涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中霉菌的變化

伍金金，呂嘉櫪，胡歆，史朝燁

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）（2.咸陽涇渭茯茶有限公司，陜西西安 710089）

茯磚茶是中國傳統(tǒng)黑茶，起源于陜西涇陽，主要經(jīng)過毛茶選配、篩制拼配、汽蒸渥堆、壓制定型、發(fā)花干燥和成品包裝[1]精制而成。其中發(fā)花干燥是茯磚茶加工過程中的關(guān)鍵技術(shù)，發(fā)花時(shí)期茶磚的溫度、濕度對最終發(fā)花率和成品質(zhì)量有重要影響[2]?！鞍l(fā)花”是一個(gè)復(fù)雜微生物菌群相互作用的過程，“金花菌”是其中的優(yōu)勢菌群[3]。目前對于茯磚茶中“金花菌”的鑒定研究較多，產(chǎn)區(qū)不同，鑒定的結(jié)果也不盡相同[4-7]，其中陜西茯磚茶中“金花菌”優(yōu)勢菌鑒定為冠突曲霉，異名冠突散囊菌[8]。對于發(fā)花過程中的霉菌的變化研究，多集中在湖南、浙江、四川等地區(qū)，陜西茯磚茶發(fā)花過程中霉菌的變化研究較少[9]。例如，趙仁亮[10]從湖南冬夏兩季節(jié)發(fā)花過程中的茯磚茶中共分離出27株真菌，其中有黑曲霉、青霉、冠突曲霉、其他曲霉、芽枝霉、毛霉、鐮刀菌、木霉和酵母菌。胡治遠(yuǎn)[11]等對湖南地區(qū)茯磚茶加工過程中的霉菌的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)渥堆期主要是黑曲霉、青霉、根霉為主；發(fā)花后期，茶葉被壓成磚后則以“金花菌”冠突曲霉為主，占微生物總量的90%以上。阮林浩[12]等研究了浙江和湖南地區(qū)不同季節(jié)茯磚茶發(fā)花過程中優(yōu)勢菌群的類型變化，發(fā)現(xiàn)武義四季發(fā)花過程中的兩株冠突曲霉類型上無季節(jié)性差異；而長沙三季發(fā)花過程中的五株冠突曲霉、一株阿姆斯特丹曲霉和一株肋狀曲霉有季節(jié)性差異。梁曉嵐[13]研究四川茯磚茶發(fā)花干燥時(shí)期的霉菌菌群，結(jié)果表明發(fā)花初期黑曲霉為優(yōu)勢菌，而在后期薛氏曲霉占據(jù)優(yōu)勢，而婁地青霉、淡紫青霉、綠色木霉一直存在但數(shù)量較少。因此，以涇渭茯磚茶發(fā)酵為研究對象，研究其發(fā)酵過程中的霉菌菌群數(shù)量及種類的變化，為陜西茯磚茶加工過程中品質(zhì)的控制和提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

茯磚茶發(fā)酵過程在咸陽涇渭茯茶有限公司進(jìn)行，期間采集發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、23、28 d的茯磚茶樣品。

1.2 主要儀器設(shè)備

SMART生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LEICA-EZ4 HD體視顯微鏡，北京瑞科中義科技有限公司；PHENOM-PRO臺式掃描掃描電子顯微鏡，飛納上海復(fù)納科學(xué)儀器有限公司；3730XL測序儀，Applied Biosystems；2720 thermal cycler PCR儀，Applied Biosystems；5810R板式離心機(jī)，Eppendorf；JY04S-3C凝膠成像裝置，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY300C Power Supply電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 主要試劑及培養(yǎng)基

1.3.1 主要試劑

氯化鈉、硝酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、瓊脂粉、七水硫酸鎂、蔗糖均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石炭酸、乳酸、甘油、棉藍(lán)均為分析純，購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3.2 培養(yǎng)基

