梔子果油的生物活性成分及抗氧化活性評價

朱穎潔，楊亞潔，李群和，鄒盈，羅自生,3,4

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）（2.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江溫州 325006）（3.浙江大學(xué)寧波研究院，浙江寧波 315100）（4.浙江大學(xué)馥莉食品研究院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品采后處理重點實驗室，智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州 310058）

梔子果實是一種重要的藥食兩用資源，現(xiàn)代藥理研究表明，梔子果因富含黃酮類、類胡蘿卜素、萜類等生物活性物質(zhì)[1-3]，具有抗炎、保肝、抗抑郁等功效。西紅花酸及其衍生物是梔子果中主要的水溶性類胡蘿卜素，其主鏈上的異戊二烯共軛雙鍵系統(tǒng)是發(fā)色基團，使梔子果呈現(xiàn)出黃色至深紅色，可在食品工業(yè)中用作天然著色劑，代替人工合成著色劑[4,5]。此外，梔子果的含油量較高，大約為干果重量的15%，并且精煉后的梔子油可以與橄欖油媲美，其酸價和抗氧化值都比較低[6]，作為一種高端食用油具有廣闊的市場。

在工業(yè)上通常采用己烷等傳統(tǒng)有機溶劑從油料作物中提取油，但在生產(chǎn)過程中有可能存在溶劑殘留，這將導(dǎo)致食品安全和公共衛(wèi)生問題[7]，因此，尋找一個更加綠色安全并且高效食用油提取溶劑是當(dāng)前行業(yè)研究者們共同關(guān)注的問題。Natalia Castejón等[7]用正己烷、乙酸乙酯和乙醇作為萃取溶劑從車前草種子中提取油，結(jié)果表明在超聲輔助提油過程中，55 ℃、30 min時乙醇獲得了最佳油得率，其次是正己烷和乙酸乙酯。此外，還有一些研究采取D-檸檬烯、a-蒎烯、對傘花烴[8]、植物油[9]等新型溶劑提取植物油，由于這些溶劑溶解性質(zhì)和正己烷相近，因此也獲得了較高的得油率。但這些提取物需經(jīng)過加水或乙醇進行二元或者三元共沸，才能將提取溶劑的沸點降低到100 ℃以下，從而達到提取溶劑與提取的粗油分離的目的[8]，這不僅會破壞粗油中的生物活性物質(zhì)，而且由于成本過高，難以在生產(chǎn)上應(yīng)用。

研究表明，梔子果提取物的有效化學(xué)成分表現(xiàn)出中-高極性，適于水溶液、95%～70%乙醇溶液提取[10]。乙醇是一種常見的低成本的“綠色生物溶劑”，其對環(huán)境無污染，沸點比正己烷低，是一種經(jīng)濟安全的溶劑，已被研究作為提取食用油的替代溶劑[11,12]。由于乙醇極性易于提取微量的營養(yǎng)化合物如生育酚[13]，可提高油的品質(zhì)。然而，乙醇提取梔子果油的同時也會提取出一些不溶性化合物如磷脂、色素和糖，這些物質(zhì)需要從油中分離。Sánchez R.J等[14]通過加入正己烷分餾進而達到分離的目的，但仍會存在正己烷殘留問題。

超聲輔助提取技術(shù)(UAE)近年來已被作為一種高效廉價的手段來提取生物活性化合物和植物油脂[15-17]。超聲優(yōu)化提取效率的機制在于超聲的機械效應(yīng)和空化作用，可以促進提取物細胞破裂，增強待提取物質(zhì)跨細胞膜傳送速率[18]。因此，本研究通過評估超聲輔助綠色溶劑（乙醇、乙酸乙酯）從梔子果中提取粗油的抗氧化能力，并與使用超聲輔助正己烷提取梔子果油的抗氧化能力進行比較，旨在分析各提取物中抗氧化活性物質(zhì)的成分及含量，以確定主要的抗氧化活性物質(zhì)，為梔子果油高值綠色提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

