融安金桔不同生長期果實(shí)品質(zhì)特性比較

李俊，傅曼琴，徐玉娟，吳繼軍，余元善，溫靖

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

金桔又名金橘、金柑、金彈、羅浮、牛奶桔等，為蕓香科金橘屬植物金橘Fortunella margarita(Lour.)Swingle 的果實(shí)，是藥食兼用型水果，不僅清甜爽口，且營養(yǎng)價(jià)值極高，具有理氣、解郁、消食、開胃、化痰、醒酒等功效，主治胸悶郁結(jié)、腹脘痞脹、食滯納呆、化痰止咳以及傷酒口渴等癥。金桔果皮富含黃酮類活性物質(zhì)[1]，其總黃酮含量顯著高于其他品種柑桔皮。金桔黃酮對羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（·O2-）均有良好的清除作用[2]，還可通過修復(fù)胰島β細(xì)胞以及提高胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力來提高小鼠體內(nèi)胰島素的濃度，從而調(diào)節(jié)血糖和改善糖耐量[3]。金桔多酚具有抗氧化、抗病毒等多種藥理活性[4,5]，亦可顯著降低高膽固醇癥的血漿總膽固醇，膽固醇及甘油三酯的含量[6]。金桔多糖通過提高血漿和組織中脂肪酶活性、降低膽固醇含量和増強(qiáng)抗氧化醇活性等途徑達(dá)到對高血脂癥大鼠的降血脂作用[7]。此外，金桔果實(shí)中含油率約為1～2%[8]，油質(zhì)溫和，品質(zhì)為柑桔類精油之最，是重要的化工原料、食用香精及日化香精。金桔精油可通過抑制p38 MAPK和NF-KB信號通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[9]。總之，金桔具有抑菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降脂及防治心腦血管疾病等多種功效，因此經(jīng)常攝食對提高免疫力、預(yù)防血栓及動脈粥樣硬化等慢性病益處多多。

金桔多產(chǎn)于中國南方，廣東、廣西、臺灣、福建等省均有分布。廣西“融安金桔”為中國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，種植歷史悠久，作為融安縣傳統(tǒng)特產(chǎn)水果，素有"長壽果"的美稱。果表富有光澤，清香甜脆，油泡細(xì)密，含芳香油、維生素A、維生素C、磷、果膠及粗纖維等，風(fēng)味濃郁，入口化渣，甜蜜可口，品味佳。金桔成熟期為每年十月底至十二月初[10]，采收期不同，其口感風(fēng)味、營養(yǎng)品質(zhì)亦不同，本研究以產(chǎn)自融安地區(qū)的兩個(gè)金桔品種（油皮金桔和脆皮金桔）的不同生長發(fā)育時(shí)期的金桔果實(shí)為研究對象，分析其果實(shí)性狀、理化特性及營養(yǎng)活性成分等動態(tài)變化規(guī)律，以期為金桔的科學(xué)采收、質(zhì)量控制和進(jìn)一步精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

油皮金桔和脆皮金桔均產(chǎn)自廣西融安縣大將鎮(zhèn)，生長期為2019年9月至12月，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所徐玉娟研究員鑒定為油皮金桔和脆皮金桔。具體樣品編號如表1所示。

表1 供試樣品信息表Table 1 Summary of the samples harvested at different time

1.2 主要試劑

乙醇（分析純），中糧生化能源有限公司；乙腈，上海昊化化工有限公司；磷酸氫二銨，吳江市黎里東陽助劑廠；偏磷酸，南通天昊化工有限公司；Folin-Ciocalteu，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；無水碳酸鈉，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，天津市褔晨化學(xué)試劑廠；沒食子酸，甲醇（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯，南京化學(xué)試劑股份有限公司；甲醇（色譜純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；硝酸鋁，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁，湖南奧馳生物科技有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），二硫代蘇糖醇（TPTZ），2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS），日本東京化成工業(yè)；6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox），美國Sigma公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

電子天平ME204，pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；G&GJJ1000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；RFM340+全自動臺式折光儀，桂寧（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司超聲波清洗機(jī)，上海之信儀器有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計(jì)，日本津島公司；JW-1042低速大容量離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化器械株式會社；高效液相色譜儀，日本津島公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團(tuán)公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 果實(shí)理化性狀

單果重、果籽占比、出汁率用電子天平測定；果汁pH值用pH計(jì)測定，可溶性固形物含量用折光儀測定，可滴定酸含量采用Na OH中和滴定法測定。

1.4.2 總酚、總黃酮含量的測定[11]

