃ 殺青30 min，75℃烘至恒重，冷卻后稱干重。

1.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

處理60天時(shí)，用Li-6400型便攜式光合測(cè)定儀(美國(guó)Li-COR) 測(cè)定成熟葉片光合指標(biāo)，同時(shí)取葉樣，測(cè)定葉片的葉綠素含量、電導(dǎo)率、丙二醛含量及超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶3種酶的活性。葉綠素含量采用文獻(xiàn)[21]的方法測(cè)定；電導(dǎo)率測(cè)定參照劉星輝等[22]的方法略有改動(dòng)，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛 (MDA) 含量，氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD) 活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶 (POD) 活性，過(guò)氧化氫分解法測(cè)定過(guò)氧化氫酶 (CAT) 活性。

1.4 葉片和根系的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量測(cè)定

試驗(yàn)處理結(jié)束后，分別采集葉片和根系進(jìn)行礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量測(cè)定。元素含量按照L/YT1270-1999方法進(jìn)行測(cè)定。磷含量測(cè)定采用鉬銻抗比色法，使用TU-9101紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司) 測(cè)定。K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu測(cè)定采用原子吸收法，使用AA-800原子吸收分光光度計(jì) (Perkin Elmer公司) 測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算公式

采用 Microsoft Excel 2013 和 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、顯著性分析和作圖。

參照石永紅等[23]和周廣生等[24]的評(píng)價(jià)方法，采用隸屬函數(shù)對(duì)4種柑橘砧木的耐錳性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)在脅迫60天后測(cè)定的相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、光合作用指標(biāo)等生理生化指標(biāo)和公式 (1) 求得各指標(biāo)的耐錳系數(shù)，應(yīng)用SPSS 18.0對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的耐錳系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析，將各項(xiàng)原始指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。

利用公式( 2 ) 計(jì)算4 種柑橘砧木在錳毒害脅迫條件下，通過(guò)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)所得的耐錳性綜合評(píng)價(jià)值D 值。D 值越大則表明該柑橘砧木的耐錳性越強(qiáng)。

公式 (3) 計(jì)算各項(xiàng)綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。Xj為第j個(gè)綜合指標(biāo)，Xmin為第j個(gè)綜合指標(biāo)中的最小值，Xmax為第j個(gè)綜合指標(biāo)中的最大值。

公式 (4) 是根據(jù)綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率求各綜合指標(biāo)權(quán)重。Wj值表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度，Pj為各砧木苗第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mn過(guò)量脅迫下不同柑橘砧木的毒害癥狀及生物量

當(dāng)Mn濃度在0.25 mmol/L以上時(shí)，4種柑橘砧木均生長(zhǎng)遲緩、矮小，葉片不同程度地失綠，葉緣發(fā)黃，嚴(yán)重時(shí)全葉黃化、葉片干枯，甚至全株枯死；根系量減少、短小，呈深褐色，嚴(yán)重時(shí)死亡(圖1a和b)。Mn0.25處理下，枳出現(xiàn)Mn中毒癥狀最早最明顯，其余3種砧木僅表現(xiàn)為葉片輕微失綠，其中，資陽(yáng)香橙癥狀最輕；在Mn1.25處理第62天，枳有一半以上葉片全葉黃化，67天死苗達(dá)到一半，而此時(shí)其余砧木無(wú)明顯黃化葉，僅失綠加重，部分葉緣變黃；在Mn6.25處理第34天時(shí)枳的一半葉片全葉黃化，61天死苗達(dá)到一半，其余砧木在第52～57天，有一半葉片全葉黃化，到試驗(yàn)結(jié)束未出現(xiàn)死苗。

圖1 過(guò)量Mn脅迫下4種柑橘砧木苗地上部(a)和地下部 (b)的毒害癥狀Fig. 1 Toxic symptoms of shoots (a) and roots (b) of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

處理結(jié)束后生物量測(cè)定結(jié)果顯示 (表1)，隨著Mn處理濃度的升高，4種柑橘砧木的生長(zhǎng)受到抑制，地上、地下部分的鮮重和干重均下降。在Mn0.05處理下，枳的地上部、地下部干重與對(duì)照相比無(wú)顯著差異；當(dāng)Mn濃度升至0.25 mmol/L時(shí)，多數(shù)砧木苗地上部、地下部鮮重和干重較對(duì)照顯著下降；Mn濃度升至6.25 mmol/L時(shí)，全部砧木的鮮重和干重顯著低于對(duì)照；過(guò)量Mn處理使砧木根冠比總體上升(紅橘除外)，說(shuō)明過(guò)量Mn對(duì)地上部生長(zhǎng)的抑制作用大于地下部。