梔子干果，購于溫州瑞安市。

Supelco 37 Component FAME混合物、甲醇（HPLC級，純度≥99.7%）、正己烷（HPLC級，純度≥99.8%）、乙腈（LC-MS級），均購于阿拉丁試劑公司。D-α-生育酚（純度≥97%）、DPPH（純度≥97%）、ABTS（純度≥98%），阿拉丁試劑公司。D-β-生育酚（純度≥98%），上海源葉生物試劑公司。D-δ-生育酚（純度≥98%），北京索萊寶科技有限公司。沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香草醛，、表兒茶素、對羥基肉桂酸、丁香醛、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、肉桂酸、HPLC≥97%，一飛生物試劑公司；5α-膽甾烷、麥角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、HPLC≥98%，阿拉丁試劑公司；CrocinⅠ（CAS：42553-65-1）、CrocinⅡ（CAS：55750-84-0）、Crocetin（CAS：27876-94-4）、HPLC≥98%，上海源葉生物試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲均質(zhì)機，寧波新芝生物；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Eppendorf Centrifuge 5430R離心機，艾本德上海國際貿(mào)易公司；MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；METTLER TOLEDO XS105、XPR10/AC分析天平（瑞士METTLER TOLEDO），干式氮吹儀UGC-24M（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。Agilent-1100（美國）液相色譜儀（High-performance liquid chromatography，HPLC），配備熒光檢測器。Acquity TM ultra型超高效液相色譜儀（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）（美國Waters），三重四極桿-高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-Triple-TOF/MS）（美國AB SCIEX）。GC2014（日本島津）氣相色譜儀（Gas chromatography，GC），配 有 自 動 進 樣 器。Agilent7890b-7000c（美國）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS），配有自動進樣器，MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件，NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.3 試驗方法

1.3.1 正己烷、乙酸乙酯、乙醇超聲提取梔子油

稱取15 g梔子粉，記為m干物質(zhì)，量取120 mL有機溶劑，以固液比1:8進行提取；設(shè)置超聲溫度40 ℃，時間20 min，超聲功率200 W；之后4 ℃，8000 r/min，15 min離心分離取上清放入旋蒸儀中，-0.1 MPa，40 ℃蒸到恒重；得到的粗油在4 ℃冰箱靜置過夜，冬化沉淀油渣，4000 r/min，5 min離心棄去油渣，記錄下液體質(zhì)量m油；計算得油率：

1.3.2 自由基清除能力

DPPH：將400 μL的DPPH儲備液加入400 μL樣品，搖勻避光靜置30 min，于517 nm處測得其吸光值記為Ai，做3次平行實驗。將400 μL無水乙醇加入400 μL樣品，搖勻避光靜置30 min，于517 nm處測得其吸光值記為Aj。最后400 μL無水乙醇加入400 μL DPPH儲備液，搖勻避光靜置30 min，于517 nm處測得其吸光值記為Ac。按下式計算待測樣品對DPPH自由基的清除率(K)：

ABTS：將600 μL的ABTS工作液加入200 μL樣品，搖勻避光在30 ℃下靜置5 min，于734 nm處測得其吸光值記為Ai，做3次平行實驗。將600 μL的無水乙醇加入200 μL樣品，搖勻避光在30 ℃下靜置5 min，于734 nm處測得其吸光值記為Aj。最后600 μL ABTS工作液加入200 μL無水乙醇，搖勻避光在30 ℃下靜置5 min，于734 nm處測得其吸光值記為Ac。按下式計算待測樣品對ABTS自由基的清除率(K)：

