CRISPR/Cas9介導(dǎo)的果糖低消耗釀酒酵母工程菌的構(gòu)建

陳紅，趙風(fēng)光，李戰(zhàn)勝，楊家明，韓雙艷

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

肥胖、糖尿病等代謝疾病已經(jīng)成為全球性危機，熱量高的蔗糖等甜味劑的過多攝入造成能量過剩是其中一個重要原因[1]。D-阿洛酮糖（D-psicose）是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健作用的功能性甜味劑，甜度相當(dāng)于蔗糖的70%，熱量只有蔗糖的0.3%[2,3]。有研究報道，D-阿洛酮糖可以通過抑制關(guān)于脂質(zhì)合成的酶活性而減輕腹部肥胖（Abdominalobesity），因此D-阿洛酮糖可用作減肥食品（diet food）的有效成分[4]。

當(dāng)前的研究報道，大多集中在大腸桿菌中表達酮糖3-差向異構(gòu)酶，然后用重組酶催化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖[5,6]。就食品安全性來說，重組大腸桿菌進行D-阿洛酮糖生產(chǎn)并不太適合D-阿洛酮糖主要用于食品添加的需求。釀酒酵母一直被美國FDA（Food and Drug Administration）認為是GRAS（Generally Recognized As Safe）生產(chǎn)菌株，具備安全無致病性、遺傳背景清晰、培養(yǎng)簡單和繁殖迅速等優(yōu)勢，是功能性甜味劑D-阿洛酮糖的理想生產(chǎn)菌株[2,7]。

在釀酒酵母體內(nèi)，己糖激酶同工酶2HXK2（hexokinase isoenzyme 2，GenBank：CAA96973.1）可以將果糖磷酸化形成果糖-6-磷酸，從而進入糖酵解代謝[8]。因此，有必要將hxk2基因敲除或功能弱化，從而降低宿主釀酒酵母對果糖消耗且改善目的產(chǎn)物D-阿洛酮糖的生產(chǎn)。在釀酒酵母中，利用蔗糖為底物生產(chǎn)果糖和乙醇時，HXK2的缺陷可以抑制細胞對果糖的消耗[9]。另外，通過利用分泌菊粉酶的釀酒酵母將菊芋轉(zhuǎn)化為果糖的生產(chǎn)中，HXK2的缺失在減少酵母對果糖利用中發(fā)揮重要作用[10]。

CRISPR/Cas9技術(shù)被譽為第三代基因組編輯技術(shù)，2013年首次應(yīng)用在釀酒酵母中[11]，隨后因其具有低成本、易操作、普適性和高效性等多種優(yōu)點[12]，在釀酒酵母中迅速得到推廣應(yīng)用[13-15]。目前，II型CRSPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用廣泛；在該系統(tǒng)中，gRNA由crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）組成，更換20 bp靶序列即可對不同基因進行編輯[16]；Cas9核酸酶介導(dǎo)形成的DNA雙鏈斷裂通過donor DNA可修復(fù)，進而實現(xiàn)基因的定向編輯。本研究嘗試開發(fā)CRISPR/Cas9共表達系統(tǒng)，對釀酒酵母hxk2基因進行無痕編輯，以期降低釀酒酵母作為宿主菌對果糖的消耗，為后續(xù)在釀酒酵母體內(nèi)以D-果糖為原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖提供可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Top10為本實驗室收藏，用于質(zhì)粒的構(gòu)建和擴增；釀酒酵母BY4741為本實驗室收藏和保存。實驗中所使用和構(gòu)建的質(zhì)粒見表1。

表1 本實驗所用質(zhì)粒Table 1 All the plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：用于大腸桿菌的生長（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨和10 g/L NaCl），固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉2 g/L；轉(zhuǎn)化子篩選時需要添加氨芐青霉素至濃度100 μg/mL。YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培養(yǎng)基：用于釀酒酵母的生長（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖），固體培養(yǎng)基則還需要添加瓊脂粉2 g/L。SD-U培養(yǎng)基：用于篩選釀酒酵母轉(zhuǎn)化子（6.7 g/L酵母氮源YNB、0.66 g/L ΔUra DO Supplement和20 g/L葡萄糖）。YPF培養(yǎng)基：含果糖培養(yǎng)基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L果糖），用于評估釀酒酵母對果糖的消耗情況。