表1 Mn過(guò)量脅迫下4種柑橘砧木苗的生物量Table 1 Biomass of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

2.2 Mn過(guò)量脅迫對(duì)不同柑橘砧木光合和抗氧化指標(biāo)的影響

圖2表明，Mn處理導(dǎo)致4種砧木葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a + b和類胡蘿卜素含量均不同程度減少，減少幅度與Mn濃度成正比。具體而言，除Mn0.05與Mn0.01 (CK) 處理的光合色素水平無(wú)顯著差異外，4種砧木在其他Mn處理下的光合色素含量均顯著降低，在Mn6.25處理下，枳的光合色素含量降低最多，其葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a +b和類胡蘿卜素分別較CK下降了92.53%、87.84%、91.52%和83.77%，而資陽(yáng)香橙和紅橘的光合色素受到的影響相對(duì)較小，沙田柚居中。

圖2 不同Mn濃度處理下4種柑橘砧木苗葉片光合色素含量Fig. 2 Contents of leaf photosynthesis pigments of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

光合指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，隨著Mn濃度的增加，4種柑橘砧木葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度逐漸下降，而胞間二氧化碳濃度逐漸上升 (表2)。4種砧木苗的中毒癥狀在Mn0.25處理時(shí)才出現(xiàn)不同，在Mn0.05處理時(shí)4種砧木葉片凈光合速率顯著下降，說(shuō)明出現(xiàn)Mn毒害的起始濃度應(yīng)在0.05 mmol/L或以下。在Mn6.25處理時(shí)，4種砧木的凈光合速率下降到0.19～0.75 μmol/(m2·s)，遠(yuǎn)低于正常值 3.71～4.02 μmol/(m2·s)。4種砧木的光合指標(biāo)表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)，總體而言，Mn過(guò)量脅迫對(duì)枳和沙田柚砧木光合參數(shù)影響最大，對(duì)紅橘和資陽(yáng)香橙影響較小。。

表2 不同Mn濃度處理下4種柑橘砧木苗葉片光合生理指標(biāo)Table 2 Photosynthesis indexes of four citrus rootstock seedling leaves under different Mn concentrations

細(xì)胞膜受損程度及抗氧化酶活性研究結(jié)果顯示，4種砧木葉片的相對(duì)電導(dǎo)率隨Mn處理濃度的升高而增加，上升速度和幅度由大到小依次是紅橘、枳、沙田柚、資陽(yáng)香橙。與對(duì)照相比，電導(dǎo)率上升最多的是枳和紅橘，上升4.73倍，沙田柚上升2.92倍，資陽(yáng)香橙上升2.42倍。紅橘、沙田柚和資陽(yáng)香橙葉片MDA含量總體上隨Mn處理濃度升高而升高，處理濃度達(dá)到Mn6.25時(shí)MDA含量出現(xiàn)躍升，而枳在Mn0.25脅迫時(shí)MDA含量即達(dá)最大值，然后隨Mn濃度的進(jìn)一步升高而下降，可能是因?yàn)镸n濃度達(dá)到0.25 mmol/L時(shí)，枳細(xì)胞有關(guān)MDA的生化反應(yīng)變緩或被部分停止。4種砧木葉片SOD活性隨著Mn濃度的升高呈上升趨勢(shì)，在最高M(jìn)n濃度(6.25 mmol/L)下，枳SOD活性最強(qiáng)，然后依次是紅橘、資陽(yáng)香橙和沙田柚。POD活性整體變化趨勢(shì)為先上升后下降，其中枳的變化幅度最大。CAT活性則隨Mn濃度的升高而下降，與對(duì)照相比，Mn6.25處理的紅橘降低最多，沙田柚降低最少 (表3)。

表3 不同Mn濃度處理下4種柑橘砧木苗葉片細(xì)胞膜受損程度及抗氧化酶活性Table 3 Membrane damage and antioxidant enzyme activities in leaves of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