IC50值計算：將清除率K對濃度梯度的曲線用Prism 8.0軟件進行擬合計算出IC50。

1.3.3 脂肪酸圖譜

稱取樣品0.0600 g，放入10 mL離心管中，加4 mL正己烷溶解；加入2 mol/L的氫氧化鉀/甲醇溶液0.4 mL，渦旋振蕩30 s，靜置至澄清，向溶液中加入1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液于氣相進樣瓶中供氣相色譜分析。GC條件：色譜柱：DB-23毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣（99.999% N2），柱流速1 mL/min；進樣口：進樣量1 μL，氣化室溫度250 ℃，分流進樣，分流比10:1；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持2 min，以10 ℃/min到160 ℃，保持4 min，再以10 ℃/min到 210 ℃，保持5 min，最后以10 ℃/min到240 ℃，保持10 min；檢測器溫度300 ℃。

1.3.4 酚酸含量

取0.5 g油樣，1.5 mL、1.5%甲酸/甲醇溶液（V/V）提取三次，每次渦旋2 min，合并提取液8200 r/min離心6 min，取甲醇層。氮吹至干后復(fù)溶于500 μL甲醇，上清C18（Agilent ZORBAX-SB，250 mm×4.6 mm，5 μm）-HPLC測定。流動相由0.02%磷酸（V/V，溶液A）和乙腈（溶液B）組成，流速為1.0 mL/min，梯度程序為0～40 min，溶液B：2%～25%；40～45 min，溶液B：25%～35%；和45～50 min，溶液B：35%～50%。注射量為10 μL，柱溫為29 ℃，掃描波長設(shè)置為254 nm～370 nm。分析前用0.22 μm濾膜過濾樣品。各化合物的鑒別和定量分別根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)化合物保留時間和線性方程進行計算。

1.3.5 西紅花素及其衍生物含量

取0.5 g油樣，3 mL、50%甲醇（V/V）提取兩次，每次渦旋2 min，合并提取液8200 r/min離心6 min，取甲醇層。氮吹至干后復(fù)溶于600 μL或5 mL（僅ECP一個樣品）甲醇，上清C18（AQ，250 mm×4.6 mm，5 μm）-HPLC測定。流動相由0.02%磷酸（V/V，溶液A）和甲醇（溶液B）組成，流速為1.0 mL/min，梯度程序為0～4 min，溶液B：0～10%；4～50 min，溶液B：10%～90%；51～55 min，溶液B：90%～10%。注射量為10 μL，柱溫為40 ℃，掃描波長設(shè)置為440 nm。分析前用0.22 μm濾膜過濾樣品。各化合物的鑒別和定量分別根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)化合物保留時間和線性方程進行。質(zhì)譜采用Triple-TOF 5600+飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀，負(fù)離子掃描模式；掃描范圍：m/z100～1500；霧化氣(GS1)：50 psi；干燥氣(GS2)：50 psi；氣簾氣(CUR)：35 psi；離子源溫度(TEM)：550 ℃；離子源電壓(IS)：-4500 V；一級掃描：去簇電壓(DP)：80 V；聚焦電壓(CE)：10 V；二級掃描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，CID能量為-20、-40和-60 V，進樣前，用CDS泵做質(zhì)量軸校正，使質(zhì)量軸誤差小于2×10-6。

1.3.6 生育酚含量

將梔子果油樣品（50 mg）溶于2 mL甲醇，10000 r/min離心10 min取上清，通過C18-HPLC/FLD（Waters，150×4.6 mm，3 μm）上樣分析，設(shè)置為295 nm（Ex）和335 nm（Em）。流動相為甲醇/水（93:7，V/V），流速為1 mL/min，柱溫40 ℃。運行時間為13 min。樣品進樣量為20 μL。各化合物的鑒別和定量分別根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)化合物保留時間和線性方程進行計算。

