牡丹花水提物對腎素和ACE的雙重抑制作用

高一芳，劉雪婷，閆仲麗，楊文清，李西西，王昌祿，李風(fēng)娟

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457）（2.天津科技大學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)研究中心，天津 300457）

高血壓是引發(fā)心腦血管疾病的主要風(fēng)險因素之一，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是機體重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其中，腎素是該系統(tǒng)級聯(lián)反應(yīng)的起始限速酶，腎素水解血管緊張素原生成血管緊張素-Ⅰ，血管緊張素-Ⅰ會在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的催化作用下進一步水解為具有強血管收縮作用的血管緊張素-Ⅱ，從而導(dǎo)致機體血壓升高[1]。抑制腎素和ACE的活性被認為是預(yù)防和治療高血壓的有效手段。合成的腎素抑制劑阿利吉侖、ACE抑制劑卡托普利等廣泛應(yīng)用于臨床上高血壓的治療，但其長期服用會導(dǎo)致干咳、過敏、味覺障礙等副作用[2]。因此，新型安全有效的腎素和ACE抑制劑廣受研究人員的關(guān)注。近年來一些研究報道了從食品中發(fā)現(xiàn)的天然腎素和ACE抑制活性物質(zhì)，如大麻籽[3]和紅海藻中[4]的小分子肽、花生[5]和水牛奶[6]的蛋白水解物等。值得注意的是，與肽類物質(zhì)相比，一些食源性多酚化合物[7]表現(xiàn)出優(yōu)異的腎素抑制活性，這為挖掘新型血壓調(diào)控因子及相關(guān)食品資源提供了新的思路。

在我國乃至世界范圍內(nèi)，食用花卉以其良好的營養(yǎng)價值和獨特的色澤、風(fēng)味，自古應(yīng)用于居民膳食，其中牡丹花（Paeonia suffruticosaAndr.）具有很高的營養(yǎng)價值，富含類黃酮、多酚類物質(zhì)，其健康促進作用逐步被現(xiàn)代研究所證實，廣泛應(yīng)用于食品、飲料及化工行業(yè)[8,9]。芍藥（Paeonia lactifloraPall.）作為一種中藥材，與牡丹為同科同屬植物，在花型和營養(yǎng)成分上具有極大的相似性。本文旨在考察食用牡丹花對RAS系統(tǒng)中兩種關(guān)鍵酶腎素和ACE的抑制作用，選取典型的花色品種，并與芍藥進行比較；同時由于血管的氧化損傷與高血壓的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]，進一步考察了樣品的抗氧化活性，并分析多酚、黃酮類物質(zhì)的含量與其功能活性的相關(guān)性，為探討新型血壓調(diào)控因子提供新思路，且為進一步健全食用牡丹花的功能價值體系、實現(xiàn)其高值化利用及促進相關(guān)食用花卉食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供更豐富的基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與取樣

所試牡丹與芍藥為市售花產(chǎn)品，分別為武皇牌牡丹全花（白色，白1）、山東菏澤白牡丹花瓣（白色，白2）、山東菏澤紅牡丹花瓣（紅色，紅1）、河南洛陽紅牡丹花球（紅色，紅2）、安徽亳州芍藥花瓣（紅色，紅芍1）、安徽亳州芍藥花球（紅色，紅芍2）。

1.2 試劑及主要儀器設(shè)備

人重組腎素抑制劑篩選分析試劑盒購自美國Cayman公司，水溶性維生素E（Trolox）購自美國MCE公司，ACE酶（0.1 U，源于兔肺）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、鄰苯二甲醛（OPA）、沒食子酸、兒茶素、DPPH自由基和ABTS自由基購自美國Sigma公司，其它試劑均為分析純。

實驗使用的儀器主要有Flx-800熒光酶標儀，美國BioTek公司；Model 1680酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品水提物的制備

取干燥后的四種牡丹花瓣、兩種芍藥花瓣樣品研磨后的粉末各1 g，溶于10 mL水中，震蕩1 min，超聲5 min，28 ℃搖床振蕩提取90 min后，離心，取上清液過0.45 μm濾膜，制得樣品水提液，標記為100 mg/mL，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 腎素抑制活性的測定