2.3 Mn過(guò)量脅迫對(duì)不同柑橘砧木葉片和根系礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素含量的影響

圖3結(jié)果顯示，在對(duì)照條件下 (Mn0.01)，枳、資陽(yáng)香橙、紅橘、沙田柚葉片Mn含量分別為75.9、71.6、49.6、42.8 mg/kg，處在正常含量范圍(25～100 mg/kg) 內(nèi)。Mn 處理使砧木葉片 Mn 含量升高，但不同砧木葉片的升高幅度不同，在Mn0.01至Mn0.25處理之間，枳葉片Mn含量的升高幅度大于另外3種砧木；在Mn0.05處理時(shí)，枳、資陽(yáng)香橙、紅橘、沙田柚葉片Mn含量分別為179.4、104.4、148.8、156.5 mg/kg，在 Mn0.25處理時(shí)分別為444.0、250.8、343.9、415.5 mg/kg，表明枳在低濃度過(guò)量Mn脅迫時(shí)更容易吸收累積和轉(zhuǎn)移Mn；但是，在高M(jìn)n濃度處理（Mn1.25和Mn6.25）時(shí)，枳葉片Mn含量則明顯低于另外3種砧木，可能是在更高的Mn濃度脅迫下，枳根系受到的傷害更重，影響了Mn的吸收和轉(zhuǎn)移。4種砧木根系Mn含量隨Mn處理濃度的升高而增加，Mn0.05處理使4種砧木根系Mn含量比對(duì)照升高約5倍，與Mn處理濃度的增加幅度幾乎相同；然而，Mn濃度達(dá)到0.25 mmol/L以后，4種砧木根系的Mn含量劇烈增加，其中紅橘和資陽(yáng)香橙的根系Mn含量增長(zhǎng)幅度高于枳和沙田柚。在Mn6.25處理時(shí)，4種砧木的根系中Mn含量由低到高依次為 7487.5 (枳)、8675.4 (沙田柚)、11814.3 (紅橘)、12159.5 (資陽(yáng)香橙) mg/kg。從砧木Mn遷移率看，從Mn0.01處理到Mn0.05處理，4種砧木Mn遷移率均出現(xiàn)銳減；Mn濃度高于0.05 mmol/L后，4種砧木Mn遷移率總體隨Mn濃度的增加而升高，但不同砧木的升高幅度和原因不盡相同，枳因?yàn)樵贛n濃度達(dá)到0.25 mmol/L以后中毒明顯，根系處于衰亡過(guò)程中，錳遷移率幾乎不再上升；資陽(yáng)香橙在Mn濃度達(dá)到0.05 mmol/L以后，遷移率就進(jìn)入極緩慢上升過(guò)程，但此時(shí)根系正常，可能存在主動(dòng)抑制Mn向葉片過(guò)量轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

圖3 4種柑橘砧木葉片和根系Mn含量及遷移率隨營(yíng)養(yǎng)液中Mn濃度的變化Fig. 3 Changes of Mn content in leaves and roots and translocation rate of Mn from roots to leaves of four citrus rootstock seedlings with different concentrations of Mn in nutrient solution

隨著Mn濃度的升高，葉片K、P含量下降，而根系K、P含量上升；本研究條件下，Mn濃度升至最高6.25 mmol/L時(shí)，葉片K、P含量降至最低，根系K、P含量升至最高。4種砧木葉片和根系Ca、Mg含量整體隨Mn濃度升高呈下降趨勢(shì)，但葉片Ca、Mg含量和根系Mg含量下降幅度很小。Mn處理后，隨Mn濃度增加，葉片F(xiàn)e、Zn含量整體下降，而根系Fe、Zn含量整體則呈上升趨勢(shì)?？傮w而言，Mn處理對(duì)柑橘砧木苗的P、K、Ca、Mg、Fe和Zn元素含量產(chǎn)生明顯影響。在Mn濃度為0.01 mmol/L (CK)～0.05 mmol/L 時(shí)，砧木苗的營(yíng)養(yǎng)元素含量即發(fā)生變化，并且與CK相比，枳根系P含量變化幅度最大值在Mn 1.25 mmol/L時(shí)出現(xiàn)，其余營(yíng)養(yǎng)元素平均含量的變化幅度最大值均在Mn6.25 mmol/L 時(shí)出現(xiàn) (圖 4)。

（圖4）

圖4 不同Mn濃度下4種柑橘砧木葉片和根系營(yíng)養(yǎng)元素含量Fig. 4 Nutrient contents in leaves and roots of four citrus rootstock seedlings under different Mn concentrations

2.4 不同砧木對(duì)Mn毒害耐受性的綜合評(píng)價(jià)