1.3.7 甾醇含量

以5α-膽甾烷（50 μg）為內(nèi)標(biāo)，用1 mol/L氫氧化鉀/甲醇溶液在25 ℃下將20 mg梔子果油樣品皂化18 h。皂化后，加入5 mL二氯甲烷和5 mL水，搖勻混合物，用二氯甲烷提取植物甾醇。然后將水除去，并用水沖洗有機相三次，直到溶液澄清。最后氮吹蒸發(fā)有機相。向棕色瓶中加入100 μL BSTFA+TMCS（99:1，V/V）進行衍生化，80 ℃甲硅烷基化反應(yīng)40 min后溶解于1 mL正己烷中，GC-MS上樣分析。色譜條件：色譜柱HP-5（30 m×0.25 mm×0.32 μm）；載氣（99.99% He）；流速1.0 mL/min；進樣口溫度300 ℃；不設(shè)置分流比；進樣量1 μL；起始溫度100 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升至200 ℃，再以1.5 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度300 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z50～600 u。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析，采用Origin 9.1軟件、Prism 8.0、RStudio 2019作圖，差異顯著性水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 得油率(%)

在提油過程中，通過4 ℃靜置沉淀、離心后，得到比較穩(wěn)定的粗油。乙醇提取物分成了油相和膠體相兩層。由圖1可知，用超聲輔助正己烷提取的梔子油得率最高為14.86%，其次是乙酸乙酯（13.84%）和乙醇油相（13.26%），乙醇膠體相得率最低，為9.68%。分析表明，乙酸乙酯作為新型提油溶劑與傳統(tǒng)的工業(yè)溶劑正己烷在得油率上并無顯著差異（p＜0.05）；乙醇油相的得率略低于正己烷，但與乙酸乙酯沒有顯著差異（p＜0.05）。Phiwe Charles Jiyane等[19]發(fā)現(xiàn)在其他條件一致的情況下，乙酸乙酯提取20 min可得最大得油率，而正己烷提取僅需6 min且得率更高。有研究表明超聲輔助提取可以縮短提取時間，提高油脂得率[7,20]，因此該實驗在沒有超聲輔助時與本實驗結(jié)果有所差異。乙醇已被用于咖啡油[21]、芝麻油[22]、蘿卜種子油[23]的提取中。在提取過程中，使用乙醇能減少溶劑使用量，同時增加提取速率，因此乙醇提油被當(dāng)作一種新的綠色油脂提取技術(shù)。本文用乙醇提梔子果油也有副產(chǎn)物產(chǎn)生，而這些醇溶性的成分有很高的抗氧化能力，因此需評估這三種溶劑提取物的生物活性成分以及其與抗氧化的相關(guān)性，綜合分析選擇可以代替工業(yè)溶劑的有機溶劑。

圖1 梔子果不同有機溶劑超聲提取物得率Fig.1 Ultrasonic extraction yield of gardenia fruit with different organic solvents

2.2 自由基清除能力

表1 不同有機溶劑超聲提取物IC50值Table 1 The IC50 value of DPPH and ABTS scavenging rate in different extraction

圖2 不同有機溶劑超聲提取物ABTS自由基清除能力(a～c)及DPPH自由基清除能力(d～f)Fig.2 ABTS (a～c) and DPPH (d～f) free radical scavenging capacity of different extraction

與參考化合物槲皮素相比，提取物具有劑量響應(yīng)的ABTS自由基清除活性，在最高測試濃度（20 mg/mL，圖2a～c）下觀察到最高活性。乙醇提取出的副產(chǎn)物ECP的ABTS自由基清除活性（IC50=0.40 mg/mL，表1）極顯著（p＜0.01）高于粗油的ABTS清除活性（IC50=7.60～9.39 mg/mL）。

與參考化合物槲皮素和抗壞血酸相比，提取物具有劑量響應(yīng)的DPPH自由基清除活性，在最高測試濃度（20 mg/mL，圖2d～f）下觀察到最高活性。乙醇提取出的副產(chǎn)物ECP的DPPH自由基清除活性（IC50=0.61 mg/mL，表1）極顯著（p＜0.01）高于粗油的DPPH清除活性（IC50=8.38～10.31 mg/mL）。