腎素抑制活性的評價使用人重組腎素抑制劑篩選試劑盒。具體步驟為，在96孔酶標板小孔中依次加入：（1）空白：20 μL底物，160 μL緩沖液，10 μL蒸餾水；（2）對照：20 μL底物，160 μL緩沖液，10 μL蒸餾水；（3）樣品：20 μL底物，160 μL緩沖液，10 μL樣品溶液。然后向空白對照和樣品孔中加入10 μL腎素酶液啟動反應(yīng)，37 ℃靜置15 min。

該試劑盒中的底物是一種合成熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽，其一端與熒光團連接，另一端與非熒光發(fā)色團連接，被腎素裂解后，獲得的產(chǎn)物高度熒光，可通過記錄其熒光吸收強度（IF）來計算樣品的腎素抑制率。測定條件：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長528 nm。每個樣品重復(fù)三次進行測定。腎素抑制活性計算公式如下：

1.3.3 ACE抑制活性的測定

香味成分是決定酒樣的香氣、口感和風(fēng)格的關(guān)鍵因素[6]。黑米酒中香氣成分GC-MS分析的總離子色譜圖見圖1，分析結(jié)果見表1。

對ACE抑制活性的測定參照Li等[10]的方法。將樣品水提物適當稀釋，以96孔酶標板作為反應(yīng)容器。將15 μL樣液（對照反應(yīng)液中以蒸餾水代替）與30 μL 4.66 mmol/L的HHL溶液（溶于0.6 mol/L NaCl-0.4 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 8.5）混合，然后加入30 μL 12.5 mU/mL的ACE酶液（樣品反應(yīng)液和對照反應(yīng)液的空白以蒸餾水代替），混勻后于37 ℃反應(yīng)1 h，加入120 μL 1.2 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)，接著加入30 μL 2%的OPA溶液（溶于甲醇），混勻，室溫下靜置20 min后加入30 μL 6 mol/L的HCl溶液終止衍生反應(yīng)。將反應(yīng)液稀釋30倍后測定熒光吸收強度，條件如下：激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長455 nm。樣液的ACE抑制率計算公式為：

ACE抑制率/%=(1-I1/I2)×100% （2）

式中：I1表示樣品反應(yīng)液即存在ACE抑制劑時的熒光吸收強度；I2表示對照反應(yīng)液即無ACE抑制劑時的熒光吸收強度。抑制率為50%時抑制劑的濃度為半抑制濃度（IC50）。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

取5 μL樣品水提物和250 μL 0.08 mg/mL DPPH反應(yīng)液混合，用相同體積的乙醇作空白對照。暗處反應(yīng)30 min后測定在波長517 nm處的紫外吸光度，計算清除率，以Trolox為對照。樣品的DPPH自由基清除能力值表示為每克樣品（干質(zhì)量）所具有的抗氧化能力相當于多少毫克Trolox，即mg TE/g DW。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的測定

取25 μL樣品水提物（濃度稀釋到5 mg/mL），加入ABTS反應(yīng)溶液（5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液避光反應(yīng)12 h，用時用乙醇稀釋至波長732 nm處吸光度為0.70±0.02）2 mL，反應(yīng)30 min后，測定波長732 nm處的吸光度，計算清除率，以Trolox為對照。最后樣品的ABTS自由基清除能力值表示為每克樣品（干質(zhì)量）所具有的抗氧化能力相當于多少毫克Trolox，即mg TE/g DW。

1.3.6 FRAP還原能力的測定

TPTZ工作液的制備：25 mL 0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl溶解）和2.5 mL 10 mmol/L FeCl3·H2O溶液混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

取10 μL樣品水提物（濃度稀釋到5 mg/mL），加入1 mL蒸餾水和1.8 mL TPTZ工作液，混勻后37 ℃保溫10 min，在593 nm處測定紫外吸光值，以Trolox為對照。樣品的鐵離子還原能力值表示為每克樣品（干質(zhì)量）所具有的還原能力相當于多少毫克Trolox，即為mg TE/g DW。

1.3.7 總酚（TPC）含量的測定

采用福林-肖卡法，以96孔酶標板作為反應(yīng)容器，依次加入100 μL樣品水提物、100 μL Folin-Ciocalteu顯色劑和100 μL 10% Na2CO3溶液，37 ℃保溫1 h后測定750 nm處的吸光值，以沒食子酸為標準品。將結(jié)果換算為每克樣品（干質(zhì)量）中所含的多酚相當于沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/g DW）。