察氏改良培養(yǎng)基（CZG）：NaCl 50.0 g，NH4NO33.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蔗糖40 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL；20%蔗糖查氏培養(yǎng)基（CZ20）：NaCl 50.0 g，NH4NO33.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蔗糖200 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL；斜面培養(yǎng)基：NH4NO30.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，NaCl 5 g，蔗糖4 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL；所有培養(yǎng)基121 ℃下滅菌30 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 涇渭茯磚茶的發(fā)酵工藝

將壓制定型的茶磚放入溫度28 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵（每塊茶磚間隔距離2 cm）；前2 d每隔7.5 h將培養(yǎng)箱微開30 min（降低濕度），使培養(yǎng)箱中濕度保持在60%～75%之間；兩天后打開濕度調(diào)節(jié)裝置調(diào)節(jié)濕度為50%，溫度28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18 d（濕度保持在50%～60%之間）；待檢測茶磚內(nèi)部發(fā)花面積占80%時(shí)繼續(xù)發(fā)花2 d后，進(jìn)行升溫干燥，關(guān)閉培養(yǎng)箱加濕裝置調(diào)節(jié)溫度至30 ℃，每隔1 d升高2 ℃，在升溫至39 ℃（5 d）后，每隔1 d升高1 ℃至42 ℃，再次烘干1 d后關(guān)閉培養(yǎng)箱加熱裝置，常溫放置自然冷卻1 d，即可完成生產(chǎn)當(dāng)中所需要的發(fā)酵控制。

1.4.2 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的分離純化

采集12個(gè)不同發(fā)酵階段的茯磚茶樣品，根據(jù)改良后的國標(biāo)GB 4789.15-2016[14]方法進(jìn)行霉菌數(shù)量檢測，記錄其菌落形態(tài)差異明顯的霉菌菌落數(shù)量，然后將菌落差別明顯的霉菌通過三點(diǎn)法用CZG培養(yǎng)基分離純化，得到單一菌落后再進(jìn)行一次分離純化確保菌株的純化度，將純化好的11株霉菌編號為M1-M11轉(zhuǎn)移至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，放入4 ℃冰箱保存[15]。

1.4.3 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

從4 ℃冰箱中取出保存菌株，將斜面接種到CZG培養(yǎng)基中，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d～7 d，進(jìn)行菌株活化[16]。將活化好的“金花菌”以單點(diǎn)的方式接種于CZ20培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察霉菌菌落形態(tài)，用體式顯微鏡拍照觀察菌落的顯微形態(tài)；用插片法、棉藍(lán)染色法在光學(xué)顯微鏡下觀察；再通過掃描電子顯微鏡進(jìn)一步觀察金花菌閉囊殼、子囊、子囊孢子、分生孢子、分生孢子頭、分生孢子梗等形態(tài)以及其他霉菌的菌體繁殖特征[17,18]；最終通過《中國真菌志》等[19-23]相關(guān)專著確定霉菌菌屬。

1.4.4 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的ITS序列測序

將11株霉菌用CZG培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，用無菌接種鏟鏟取純的新鮮菌絲體，進(jìn)行DNA提取后使用ITS序列以ITS1和ITS4區(qū)域?yàn)橐镞M(jìn)行引物擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，所得序列與NCBI中進(jìn)行序列比對所得結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[24,25]。

1.4.5 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的變化

根據(jù)茯磚茶發(fā)酵過程中霉菌的數(shù)量檢測結(jié)果，結(jié)合M1-M11的形態(tài)學(xué)和ITS序列測序結(jié)果，將鑒定的同種霉菌重新歸納在一起，編號為J1-J8，繪制茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的菌落數(shù)量表，再利用origin堆積柱狀圖進(jìn)行細(xì)致分布，綜合分析制成涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

M1-M11是從不同發(fā)酵階段中形態(tài)差異明顯的菌落中對應(yīng)分離純化得到的11株霉菌，體式顯微鏡拍照觀察菌落的顯微形態(tài)，如圖1所示。