Lee等人[24]研究表明梔子果乙醇提取物顯示出極佳的DPPH自由基清除活性（IC50=38.46 μg/mL），其結(jié)果遠小于本實驗，可能是因為該實驗梔子果乙醇提取時間長達24 h且提取物經(jīng)過了減壓蒸發(fā)濃縮。Savic等人用不同有機溶劑提取李子籽油[25]，DPPH自由基清除實驗IC50值顯示抗氧化活性降低順序為：氯仿:甲醇(2:1V/V)≈丙酮＞正己烷＞正庚烷＞乙酸乙酯，得出溶劑極性越大，提取出油的抗氧化活性越高的結(jié)論。本實驗乙醇膠體相顯示出極低的IC50值可能是由于乙醇的極性較高，且是總酚、黃酮類、縮合單寧或原花色素等抗氧化活性物質(zhì)的良好溶劑[26]。此外，粗油中不飽和脂肪酸組成、甾醇含量、生育酚含量是常見的影響油本身抗氧化能力強弱的因素[9]。兩個自由基清除實驗結(jié)果表明，乙醇膠體相中可能存在一些醇溶性的抗氧化活性成分。

2.3 活性成分含量

2.3.1 脂肪酸圖譜

由表2可知，3種有機溶劑提取的脂肪酸組成成分基本相同，其鏈長從C-16至C-23，以不飽和脂肪酸順式亞油酸（18:2，41.58%～42.90%）、油酸（18:1，34.15%～35.95%）為主，而飽和脂肪酸中棕櫚酸（16:0）是主要成分。李昊陽等人[6]用正己烷、亞臨界和超臨界法萃取梔子果油，檢測出6種脂肪酸，主要是油酸和亞油酸，其中不飽和脂肪酸含量為76.04%～78.00%，本文實驗中還檢測出花生酸、山崳酸等脂肪酸組成成分，且不飽和脂肪酸含量為80.93%～81.20%，這可能表明超聲輔助溶劑提取油脂方法更易于油脂溶出，提高提取效率。不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例（P/S）是評估油質(zhì)量最重要的指標(biāo)之一，P/S越大，油的質(zhì)量越好[27]。據(jù)表2顯示，乙醇提取的粗油P/S為4.31，而正己烷僅為4.24，說明乙醇提油油質(zhì)顯著（p＜0.05）優(yōu)于正己烷，其原因可能是不同的萃取溶劑對脂肪酸與甘油酯的選擇性不同。乙醇和乙酸乙酯提取物中存在γ-亞麻酸（1.50%），乙醇的副產(chǎn)物中還檢出了反式亞油酸（1.14%，如圖3d左側(cè)箭頭所示）。亞油酸和亞麻酸是人和動物營養(yǎng)中必需的脂肪酸，可以降血脂、防血栓，同時它們又是體內(nèi)合成ARA、DHA、EPA的前體物質(zhì)[28-30]，對于人體健康十分有益。因此，相比于正己烷和乙酸乙酯，乙醇是一種提取梔子果油的理想溶劑。