砧木各項(xiàng)生理生化指標(biāo)隨Mn處理濃度的增加變化的規(guī)律不盡相同，若以單一指標(biāo)評(píng)價(jià)耐受性所得結(jié)果準(zhǔn)確性差。因此采用主成分分析及隸屬函數(shù)分析法對(duì)4種砧木苗的相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、光合作用指標(biāo)等的耐性系數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)計(jì)算所得的4種砧木苗的錳過(guò)量耐受性綜合評(píng)價(jià)值D(表4) 可以判斷4種砧木苗對(duì)錳毒害的耐受性強(qiáng)弱順序?yàn)橘Y陽(yáng)香橙 (0.96) ＞ 沙田柚 (0.81) ＞ 紅橘 (0.58) ＞枳 (0.00)。

表4 不同柑橘砧木的綜合指標(biāo)值 (F)、隸屬函數(shù)值 (U) 和綜合評(píng)價(jià)值 (D)Table 4 The comprehensive index value (F), subordinate function value (U) and integrated assessment value (D) of four citrus rootstock seedlings under excessive Mn stress

3 討論

Mn是生長(zhǎng)素氧化酶的激活劑，植物體內(nèi)Mn含量的增加會(huì)引起該酶的活性增強(qiáng)從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制[25]。本試驗(yàn)中，隨著Mn處理濃度的升高，各砧木的地上部和地下部鮮、干重均有所下降，砧木生長(zhǎng)受到抑制，且經(jīng)過(guò)過(guò)量Mn處理的砧木根冠比總體上升 (紅橘除外)，說(shuō)明過(guò)量Mn對(duì)地上部生長(zhǎng)的抑制效果更強(qiáng)。薛生國(guó)等[26]研究也發(fā)現(xiàn)錳毒害主要危害地上部分，植株中87%～95%的錳被分布在地上部。

光合作用是植物重要的生命活動(dòng)，光合指標(biāo)是植物眾多生理代謝的綜合反映，在植物生物逆境和非生物逆境中，光合作用會(huì)受到抑制，光合指標(biāo)受到影響，如凈光合速率降低、氣孔開度降低、胞間CO2濃度升高等[27-29]。過(guò)高的錳含量則會(huì)抑制根系對(duì)Fe、Mg等元素的吸收和活性，從而引起氧化性脅迫導(dǎo)致氧化損傷，導(dǎo)致葉綠素的合成下降、葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞[4]。本研究顯示，在過(guò)量Mn處理下，砧木葉片褪綠，這是由于高錳脅迫導(dǎo)致砧木葉片葉綠素合成受到抑制而含量下降。同時(shí)，柑橘砧木葉片的光合指標(biāo)明顯變化，葉片凈光合速率的下降與Mn處理濃度的增加表現(xiàn)出良好的趨同性。因此，在土壤酸性強(qiáng)、有效錳含量高的柑橘園，可以采用凈光合速率指標(biāo)的測(cè)定衡量樹體是否錳中毒，這遠(yuǎn)比葉片營(yíng)養(yǎng)診斷快速和簡(jiǎn)單。另外，過(guò)量錳會(huì)與細(xì)胞膜質(zhì)產(chǎn)生氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使大量MDA累積[30-32]。過(guò)量錳處理下的砧木苗相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量都顯著升高，說(shuō)明此時(shí)植物細(xì)胞膜已經(jīng)受到了嚴(yán)重的損害。本研究中，枳葉片MDA含量隨Mn濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，其他3種砧木則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不同砧木中的變化趨勢(shì)有差異，這可能與砧木中膜脂過(guò)氧化作用途徑發(fā)生變化有關(guān)。為了減少因?yàn)檫^(guò)量錳產(chǎn)生的活性氧自由基帶來(lái)的危害，植物體內(nèi)抗氧化酶SOD、POD、CAT活性會(huì)增加，清除體內(nèi)活性氧[4,33-34]。本研究中，雖然Mn處理下，4種砧木的這些生化指標(biāo)也發(fā)生明顯變化，但由于錳的金屬離子特性和酶活性的復(fù)雜性，其變化的規(guī)律性不一致。試驗(yàn)中隨著錳處理濃度的升高，SOD活性增加，POD活性先增加后減少，可能是由于此時(shí)起主要作用的抗氧化酶是SOD。又因?yàn)橹亟饘僭谥参矬w內(nèi)的生物學(xué)作用機(jī)制不同，植物體內(nèi)的CAT對(duì)不同重金屬所產(chǎn)生的的生態(tài)效應(yīng)也不同[35]，并且Fe是CAT的組分，過(guò)量錳會(huì)降低植物體內(nèi)Fe的含量[34]。CAT含量在砧木受到過(guò)量錳脅迫后呈下降趨勢(shì)，王丹媚等[27]試驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明錳對(duì)CAT活性具有明顯低促高抑作用。