總酚含量采用福林酚法進(jìn)行測定：分別取樣液1 mL，加入1 mL的福林-酚試劑，用7.5%的Na2CO3水溶液定容至25 mL，混勻后在室溫下暗處靜置2 h后，取上清液，分光光度計(jì)在700 nm處測定其吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（mg GE/g）表示：

y=31.285x-0.0535，R2=0.9928

總黃酮含量采用改良的比色法進(jìn)行測定：分別取樣液1 mL，加入5%的NaNO2溶液1 mL，混勻，5 min后加入10%的Al(NO3)3水溶液1 mL，5 min后加入0.04 g/mL NaOH水溶液10 mL并混勻，用去離子水定容至25 mL，充分混勻，靜置15 min后，取上清液在510 nm處測定吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量（mg RE/g）表示：

1.4.3 主要糖分含量的測定[12]

采用高效液相色譜法（HPLC）測定，包括果糖、葡萄糖和蔗糖。色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm），檢測器為蒸發(fā)光（ELSD）檢測器，柱溫40 ℃，漂移管溫度為50 ℃，流動相為70%乙腈，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

表2 三種糖類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 The standard curves for three carbohydrate compounds

1.4.4 主要有機(jī)酸含量測定[12]

采用HPLC法進(jìn)行測定，包括抗壞血酸、蘋果酸和草酸。色譜條件：C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器（PDA），檢測波長210 nm；流動相：0.1%的(NH4)2HPO4，調(diào)節(jié)pH值2.7；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表3 三種有機(jī)酸類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 The standard curves for three organic acids

1.4.5 主要黃酮類物質(zhì)含量測定[13]

采用HPLC法進(jìn)行測定。色譜條件：C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器（PDA），流動相：1%甲酸（A），甲醇（B）；0～10 min，10% A，90%B；10～14 min，30% A，70% B；14～15 min，50% A，50% B；15～20 min, 90% A，10% B；檢測波長280 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表4 三種黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 4 Standard curves for three flavonoids

1.4.6 總抗氧化能力測定

表5 三種抗氧化檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curves for three antioxidant detection methods

分別采用DPPH、FRAP和ABTS方法測定金桔果實(shí)的Trolox等效抗氧化能力。

DPPH法：參照Barreca等[14]的方法，稍作改動。50 μL待測液加150 μM DPPH甲醇溶液，室溫避光反應(yīng)20 min，用酶標(biāo)儀測定波長517 nm處的吸光度，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同濃度的Trolox對DPPH自由基的清除率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示（mmol TE/g）。

FRAP法：參照Hamrouni-Sellami等[15]的方法，稍加改動。20 μL待測液加180 μL FRAP反應(yīng)液（10 mM TPTZ，20 mM FeCl3），反應(yīng)30 min，測定593 nm處吸光值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同濃度的Trolox對鐵離子的還原力，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示（mmol TE/g）。

ABTS法：參照J(rèn)imenez-Zamora等[16]的方法，稍加改動。將7.4 mM的ABTS溶液和2.6 mM的過硫酸鉀溶液1:1混合，在室溫、避光的條件下靜置過夜，形成ABTS儲備液。使用前用無水乙醇稀釋至734 nm波長處吸光度為0.7±0.02。取適當(dāng)稀釋后的待測樣品10 μL，加入190 μL ABTS溶液，室溫條件下避光反應(yīng)6 min，測定波長734 nm處吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測定不同濃度的Trolox對ABTS＋·的清除率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示（mmol TE/g）。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

所有試驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0進(jìn)行。采用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)對同一品種不同采收期的金桔果實(shí)進(jìn)行多重比較。并進(jìn)行t檢驗(yàn)，比較不同品種在同一采收期的差異，p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

圖1 金桔不同生長期間果實(shí)理化性狀Fig.1 The fruit physicochemical properties of kumquat during different growth periods

2.1 不同生長期間金桔果實(shí)理化性狀比較分析

成熟后的油皮金桔油包多、籽大，口感甜味一般、稍顯辛澀，麻嘴；而脆皮金桔幾乎無油包，少籽或無籽，吃起來純甜無辣味。不同采收期間兩種金桔的單果重、果籽占比、出汁率、pH值、可溶性固形物、可滴定算以及糖酸比等果實(shí)性狀比較如圖1所示。

兩種金桔隨生長期的延長，單果重逐漸增大，但是兩種金桔之間無顯著性差異；成熟的油皮金桔的果籽質(zhì)量占整果的2.38%，顯著高于脆皮金桔；出汁率顯著上升，生長后期，脆皮金桔的出汁率顯著高于油皮金桔；9～12月期間，脆皮金桔的pH值、可溶性固形物以及糖酸比均顯著高于油皮金桔，但二者可滴定酸含量無顯著性差異。