2.3.2 酚酸含量

由表3可知，正己烷提取的粗油中，只有對羥基肉桂酸和芥子酸有響應(yīng)值，其濃度分別為0.46 μg/g和2.80 μg/g，表明用正己烷提取油是不利于酚酸從梔子果中分離的。在被精確定量的十種酚酸中，阿魏酸和丁香酸在乙醇提取的粗油中有較高的響應(yīng)值，分別為248.79 μg/g和207.96 μg/g。丁香酸易揮發(fā)且有獨特芳香氣味，因此其可能是導(dǎo)致這兩種粗油與正己烷提取的粗油在嗅覺上存在差異的主要原因。有研究表明梔子花的主要揮發(fā)性化學(xué)芳香成分為法尼烯，z-3-己烯酸酯，z-3-己烯苯甲酸酯，吲哚[31]，但乙醇提取梔子果油的芳香氣味可能主要來源于丁香酸。乙酸乙酯有很強的刺激性氣味，用乙酸乙酯提取梔子果油會在嗅覺上產(chǎn)生不愉悅感。在總酚含量上，乙醇提取副產(chǎn)物（1174.32 μg/g）顯著（p＜0.05）高于乙酸乙酯（124.59μg/g）和正己烷（3.25 μg/g），由于離心分離，酚酸大都集聚到乙醇膠體相中，這十分符合酚酸醇溶性的特征。Trishna Debnath等人研究梔子果提取物中的抗氧化活性，得出抗氧化劑活性與總酚和類黃酮含量相關(guān)[32]，Biglari等人[33]的研究亦證實，梔子果的醇提物和水提物中酚類和類黃酮含量均比一些常見的新鮮或干燥的水果（比如Phoenix dactylifera）強，可作為天然抗氧化劑和膳食補充劑。

圖3 不同有機溶劑超聲提取梔子果油氣相色譜圖Fig.3 Fatty acids GC profiles of different extraction

表2 不同有機溶劑超聲提取物脂肪酸圖譜Table 2 Fatty acids profiles of different extraction

表3 不同有機溶劑超聲提取物酚酸組成和含量Table 3 Phenolic acid profile in different extraction

2.3.3 西紅花酸及其衍生物含量

以Crocetin，CrocinⅠ，CrocinⅡ作為液相外標(biāo)，定量分析粗油及副產(chǎn)物西紅花素及其衍生物含量，發(fā)現(xiàn)乙醇膠體相中有多個出峰并不能被合理解釋。UPLC-Triple-TOF/MS質(zhì)譜分析結(jié)果顯示保留時間為12.0713 min（對應(yīng)液相9.646 min），16.1819 min（對應(yīng)液相13.54～13.55 min），17.3975 min（對應(yīng)液相14.53 min），24.0474 min（對應(yīng)液相21.482～21.486 min）的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z651.26，[M+CH3COOH]-為m/z711.32。對其進行碰撞誘導(dǎo)解離，在二級質(zhì)譜圖中，可觀測系列脫糖碎片峰m/z489[M-H-Glc]-、m/z327[M-H-Glc-Glc]-等碎片離子，該化合物的母核準(zhǔn)分子離子為m/z327，結(jié)構(gòu)中存在2個葡萄糖。推測該化合物可能為母核是類似西紅花酸的結(jié)構(gòu)，且存在順反異構(gòu)，單側(cè)帶雙糖，或者雙側(cè)帶單糖。

保留時間為18.6372 min（對應(yīng)液相15.96～15.961 min）的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z813.31，[M+Cl]-為m/z849.29。對其進行碰撞誘導(dǎo)解離，在二級質(zhì)譜圖中，可觀測系列脫糖碎片峰m/z651[M-H-Glc]-、m/z489[M-H-Glc-Glc]-、m/z327[M-H-Glc-Glc-Glc]-等碎片離子，該化合物的母核準(zhǔn)分子離子為m/z327，推測該化合物可能為母核是類似西紅花酸的結(jié)構(gòu)，并在雙側(cè)一共攜帶3個葡萄糖分子，為CrocinⅡ的同分異構(gòu)體。

保留時間為20.5137 min（對應(yīng)液相17.749～17.751 min）的準(zhǔn)分子離子[M-H]-為m/z489.21，[M+COOH]-為m/z535.22，[M+COONa]-為m/z558.20。對其進行碰撞誘導(dǎo)解離，在二級質(zhì)譜圖中，可觀測脫糖碎片峰m/z327[M-H-Glc]-等碎片離子，推測該化合物可能為母核是類似西紅花酸的結(jié)構(gòu)，并在一側(cè)攜帶1個葡萄糖分子的西紅花酸衍生物。