由圖1可知，M1的菌落生長良好，色澤由菌落中心向外從較深的橘紅色逐漸變淺成為黃色，整體色澤偏深趨近于橘黃色，形狀為不規(guī)則圓形，外部輪廓為鋸齒狀，菌落向四周蔓延，厚度約2 mm，具有一定的吸附力，菌落中菌絲為黃色，未發(fā)現(xiàn)綠色菌絲；M2的菌落為不規(guī)則圓形，色澤為黃色，越往外圍顏色變淺趨近于亮黃色，厚度約為2 mm，有繼續(xù)蔓延的趨勢，菌絲較為密集，發(fā)散性較強(qiáng)；M3與菌落M2較為相似，但厚度較高，色澤趨近于黃色，發(fā)散性比M2較弱，形狀為不規(guī)則圓形具有一定的差異性；M4的色澤為淡黃色，未有漸變色，形狀為較規(guī)則圓形，菌落吸附力較弱，厚度約1 mm，較薄，菌落密集度較差，與上述菌落形態(tài)具有明顯差異；M5的菌落色澤為亮黃色，比M3色澤較亮，發(fā)散性強(qiáng)于M2，厚度相似，但存在少許差異；M6菌落較圓，色澤由中心向外灰色由深變淺最終趨近于白色，菌絲為埋伏型菌絲體，質(zhì)地為絨狀；M7菌落呈白色，菌絲纏繞茂盛；M8菌落為白色，生長較高，顏色由內(nèi)向外顏色逐漸變淺，最終接近與灰色，有較為密集的黑色分生孢子，孢子粗壯，少數(shù)淺灰色分生孢子梗分布；M9菌落形態(tài)與M8較為相似，但色澤由中心向外部從綠色逐漸變淺為黃綠色，菌落白色較皺上層可以看出為綠色分生孢子梗茂密分布；M10菌落色澤為棕黃色，由中心至外圍色澤逐漸變淺最終為白色菌毛，菌絲較為密集，發(fā)散性較弱，具有較強(qiáng)的吸附性，菌落厚度約為3 mm，菌落整體較小為不規(guī)則圖形；M11菌落色澤為棕綠色，中心至外圍顏色逐漸變淺最終為淡綠色菌毛，菌絲密集，發(fā)散性同M10均較弱，吸附性較弱，中心處菌落容易散落，厚度較薄約1 mm，菌落整體趨近于橢圓形。

將這11株霉菌的菌體繁殖特征用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察后得到圖2至圖12。

圖1 茯磚茶發(fā)酵過程中霉菌的菌落形態(tài)Fig.1 Mold morphology during Fuzhuan brick tea fermentation

圖2 M1霉菌的菌體繁殖特征Fig.2 Mycelial morphology of mold M1

圖3 M2霉菌的菌體繁殖特征Fig.3 Mycelial morphology of mold M2

圖4 M3霉菌的菌體繁殖特征Fig.4 Mycelial morphology of mold M3

由圖2～6所示，M1-M5的菌體形態(tài)都包括有性繁殖的子囊果、子囊、子囊孢子，無性繁殖的足細(xì)胞、分生孢子梗、分生孢子、頂囊。根據(jù)《中國真菌志》，可以將M1、M2、M4、M5初步鑒定為冠突曲霉（A.cristatus），其中M1的形態(tài)與鑒定手冊中描述的冠突散囊菌（冠突曲霉）形態(tài)特征最為接近。M1子囊果近球形，黃色，直徑100～200 μm，具擬薄壁組織包裹著子囊，近球形，6～10 μm，子囊內(nèi)含8個(gè)子囊孢子，子囊孢子呈雙凸鏡形，凸面粗糙具小疣，孢子體4～5 μm×5～6 μm，具有兩個(gè)明顯的縱向雞冠狀突起，赤道溝較窄且深；無性繁殖的分生孢子梗莖沒有分枝，頂囊燒瓶形或球形，分生孢子頭幼時(shí)球形，老后疏松放射型，分生孢子腰鼓型，4 μm×3～5 μm，表面粗糙具小刺。M3的無性繁殖特征與其他4株“金花菌”接近，但有性繁殖的子囊孢子除了形似龜殼、具有兩個(gè)明顯的縱向雞冠狀凸起、有較窄且深的赤道溝外，在子囊孢子的凸面有網(wǎng)結(jié)狀不規(guī)則的肋狀突起，可以用于和其他“金花菌”區(qū)分，所以M3初步鑒定為肋狀曲霉（A. costiformis）。