糖、酸含量及其配比是影響果實(shí)風(fēng)味的重要指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，低糖高酸的果實(shí)風(fēng)味過酸，而高糖低酸的果實(shí)風(fēng)味清甜卻寡淡，都不適宜作為鮮食。有研究發(fā)現(xiàn)，在蘋果中果實(shí)糖酸比和含糖量無關(guān)，主要取決于含酸量，含酸量在0.2%～0.5%的品種，甜酸適宜，鮮食品質(zhì)好[17]。本研究中，金桔的可溶性固形物含量、糖酸比隨生長期延長而上升，可滴定酸含量顯著下降，完全成熟后脆皮金桔的糖酸比（130.69）顯著高于油皮金桔（99.00），這也是脆皮金桔比油皮金桔口感較甜的原因。

2.2 不同生長期間金桔果實(shí)主要糖分含量變化

采用高效液相色譜法從金桔果汁中檢測到三種主要糖類化合物，果糖、葡萄糖和蔗糖，用外標(biāo)法進(jìn)行糖組分的定量分析，三種糖均隨生長期延長而積累，但是增長幅度不一致，9～12月期間，油皮金桔的果糖含量一直在增加，葡萄糖和蔗糖只在早期增長較快，后期11～12月其含量無顯著增加；而脆皮金桔的三種糖類均在早期迅速積累，后期無顯著變化。至成熟末期，油皮金桔的果糖、葡萄糖和蔗糖含量分別為9月時(shí)的4.46倍、2.62倍和2.32倍，脆皮金桔分別增長至6.25倍、4.90倍和2.19倍，積累最多的是果糖，其次是葡萄糖，蔗糖含量最低，且脆皮金桔的三種糖含量均顯著高于油皮金桔。據(jù)報(bào)道，梨的成熟果實(shí)中積累的可溶性糖為葡萄糖和果糖，在果實(shí)迅速生長期也是葡萄糖和果糖的迅速積累期[18]。

表6 油皮金桔和脆皮金桔不同生長期間果實(shí)主要糖分含量變化（mg/g）Table 6 The changes of main sugar content of kumquat fruit during different growth periods (mg/g)

表7 油皮金桔和脆皮金桔不同生長期間果實(shí)主要有機(jī)酸含量變化（mg/g）Table 7 The changes of main organic acid content of kumquat fruit during different growth periods (mg/g)

2.3 不同生長期間金桔果實(shí)主要有機(jī)酸含量變化

采用高效液相色譜法從金桔果汁中檢測到三種主要有機(jī)酸，抗壞血酸、蘋果酸和草酸。其中抗壞血酸含量隨生長期延長先上升后下降，10月份采收的金桔抗壞血酸含量達(dá)到峰值，且油皮金桔（48.23 mg/g）顯著高于脆皮金桔（23.20 mg/g）；蘋果酸和草酸含量均隨生長期延長而下降，下降幅度最大的為油皮金桔的草酸含量從9月份的6.62 mg/g下降至1.65 mg/g，脆皮金桔的蘋果酸和草酸含量均顯著高于油皮金桔。在生長發(fā)育過程中，果實(shí)中的有機(jī)酸一方面作為代謝底物用于氨基酸、酯類、醇類以及醛類等物質(zhì)的形成，另一方面也是三羧酸循環(huán)過程的重要中間產(chǎn)物和能量物質(zhì)，因此果實(shí)的成熟過程中有機(jī)酸起到了重要作用，蘋果中的有機(jī)酸含量隨果實(shí)的成熟亦逐漸下降[19]。

2.4 不同生長期間金桔果實(shí)總黃酮和主要黃酮類化合物含量變化

圖2 三個(gè)主要黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structure of three main flavonoids

金桔生長期間，總黃酮含量逐漸下降，如圖3a所示從9月至12月，油皮金桔的總黃酮含量從3.45 mg RE/g下降至1.21 mg RE/g，脆皮金桔從2.14 mg RE/g下降至0.76 mg RE/g。成熟前期9～10月，油皮金桔的總黃酮含量顯著高于脆皮金桔（p＜0.05），而到成熟后期11～12月，兩者無顯著性差異（p＞0.05）。

圖3 金桔不同生長期間果實(shí)黃酮含量變化Fig3. The changes of flavonoids content in kumquat fruit during different growth periods