在乙酸乙酯的粗油提取物中僅檢測到少量西紅花酸（5.39±0.40 μg/g），但在乙醇膠體相中其含量非常豐富（p＜0.01），總量達到了31065.57 μg/g，遠大于標(biāo)定的十四種酚酸的總含量，因而大量存在于乙醇膠體相中的醇溶性抗氧化活性物質(zhì)可能為西紅花酸及其衍生物。西紅花苷是紅花酸與不同糖結(jié)合而成的一系列酯苷，由于雙側(cè)帶糖多羥基結(jié)構(gòu)而易溶于水。在乙醇提油過程中由于加熱以及相似相溶原理被大量溶出，后因乙醇蒸發(fā)且粗油冷卻形成膠體相析出。Yang等人用UPLC-Q/TOF-MS色譜分析結(jié)合HRESIMS、UV/vis、一維二維氫譜，鑒定出包括B-J(1-9)和13-cis-crocetin-8′-O-β-D-gentiobioside十種新的西紅花酸及其衍生物，與本實驗結(jié)果十分類似[34]。

圖4 乙醇膠體相在吸收波長為440 nm通道下UPLC-Triple-TOF/MS色譜圖Fig 4 The UPLC-Triple-TOF/MS graph of ECP sample in A440 nm channel

表4 不同有機溶劑超聲提取物西紅花酸及其衍生物含量Table 4 Crocetin and its derivative in different extraction

表5 乙醇膠體相中的西紅花酸衍生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 5 Mass spectrometric data of main crocetin derivative in ECP

表6 不同有機溶劑超聲提取物生育酚含量Table 6 Tocopherol profiles of different extraction

表7 不同有機溶劑超聲提取物甾醇含量Table 7 Phytosterol profile of different extraction

2.3.4 生育酚含量

圖5 生育酚標(biāo)品和梔子果提取物在激發(fā)波長為295 nm，吸收波長為330 nm時液相色譜圖Fig.5 The HPLC (FLD) graph of 3 standard tocopherol samples and Gardenia fruit extractat an excitation wavelength of 295 nm and emission wavelength of 330 nm

由表6不難發(fā)現(xiàn)，乙醇提取的粗油中總生育酚含量為1.62 μg/mg，顯著高于（p＜0.05）乙酸乙酯（1.42μg/mg）和正己烷（1.27 μg/mg）。其中，α-生育酚是梔子果油的主要成分（0.76～0.81 μg/mg），占總生育酚的50%以上。Imsanguan[35]等人研究表明乙醇和己烷均不能從米糠中萃取α-生育酚，這是因為米糠中的α-生育酚為基質(zhì)形式，低壓（即大氣壓）下的提取不足以消除蛋白質(zhì)、不溶于水的碳水化合物等其他分子的干擾。本實驗可能是由于用超聲輔助溶劑提取，促進了梔子果粉末細胞破裂，增強α-生育酚跨細胞膜傳送速率，因而在常壓下萃取出了α-生育酚。在乙醇提取的粗油以及副產(chǎn)物中，γ-生育酚的含量（0.26～0.30μg/mg）顯著高于（p＜0.05）乙酸乙酯和正己烷提取的粗油中的含量，這些可能都由于生育酚有較長的側(cè)鏈，乙醇對其的萃取能力高于正己烷和乙酸乙酯。近期研究表明[36]，γ-生育酚可能是親脂性親電試劑更有效的捕集劑，對人體健康的影響可能比α-生育酚更為重要。因此，乙醇提取梔子果油可能具有更高營養(yǎng)價值。

2.3.5 甾醇含量

圖6 4種植物甾醇標(biāo)品氣相質(zhì)譜圖Fig.6 The GC-MS graph of 4 standard phytosterol samples