圖5 M4霉菌的菌體繁殖特征Fig.5 Mycelial morphology of mold M4

圖6 M5霉菌的菌體繁殖特征Fig.6 Mycelial morphology of mold M5

圖7 M6霉菌的菌體繁殖特征Fig.7 Mycelial morphology of mold M6

圖8 M7霉菌的菌體繁殖特征Fig.8 Mycelial morphology of mold M7

圖9 M8霉菌的菌體繁殖特征Fig.9 Mycelial morphology of mold M8

圖10 M9霉菌的菌體繁殖特征Fig.10 Mycelial morphology of mold M9

圖11 M10霉菌的菌體繁殖特征Fig.11 Mycelial morphology of mold M10

圖12 M11霉菌的菌體繁殖特征Fig.12 Mycelial morphology of mold M11

由圖7可知，M6分生孢子梗呈帚狀枝，含有副枝，類副枝，梗基，瓶梗四部分單輪生基本沒有，分生孢子很小，形狀為卵形，孢壁含有細(xì)刺狀，孢子大小為5～6 μm；根據(jù)形態(tài)學(xué)可初步鑒定為青霉屬（Penicillium）。由圖8可知，M7菌絲有隔，分枝，分生孢子梗分枝，分生孢子鐮刀形，有較多的橫隔，根據(jù)基本形態(tài)初步鑒定為鐮刀菌屬（Fusarium）。由圖9可知，M8霉菌無性階段分生孢子梗不含有梗基，由瓶梗處分生出分生孢子，分生孢子梗莖不分枝，不具septum，壁的表面較光滑，頂囊明顯呈球形，瓶梗頂端變窄，呈安瓿狀，分生孢子呈卵形，表面為豎狀條紋，兩端具有小的突起，呈燈籠狀，分生孢子頭呈球形大小為3～5 μm；根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，初步鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。由圖10可知，M9霉菌為無性階段，分生孢子梗不含有?；?，由瓶梗處分生出分生孢子，分生孢子梗莖不分枝，不具septum，壁的表面較光滑，頂囊明顯呈棒形，瓶梗頂端變窄，呈安瓿狀，分生孢子呈球形，表面粗糙具有小刺，兩端具有小的突起，呈球狀，分生孢子頭呈棒形大小為4～7 μm；根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，初步鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae）。由圖11可知，M10分生孢子形狀為倒梨形，有分割膜，孢子大小20 μm±5 μm，根據(jù)基本形狀可初步鑒定為鏈格孢屬（Alternari）。由圖12，M11的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為枝孢型，形成分枝的孢子鏈，分生孢子為卵圓形，孢子大小為8 μm±2 μm，根據(jù)基本形狀可初步鑒定為枝孢屬（Cladosporium）。

2.2 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的ITS序列測序

將11株霉菌M1-M11，經(jīng)過ITS1和ITS4區(qū)域擴(kuò)增純化后進(jìn)行測序后輸入到NCBI中進(jìn)行序列比對所得結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖13所示。由進(jìn)化樹可看出M1-M5與刺針曲霉（Aspergillus spicules）的同源性為100%；M6與橘青霉（Penicillium citrinum）的同源性為100%；M7與木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）的同源性為100%；M8與黑曲霉（Aspergillus niger）的同源性為100%；M9與米曲霉（Aspergillus oryzae）的同源性為100%；M10與互隔鉸鏈孢霉（Alternaria alternate）的同源性為100%；M11與芽枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）的同源性為100%。

圖13 M1-M11霉菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.13 M1～M11 phylogenetic tree for mold identification

表1 茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的菌落數(shù)量Table 1 The number of fungus colony in Fuzhuan brick tea fermentation