1.1.3 主要試劑和儀器

KOD DNA聚合酶購自TOYOBO公司；限制性內(nèi)切酶BcuI和SacII及T4 DNA連接酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2×UTaq PCR MasterMix及DNA marker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；瓊脂糖凝膠片段回收試劑盒以及質(zhì)粒抽提試劑盒購自美基生物；Seamless Assembly Cloning Kit無縫重組試劑盒購自美國Clone smarter；引物合成由擎科生物技術(shù)有限公司完成；序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。主要儀器有：紫外分光光度計，美國Unico公司；PCR儀，美國Bio-Rad公司；恒溫培養(yǎng)箱，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Mini-Beadbeater研磨珠均質(zhì)器，美國Biospec公司。

表2 實驗所用引物Table 2 Primers used in this study

圖1 CRISPR/Cas9共表達質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2的構(gòu)建Fig.1 The construction of pYES2-CG-Δhxk2

1.1.4 引物

實驗中用到的引物見表2。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

CRISPR/Cas9共表達質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2的構(gòu)建流程如圖1所示。主要分為兩步：

1）以pYES2和rDNA-PPGK1-Cas9-TCYC1為出發(fā)材料，構(gòu)建得到游離型Cas9蛋白表達載體pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1。基本過程是：（1）制備pYES2載體片段：以pYES2質(zhì)粒為模板，使用引物對F1/R1擴增，獲得帶有多克隆位點的pYES2載體片段，預(yù)期片段大小4499 bp；（2）制備Cas9基因片段：使用引物對F2/R2，以rDNA-PPGK1-Cas9-TCYC1質(zhì)粒為模板，獲PPGK1-Cas9-TCYC1表達盒，預(yù)期片段大小5428 bp；（3）連接和轉(zhuǎn)化：上述兩個片段用clone smarter無縫重組試劑盒進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB（LBA）平板上篩選；（4）轉(zhuǎn)化子鑒定：從LBA平板挑選轉(zhuǎn)化子，利用引物對F3/R3進行菌落PCR，確定陽性克隆，抽提質(zhì)粒送生工測序。

2）以pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1和gRNA-trp-HYB為出發(fā)材料構(gòu)建得到pYES2-CG-Δhxk2。基本過程是：（1）制備靶向hxk2的PSNR52-gRNA-TSUP4表達盒：以gRNA-trp-HYB為模板，利用引物對F4/R4和F5/R5，擴增啟動子PSNR52和含20 bphxk2靶序列（5’TTCCTTTGGCACATCGGCCA3’）的gRNA結(jié)構(gòu)序列；隨后使用引物對F4/R5，經(jīng)融合PCR獲得PSNR52-gRNA-TSUP4表達盒，預(yù)期大小為439 bp；（2）酶切和連接：使用限制性內(nèi)切酶BcuI和SacII，對pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1和PSNR52-gRNA-TSUP4進行雙酶切，對切膠回收后片段進行連接；（3）轉(zhuǎn)化：將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB（LBA）平板篩選；（4）轉(zhuǎn)化子鑒定：從LBA平板挑選轉(zhuǎn)化子，利用引物對F6/R5進行菌落PCR，確定陽性克隆，抽提質(zhì)粒送生工測序。

1.2.2 Donor DNA的構(gòu)建

設(shè)計帶有15 bp重疊區(qū)的引物對F7/R7，進行重疊PCR反應(yīng)，切膠回收，獲得Donor DNA片段，用于釀酒酵母轉(zhuǎn)化。PCR擴增條件為：94 ℃變性5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 12 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 電轉(zhuǎn)化釀酒酵母以及轉(zhuǎn)化子的鑒定

根據(jù)文獻[17]中的電擊轉(zhuǎn)化方法制備感受態(tài)細胞并進行轉(zhuǎn)化，具體如下：制備釀酒酵母BY4741的感受態(tài)細胞，將質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2和donor DNA片段共轉(zhuǎn)化，涂布SD-U平板培養(yǎng)2～3 d。在超凈臺挑取轉(zhuǎn)化子，利用引物對F8/R8進行PCR鑒定，預(yù)期片段大小683 bp，隨后將所得PCR產(chǎn)物交由生工測序。

工程菌BY4741-Δhxk2的搖瓶發(fā)酵：挑取工程菌BY4741-Δhxk2單克隆，于10 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；然后轉(zhuǎn)接于25 mL YPD中，控制起始OD600為0.2，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)22 h。

1.2.4 果糖含量的測定

取1 mL發(fā)酵液轉(zhuǎn)入含0.74 g玻璃珠的破碎管中，利用均質(zhì)儀進行間歇機械破碎，每破壁1 min之后放在冰上1 min，重復(fù)8次。破壁結(jié)束后，于8000 r/min離心5 min，將上清通過0.22 μm濾膜過濾，隨后進行HPLC分析。檢測條件為：Waters 2695型高效液相色譜儀，Shodex SP-0810色譜柱，柱溫為65 ℃，流動相為超純水，流速為1 mL/min，Waters 2424 ELSD檢測器。