植物體內(nèi)礦質(zhì)元素平衡是其正常發(fā)育的必要條件，但重金屬脅迫會(huì)改變植物體內(nèi)礦質(zhì)元素的吸收與分布[36]。Pittman[37]研究發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橄嗨频碾x子半徑，Mn和Ca、Mg在根部的吸收有拮抗作用。本研究顯示，Mn處理后的砧木葉片與根系中Mg和Ca含量較對(duì)照降低，說(shuō)明錳過(guò)量脅迫抑制了根系對(duì)Mg和Ca的吸收，這與申須仁等[29]和曾琦等[34]研究結(jié)果一致。另外，本試驗(yàn)中Mn處理導(dǎo)致柑橘砧木根系P、K、Fe含量上升，葉片P、K、Fe含量下降，說(shuō)明高濃度錳影響了P、K、Fe在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分配，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

何勇強(qiáng)等[3]研究發(fā)現(xiàn)柑橘是一類對(duì)錳毒害較為敏感的植物，栽培于酸性土壤的柑橘，在葉片錳含量超過(guò)100 mg/kg時(shí)，即會(huì)表現(xiàn)出錳中毒癥狀[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳、資陽(yáng)香橙、紅橘、沙田柚砧木在錳濃度 0.05 mmol/L 處理時(shí)葉片錳含量 104～179 mg/kg，雖然此時(shí)在表觀上看不到葉片錳中毒癥狀，但葉片凈光合速率已顯著下降，葉片電導(dǎo)率、SOD活性、POD活性也顯著上升，說(shuō)明在生理代謝水平上已受到錳過(guò)量的影響；柑橘葉片錳含量診斷適宜值為25～100 mg/kg[38]，從前人的研究結(jié)果[10,12-14]看，我國(guó)柑橘葉片錳含量超標(biāo)比例高，盡管有些錳超標(biāo)果園可能在外觀上還看不到明顯中毒癥狀，但在生理上已經(jīng)造成了傷害，影響柑橘產(chǎn)量質(zhì)量的提高，應(yīng)引起重視。從本研究結(jié)果看，過(guò)量錳脅迫對(duì)砧木產(chǎn)生的影響是多方面的，砧木可通過(guò)調(diào)節(jié)保護(hù)酶活性等來(lái)對(duì)抗脅迫傷害。不同砧木對(duì)錳過(guò)量脅迫的耐受性存在明顯差異，造成這種差異的原因有兩方面，一個(gè)是錳吸收轉(zhuǎn)運(yùn)差異，另一個(gè)是對(duì)錳敏感性差異。與資陽(yáng)香橙、沙田柚和紅橘相比，枳更容易吸收轉(zhuǎn)移錳，在Mn處理濃度僅0.25 mmol/L時(shí)，枳葉片錳含量即達(dá)到444.0 mg/kg，而資陽(yáng)香橙葉片僅250.8 mg/kg；然而，枳對(duì)錳過(guò)量脅迫又比其他砧木更敏感，枳葉片錳含量1815 mg/kg時(shí)導(dǎo)致葉片黃化和死苗，而其余3種砧木葉片錳含量達(dá)到2065～2751 mg/kg時(shí)才出現(xiàn)一半葉片黃化，葉片錳含量達(dá)到2725～3837 mg/kg時(shí)仍未出現(xiàn)死苗。因此，應(yīng)該是不同砧木對(duì)錳轉(zhuǎn)運(yùn)和敏感性的差異，共同導(dǎo)致了其錳耐受性差異。在酸性土壤柑橘產(chǎn)區(qū)應(yīng)更加注意土壤和樹體錳元素的栽培管理，以避免柑橘果實(shí)品質(zhì)受到影響，造成生產(chǎn)上的損失。資陽(yáng)香橙具有耐堿性強(qiáng)、與多種類柑橘親和性好、豐產(chǎn)性好、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[18-20]，因此，建議在高錳土壤的柑橘園選用資陽(yáng)香橙作為砧木。

4 結(jié)論

4種柑橘砧木在錳濃度0.05 mmol/L時(shí)即會(huì)出現(xiàn)生理指標(biāo)變化，錳濃度0.25 mmol/L時(shí)葉片和根系出現(xiàn)表觀錳中毒癥狀，枳對(duì)錳過(guò)量脅迫最為敏感；綜合評(píng)價(jià)4種砧木耐錳過(guò)量脅迫的強(qiáng)弱順序?yàn)椋嘿Y陽(yáng)香橙 ＞ 沙田柚 ＞ 紅橘 ＞ 枳。