1.3.8 總黃酮（TF）含量的測定

采用NaNO2-AlCl3法，以96孔酶標板作為反應(yīng)容器，依次加入20 μL樣品水提物、125 μL蒸餾水和75 μL 5% NaNO2溶液，反應(yīng)6 min后再加入15 μL 10%AlCl3·6H2O溶液。室溫靜置5 min后加入50 μL NaOH溶液，最后在510 nm處測定紫外吸光度，以兒茶素為標準品，將結(jié)果換算為每克樣品（干質(zhì)量）中所含的總黃酮相當于兒茶素的毫克數(shù)（mg CE/g DW）。

1.3.9 統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)三次，結(jié)果用平均值表示，采用Origin軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進行方差分析（p＜0.05）及相關(guān)性分析（p＜0.01）。

2 結(jié)果與討論

2.1 腎素和ACE抑制作用分析

圖1 不同樣品水提物的腎素和ACE抑制作用Fig.1 Inhibition on renin and ACE by different aqueous sample extracts

所試樣品水提物的腎素及ACE抑制作用如圖1所示。在樣品水提物濃度為0.27 mg/mL的條件下，紅色的牡丹和芍藥花水提物均表現(xiàn)出強腎素和ACE抑制作用，其中腎素抑制率范圍為67%～72%，ACE抑制率范圍為56%～84%。相比之下，兩種白色的牡丹花水提物表現(xiàn)出很弱的腎素和ACE抑制作用。對于高活性的洛陽紅牡丹花瓣（紅2）和亳州芍藥花瓣（紅芍2）水提物，其濃度-活性曲線如圖2所示。

圖2 樣品水提物在不同濃度下的腎素和ACE抑制作用Fig.2 Inhibition on renin and ACE by aqueous sample extracts at different concentrations

樣品紅2和紅芍2水提物抑制腎素的IC50值均為0.08 mg/mL，抑制ACE的IC50值分別為0.23和0.25 mg/mL。可以看出，所試紅色牡丹和芍藥雖為兩個不同的原料品種，但其水提物都具有很強的腎素和ACE抑制活性，且無明顯差異。就所試牡丹花而言，白色和紅色樣品水提物的腎素和ACE抑制活性差異顯著，說明牡丹的花色及相應(yīng)化學(xué)組成的差異顯著影響樣品的潛在血壓調(diào)控作用。本研究首次指出了紅色牡丹和芍藥花水提物具有優(yōu)良的腎素和ACE抑制活性,相比于其它已報道的天然腎素和ACE抑制劑，如豆科植物（除大豆花生外）提取液抑制腎素活性的IC50為0.27～1.75 mg/mL[11]；綠茶提取液抑制腎素活性的IC50為0.48 mg/mL[12]；可口革囊星蟲蛋白酶水解物不同組分抑制ACE活性的IC50值為0.43～1.41 mg/mL[13]；綠色大豆蛋白酶解物抑制ACE活性的IC50值為0.14～1.14 mg/mL[14]，本研究所試紅色牡丹花水提物具有強的腎素和ACE雙重抑制活性，可被視為天然腎素和ACE抑制活性物質(zhì)的重要來源。

2.2 抗氧化能力分析

圖3 不同樣品水提物的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant capacity of different aqueous sample extracts

樣品水提物的ABTS和DPPH自由基清除能力及鐵離子還原能力如圖3所示。紅色的牡丹和芍藥花水提物均顯示出很強的抗氧化能力；而白色牡丹花水提物的抗氧化活性很弱。紅色牡丹和芍藥樣品水提物的抗氧化能力無明顯差異，其清除ABTS自由基能力為115.89～121.75 mg TE/g DW，清除DPPH自由基能力為192.67～200.46 mg TE/g DW，鐵離子還原能力為119.86～208.94 mg TE/g DW，紅色的牡丹和芍藥花水提物的抗氧化能力是白色牡丹花水提物抗氧化能力的5倍以上。史國安[15]等研究表明，紅色牡丹品種“洛陽紅”具有較好的氧自由基清除能力，對O2-的清除能力達85.1%～92.8%，對OH自由基的清除能力達52.1%～89.8%。綜合來看，牡丹花具有較高的抗氧化能力，尤其深色系的牡丹品種比淺色系抗氧化能力更強，這與孫澤飛[16]等的研究相一致。