果糖消耗速率的計算公式如下：

式中：M1是發(fā)酵培養(yǎng)14 h時果糖含量，M0是起始培養(yǎng)基中的果糖含量；T是14 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)平均值處理以及計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.0軟件作圖，利用SPSS 17.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離型CRISPR/Cas9共表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 質(zhì)粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1的構(gòu)建

PCR擴增pYES2載體片段（4499 bp）和含強啟動子PGK1的Cas9表達盒PPGK1-Cas9-TCYC1（5428 bp），相關(guān)PCR片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見圖2a、b。將上述兩步獲得的載體和PPGK1-Cas9-TCYC1表達盒無縫連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)，挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR，菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠點泳鑒定（圖2c），與理論值631 bp相符。隨后陽性轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送生工測序，測序結(jié)果證明質(zhì)粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1構(gòu)建成功，符合預(yù)期。

圖2 質(zhì)粒pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1構(gòu)建過程中PCR產(chǎn)物鑒定電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA fragments for pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1 construction

2.1.2 靶向hxk2的gRNA構(gòu)建

利用在線工具CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）[18]，設(shè)計了用于靶向hxk2基因的20 bp序列（5’TTCCTTTGGCACATCGGCCA3’）。設(shè)計含有該20 bp在內(nèi)的引物F5，該引物5'端與啟動子SNR52的5'端具有19 bp重疊區(qū)域。利用引物對F5/R5對質(zhì)粒gRNA-trp-HYB擴增得出終止子TSUP4，利用引物對F4/R4對質(zhì)粒gRNA-trp-HYB擴增得出啟動子PSNR52，最后對這兩個片段進行融合，獲得含啟動子PSNR52的靶向hxk2基因gRNA結(jié)構(gòu)序列，命名為gRNA-Δhxk2。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認融合片段的長度與預(yù)期結(jié)果相符見圖3。

圖3 表達組件gRNA-Δhxk2的擴增Fig.3 Amplification of expression components gRNA-Δhxk2

2.1.3 靶向hxk2的CRISPR/Cas9共表達質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)限制性內(nèi)切酶BcuI和SacII處理的pYES2-PPGK1-Cas9-TCYC1與相同雙酶切處理過的gRNA-Δhxk2片段體外連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)，挑選轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR來確定陽性克隆，菌落PCR產(chǎn)物大小與理論值147 bp較符合（見圖4）。隨后轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒送生工測序，測序結(jié)果證明連接成功，獲得可用于己糖激酶hxk2編輯的質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2。

圖4 重組大腸桿菌TOP10/pYES2-CG-Δhxk2鑒定Fig.4 Diagnostic of TOP10/pYES2-CG-Δhxk2

2.1.4 donor DNA片段的構(gòu)建

圖5 donor DNA構(gòu)建的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of donor DNA

引物F7的3’端含有15 bp序列與引物R7的3’端重疊（圖5a），通過PCR直接將引物融合，構(gòu)建得到含有hxk2 PAM位點上下游的同源臂片段donor DNA（90 bp），該片段第43為T，第44位為A，第45位為A，可以在后續(xù)Cas9介導(dǎo)的同源修復(fù)中將hxk2基因位點的第44位C突變?yōu)锳，45C被刪除，46A移碼至45位置，實現(xiàn)己糖激酶同工酶2移碼突變及提前終止。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物大小與理論值相符（圖5b）。

2.2 己糖激酶2 HXK2缺陷株的建立

將pYES2-CG-Δhxk2和donor DNA共轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741感受態(tài)細胞，涂布SD-U篩選平板。轉(zhuǎn)化子用F8/R8為引物對菌落PCR，產(chǎn)物預(yù)期大小為683 bp，與電泳結(jié)果相一致（圖6a）；隨后將PCR產(chǎn)物送上海生工測序，結(jié)果證明工程菌中第44位C突變?yōu)锳，同時缺失了hxk2基因ORF的第45位堿基序列，使第46位A移碼，從而形成TAA，造成了移碼突變及提前終止（圖6b）。釀酒酵母的hxk2全長1461 bp[19]，因而在上游第45位開始的移碼突變，完全可能引起整個蛋白失活。因而釀酒酵母缺陷株BY4741-Δhxk2構(gòu)建成功。相比于兩步法依次將Cas9和gRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至釀酒酵母體內(nèi)進行基因編輯[20,21]，該共表達質(zhì)粒一定程度上縮短了實驗操作過程以及減少了篩選標(biāo)記的使用。