根據(jù)ITS序列測序結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行分析比對可知霉菌M6-M11鑒定的結(jié)果基本一致，但霉菌M1-M5的ITS序列測序鑒定結(jié)果為同一種菌，不能夠區(qū)分開來，這是因?yàn)镮TS序列測序仍存在一定的局限性，在NCBI中進(jìn)行比對時(shí)，發(fā)現(xiàn)同源性趨近于100%的菌種有多個(gè)，例如阿姆斯特丹曲霉（Asperqillus amstelodami），謝瓦氏散囊菌（Eurotium chevalieri）等，不能夠準(zhǔn)確鑒定到種，只能鑒定到屬。呂嘉櫪[8]等人在對陜西茯磚茶中優(yōu)勢Eurotium屬的鑒定過程中也遇到了同樣的問題，在對7株“金花菌”進(jìn)行18S rDNA序列分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)這7株菌與Aspergillus glaucus、Eurotium herbariorum、Aspergillus pseudoglaucus、Aspergillus cristatus、Eurotium chevalieri、Eurotium amstelodami、Eurotium rubrum、Aspergillus amstelodami都在系統(tǒng)發(fā)育樹的同一枝上，同源性都超過99%，不能區(qū)分開來。所以M1-M5 “金花菌”的鑒定不能只通過單一手段完成，一般至少要結(jié)合兩種鑒定方法才能得出結(jié)論。綜合形態(tài)學(xué)和ITS測序兩者最終鑒定結(jié)果是M1、M2、M4、M5為冠突曲霉（A. cristatus），M3為肋狀曲霉（A. costiformis），M6為橘青霉（Penicillium citrinum），M7為木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti），M8為黑曲霉（A. niger），M9為米曲霉（A. oryzae），M10為互隔鉸鏈孢霉（Alternaria alternate），M11為芽枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）。關(guān)于分子生物學(xué)的鑒定方法還有對NRPS、barcode or MLST、MALDI-TOF等[26-28]的差異分析，也有利用轉(zhuǎn)錄組水平的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析菌株的種屬關(guān)系[6,29]，但這些研究目前均有一定的偏差，因此需要尋求更準(zhǔn)確、分辨率更高的分子生物學(xué)鑒定方法。

2.3 涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中可培養(yǎng)霉菌的變化

由圖14所示，發(fā)酵前期6 d左右，除第2 d、第4 d有少量冠突曲霉外，無其他“金花菌”生長，有檢出其他霉菌橘青霉菌落數(shù)量較多，還檢出較少的黑曲霉、互隔鉸鏈孢霉和芽枝狀枝孢霉；發(fā)酵中期第8 d時(shí)，橘青霉的數(shù)量仍然占據(jù)優(yōu)勢，但檢出了少量“金花菌”肋狀曲霉的生長，隨后“金花菌”冠突曲霉開始大量生長，在發(fā)酵中后期和干燥期占據(jù)主導(dǎo)地位，期間有少量木賊鐮刀菌、黑曲霉、米曲霉存在，最后到28 d樣品中冠突曲霉的菌落數(shù)量達(dá)到134000 CFU/g，占可培養(yǎng)霉菌總數(shù)的99.99%，只檢測出極少量10 CFU/g的黑曲霉。另外，在整個(gè)發(fā)酵過程中曲霉屬的數(shù)量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。這與LI等[30]研究的結(jié)果類似，即在茯磚茶發(fā)酵的不同階段中，Asperqillus的豐度先下降后上升，在S5階段時(shí)相對豐度已上升至98%，最終成品中達(dá)到了99.95%。

圖14 茯磚茶發(fā)酵過程中霉菌的變化Fig.14 Molds changes during Fuzhuan brick tea fermentation

3 結(jié)論

涇渭茯磚茶發(fā)酵過程中共分離鑒定出8種霉菌。發(fā)酵前期第2 d和第4 d有少量“金花菌”冠突曲霉生長，但橘青霉為優(yōu)勢菌群，另外還有少量黑曲霉、互隔鉸鏈孢霉和芽枝狀枝孢霉；發(fā)酵中期自第8 d檢測出少量“金花菌”肋狀曲霉之后，“金花菌”冠突曲霉開始大量生長并一直占據(jù)主導(dǎo)地位，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)占霉菌總數(shù)的99.99%。涇渭茯磚茶發(fā)酵前期霉菌菌群豐富，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，其中的冠突曲霉逐漸成為優(yōu)勢菌群。