2.3 總酚和總黃酮含量分析

圖4 不同樣品水提物的總酚和總黃酮含量Fig.4 Contents of total phenols and flavonoids in different aqueous sample extracts

樣品水提物的總酚和總黃酮含量如圖4所示，紅色系的牡丹和芍藥花水提物總酚含量都很高，并且顯著高于白色牡丹花水提物，紅色牡丹和芍藥花水提物總酚含量為99.29～122.45 mg GAE/g DW，而白色牡丹花水提物（白1和白2）的總酚含量分別為16.21和23.95 mg GAE/g DW。就總黃酮含量而言，紅色牡丹和芍藥花水提物仍高于白色牡丹花水提物，紅色牡丹和芍藥花水提物總黃酮含量為3.71～7.34 mg CE/g DW之間，而樣品白1和白2水提物的總黃酮含量分別為2.06和1.02 mg CE/g DW。

牡丹花和芍藥花屬多酚含量較高植物，其酚類物質(zhì)主要為黃酮類化合物。多酚類化合物一直作為抗氧化活性物質(zhì)被廣泛研究，值得注意的是，多酚類化合物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)具有腎素和ACE抑制活性，如紅茶和烏龍茶中的茶多酚[12]、玫瑰花蕾中的黃酮類化合物[17]、苦杏仁葉[18]和獼猴桃[19]中的多酚提取物、大豆中的大豆皂苷[11]等，這些研究表明多酚類化合物可被視為一類重要的腎素和ACE抑制活性物質(zhì)。

2.4 相關(guān)性分析

所試牡丹和芍藥花樣品水提物的活性與總酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析如表1所示?？梢钥闯?，牡丹和芍藥樣品水提物的腎素和ACE抑制活性、抗氧化能力均與總酚含量呈顯著的正相關(guān)（p＜0.01），而與總黃酮含量沒有顯著的相關(guān)性。其中，總酚含量與腎素和ACE抑制作用的相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.91，總酚含量與DPPH、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.99、0.99、0.98。本研究發(fā)現(xiàn)白色牡丹和紅色牡丹及芍藥的腎素與ACE抑制作用及抗氧化活性差異顯著，紅色樣品水提物的活性顯著高于白色牡丹花樣品，其中的多酚類化合物可能對腎素和ACE抑制活性發(fā)揮著重要作用。研究表明多酚類化合物是牡丹花具有抗氧化能力的基礎(chǔ)，同時也使牡丹花具有多種重要的生物活性如抗腫瘤、抗糖尿病、抗流感、抗菌、護胃等[20]。而李想[21]等發(fā)現(xiàn)類黃酮是影響牡丹花色形成的主要色素類型，可推測白色和紅色牡丹的腎素和ACE抑制活性差異亦可能受其類黃酮物質(zhì)影響。

表1 不同樣品水提物的功能活性與總酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between activities and contents of total phenols and flavonoids of different aqueous samples extracts

3 結(jié)論

本研究首次指出了紅色牡丹和芍藥花水提物具有優(yōu)良的腎素和ACE抑制活性（河南洛陽紅牡丹和安徽亳州芍藥花水提物抑制腎素的IC50值均為0.08 mg/mL，抑制ACE的IC50值分別為0.23 mg/mL和0.25 mg/mL），且與白色牡丹花相比，具有很高的ABTS、DPPH自由基清除能力及鐵離子還原能力。同時，不同樣品水提物的腎素和ACE抑制活性及抗氧化能力與多酚含量呈顯著正相關(guān)（p＜0.01）。目前正在對紅色牡丹花水提物中的腎素及ACE抑制活性成分進行純化鑒定及作用機制探討。此外，牡丹花品系豐富，除了常見的紅色和白色花系外，還有黃、粉、紫、墨、綠等不同花系，有必要對不同花系樣品的腎素和ACE抑制活性進行更深入的研究，為新型血壓調(diào)控功能因子的挖掘及牡丹花的高值化利用及食用花卉相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論支撐。