采用高效液相色譜法從總黃酮中檢測到3個(gè)主峰，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品對照并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，分別鑒定為金柑苷[20]、橙皮苷[21]和蘆丁[22]，結(jié)構(gòu)圖如圖2，采用外標(biāo)法對其進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明兩種金桔果實(shí)中，橙皮苷含量最高（516.24～767.45 μg/g），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他2個(gè)化合物（金柑苷18.71～38.56 μg/g，蘆丁41.69～84.97μg/g）。從圖3b～d可以看出，9～12月期間，金柑苷的含量呈上升趨勢，而橙皮苷和蘆丁含量顯著下降。9～11月期間，油皮金桔和脆皮金桔的金柑苷含量無顯著差異，到成熟后期12月，油皮金桔的金柑苷含量顯著高于脆皮金桔；10月份油皮金桔的橙皮苷含量顯著高于脆皮金桔，其他月份則無顯著差異；9月份兩者的蘆丁含量無顯著差異，而隨著果實(shí)的成熟，10～12月期間，脆皮金桔的蘆丁含量均顯著高于油皮金桔。總體上，金桔果實(shí)生長期間總黃酮含量下降，Barreca等報(bào)道未成熟的金桔汁總黃酮含量是成熟金桔汁的3倍，與本文結(jié)果一致[2]；在酸橙果實(shí)生長過程中，總黃酮含量下降，但是其中有些化合物如野漆樹苷、橙皮苷等含量上升，蘆丁、柚皮苷等含量下降[23]。說明果實(shí)成熟期間，黃酮類物質(zhì)發(fā)生著轉(zhuǎn)化積累或者降解，具體生物合成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.5 不同生長期間金桔果實(shí)總酚含量和抗氧化活性分析

如圖4a所示，9月至12月期間，油皮金桔和脆皮金桔的總酚含量均顯著下降，且油皮金桔的總酚含量始終高于脆皮金桔，油皮金桔總酚從5.12下降至3.23 mg GAE/g，脆皮金桔從3.47下降至1.69 mg GAE/g。酚類物質(zhì)是果實(shí)抗氧化能力的主要因素，有研究報(bào)道了抗氧化能力與總酚含量之間的相關(guān)性[24,25]。測定天然產(chǎn)物體外抗氧化活性的方法有多種，如FRAP、DPPH、ABTS、ORAC法等，然而，由于植物化學(xué)組成的復(fù)雜以及氧化過程的復(fù)雜性，抗氧化活性可能是不同機(jī)制的結(jié)果，如抑制過氧化物的分解，中斷連續(xù)的脫氫反應(yīng)，阻止清除自由基、還原能力或者結(jié)合過渡金屬離子催化劑，因此，僅用一種方法無法全面評估植物提取物的抗氧化活性[26,27]。本研究采用FRAP、DPPH和ABTS法測定金桔果實(shí)總酚的抗氧化活性，結(jié)果表明其抗氧化活性亦顯著下降（圖4b～d），且油皮金桔的FRAP值（1.52～3.66 mmol TE/g）、DPPH值（4.05～6.02 mmol TE/g）和ABTS值（1.36～2.59 mmol TE/g）分別高于脆皮金桔（0.29～2.07 mmol TE/g，2.69～4.40 mmol TE/g和0.52～1.66 mmol TE/g）。該趨勢與文獻(xiàn)報(bào)道一致，未成熟金桔果實(shí)中的黃酮類化合物對DPPH·(約79%)和ABTS·+(約93%)的抗氧化作用貢獻(xiàn)最大，而成熟的金桔總酚、總黃酮含量僅為未成熟金桔的三分之一左右[2]。差異（p＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，從9月到12月，金桔的單果重、出汁率、pH值、可溶性固形物和糖酸比等理化指標(biāo)上升，果籽率和可滴定酸含量下降，油皮金桔和脆皮金桔的成熟單果重、可滴定酸含量均無顯著差異，油皮金桔的果籽率顯著高于脆皮金桔，而其出汁率、果汁pH值、可溶性固形物以及糖酸比顯著低于脆皮金桔；金桔果實(shí)的主要糖組分為果糖、葡萄糖和蔗糖，三者含量均增加至9月份的2倍以上，完全成熟時(shí)，脆皮金桔的三種糖含量均顯著高于油皮金桔；主要有機(jī)酸為抗壞血酸、蘋果酸和草酸，其中抗壞血酸含量先上升后下降，而蘋果酸和草酸含量一直下降，且抗壞血酸含量油皮＞脆皮金桔，而草酸含量油皮＜脆皮金桔；金桔的總黃酮含量呈下降趨勢，9～10月，總黃酮含量油皮金桔＞脆皮金桔，后期二者無顯著差異；主要黃酮組分為金桔柑、橙皮苷和蘆丁，其中金桔苷含量上升，而后兩個(gè)化合物含量下降，成熟后期，金桔苷含量油皮＞脆皮金桔，蘆丁含量油皮＜脆皮，二者橙皮苷含量無顯著差異；總酚含量下降，油皮金桔的總酚含量和總抗氧化活性均顯著高于脆皮金桔。綜上所述，通過本研究明確了9～12月期間，金桔果實(shí)的理化性狀以及活性成分的動態(tài)變化規(guī)律，探明了油皮金桔和脆皮金桔的兩個(gè)品種在不同時(shí)期的特點(diǎn)，為兩種金桔的科學(xué)采收、質(zhì)量控制和進(jìn)一步精深加工提供了理論依據(jù)。