圖6 突變菌株BY4741-Δhxk2構(gòu)建Fig.6 Construction of mutant BY4741-Δhxk2

2.3 釀酒酵母工程菌對果糖消耗情況

圖7 釀酒酵母突變菌株BY4741-Δhxk2發(fā)酵性能測定Fig.7 Fermentation properties of original strains and mutant strains BY4741-Δhxk2

使用YPF培養(yǎng)基對菌株BY4741-Δhxk2進行培養(yǎng)，評估己糖激酶hxk2缺陷工程菌對果糖的消耗情況，結(jié)果見圖7a。在14 h培養(yǎng)期間（14 h之后果糖徹底消耗），缺陷株BY4741-Δhxk2和野生型BY4741對果糖的消耗速率分別為3.35 mg/h和3.58 mg/h，二者存在顯著差異（p＜0.05）。同野生型相比，己糖激酶hxk2缺陷株的果糖消耗降低了6.42%，Yu[10]曾通過對hxk2基因進行敲除實現(xiàn)酵母對果糖的消耗降低。初步實現(xiàn)了我們的預(yù)期目的：通過缺陷己糖激酶hxk2，阻斷果糖磷酸化進入糖酵解代謝被酵母作為碳源利用。有意思的是，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)到22 h后，缺陷株BY4741-Δhxk2和對照BY4741的OD600分別為8.65和8.13，兩者有顯著差異（p＜0.05），如圖7b所示；相比于野生型BY4741，BY4741-Δhxk2具有較高的OD600，且提高了6.40%。而且從培養(yǎng)8 h后，缺陷株細胞生長量一直在野生型之上，顯示出來較好的生長優(yōu)勢。前期研究表明[10,22]，hxk2敲除菌的生長情況同樣優(yōu)于野生型。Diderich[22]指出己糖激酶2（HXK2）的缺失會增強細胞的呼吸作用，從而可以避免發(fā)酵代謝中產(chǎn)生的乙醇抑制，因此推測hxk2敲除菌細胞生長量得以提高。結(jié)合缺陷株果糖消耗慢、生長性能好的優(yōu)勢，可以考慮將缺陷株BY4741-Δhxk2作為出發(fā)菌株，進一步構(gòu)建利用果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的新型釀酒酵母工程菌。

2.4 討論

在過去的幾年中，CRISPR/Cas9技術(shù)在基因組編輯方面經(jīng)歷了快速的發(fā)展，并且在不同的生物體中被廣泛應(yīng)用，以操縱DNA序列[14]。本實驗采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建了以URA3標(biāo)記，Cas9和gRNA共表達游離型質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2，成功編輯了釀酒酵母己糖激酶hxk2，得到了預(yù)期的hxk2缺陷株BY4741-Δhxk2。相比于眾多將Cas9和gRNA單獨表達的文獻報道[21,22]，這種共表達質(zhì)粒的應(yīng)用有效地減少了篩選陽性轉(zhuǎn)化子時所用的標(biāo)記，縮短了基因編輯所需的實驗周期，但就是否能夠同時實現(xiàn)多個基因編輯，有待進一步實驗研究。菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程顯示，相比于野生型BY4741，缺陷株BY4741-Δhxk2果糖消耗速率下降了6.42%，說明hxk2基因的功能缺失對釀酒酵母利用果糖有一定的抑制作用，這與之前的相關(guān)報道結(jié)論也一致[10]。但是，值得一提的是，相比于野生型，BY4741-Δhxk2的細胞數(shù)量（OD）提高了6.40%，表現(xiàn)出一定的生長性能優(yōu)勢。為后期，在缺陷株基礎(chǔ)上開發(fā)新的D-阿洛酮糖生產(chǎn)菌株提供了可能。

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建Cas9和gRNA共表達單質(zhì)粒pYES2-CG-Δhxk2，采用一步法轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)了釀酒酵母中hxk2基因的敲除，獲得對果糖代謝較緩慢的突變株BY4741-Δhxk2。相比于傳統(tǒng)兩步法轉(zhuǎn)化篩選，本方法縮短了實驗所需時間，為CRISPR技術(shù)的進一步升級改良提供了思路。同時，研究獲得了果糖低消耗、生長性能優(yōu)良的缺陷株釀酒酵母BY4741-Δhxk2，為符合GRAS的釀酒酵母細胞以果糖為原料生產(chǎn)阿洛酮糖奠定了基礎(chǔ)。