GC-MS定量結(jié)果表明不同有機溶劑提取物中存在9種甾醇，按出峰順序分別為谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、真菌甾醇、鈍葉醇、β-谷甾醇、異巖藻酯醇、環(huán)烷醇、環(huán)烯醇（表7）。β-谷甾醇是梔子果油中最豐富的甾醇，其次是菜油甾醇，環(huán)烯醇和豆甾醇。其中，環(huán)烯醇可作為一種補虛通乳，排膿解毒的藥物，在一般的粗油品中較為少見[37]，因此其可能成為梔子果油的特色功能成分。乙醇提取粗油中總甾醇含量為22.63μg/mg，顯著（p＜0.05）高于乙酸乙酯提取油（17.50μg/mg），但與正己烷提取油并無顯著（p＜0.05）差異。此外，乙醇提取粗油中9種甾醇含量均為最高（除了環(huán)烷醇未檢出），表明乙醇比正己烷、乙酸乙酯更易于提取植物甾醇。

2.4 梔子果油提取物中活性成分含量與抗氧化活性雙變量相關(guān)性分析

圖7 梔子果油提取物中活性成分含量與抗氧化活性雙變量相關(guān)性分析R圖Fig.7 The correlation analysis of active components in gardenia fruit oil extract and its antioxidant activity by bivariate R chart

Pearson模型適用于分析兩連續(xù)數(shù)值型變量之間的線性相關(guān)關(guān)系，因此，利用SPSS 20軟件對不同梔子果油提取物中西紅花酸及其衍生物、植物甾醇、生育酚、酚酸含量、不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例（P/S）與抗氧化活性（DPPH·、ABTS+·清除能力，以IC50值表示）進行雙變量相關(guān)性分析，結(jié)果如圖7所示。DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的IC50值呈極顯著相關(guān)（p＜0.01），可能是由于DPPH·和ABTS+·兩種抗氧化檢測方法都是基于單電子轉(zhuǎn)移機制，因此測定結(jié)果間的相關(guān)性很高。

抗氧化活性物質(zhì)彼此之間的正負(fù)相關(guān)性則體現(xiàn)了活性物質(zhì)溶解性之間的差異。在用乙醇提取梔子果油的ECP相中，溶劑是旋蒸未完全除盡的乙醇和梔子果實中的結(jié)合水，因此易溶于水的西紅花酸及其衍生物、酚酸更易溶解在此相中，而脂溶性的植物甾醇和生育酚更易溶解在油相中。因而在梔子果油提取物中水易溶的活性物質(zhì)與脂易容的活性物質(zhì)彼此間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的IC50值與酚酸含量間均成極顯著負(fù)相關(guān)，與西紅花酸及其衍生物間成顯著負(fù)相關(guān)，說明梔子果油提取物中，酚酸、西紅花酸及其衍生物的含量越高，IC50值越低，自由基清除能力越強。而植物甾醇、生育酚、不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例（P/S）在各種梔子果提取物中，并不是影響DPPH·和ABTS+·自由基清除能力的主要因素。這可能是由于酚酸類物質(zhì)的多羥基結(jié)構(gòu)和西紅花酸及其衍生物共軛雙鍵的作用。

3 結(jié)論

本研究表明不同的提取溶劑會影響梔子果油的得率、脂質(zhì)組成、植物活性物質(zhì)和體外抗氧化能力。梔子果油中的單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）含量極高，尤其是亞油酸和油酸，而乙醇還可將其中的γ-亞麻酸成分提出。不同的有機溶劑對植物化學(xué)物質(zhì)（酚酸、生育酚、植物甾醇和西紅花酸及其衍生物）的含量有顯著影響（p＜0.05），乙醇提取粗油中酚酸，生育酚和植物甾醇含量較高，因此可能具有更高的生物活性。此外，乙醇提取油的副產(chǎn)物膠體相中含有大量的與體外抗氧化活性（DPPH、ABTS）顯著相關(guān)的西紅花酸及其衍生物，這又進一步提高了乙醇提取梔子果油的經(jīng)濟價值。