生孢梭菌芽孢萌發(fā)條件的優(yōu)化

黃忠民，郭鼐，潘治利，艾志錄，雷萌萌，索標

（河南農業(yè)大學食品科學技術學院，國家速凍米面制品加工技術研發(fā)專業(yè)中心，農業(yè)部大宗糧食加工重點實驗室，河南省冷鏈食品工程技術研究中心，河南鄭州 450002）

罐頭食品殺菌目的是殺死食品中所污染的致病菌和腐敗菌，并破壞食物中的酶使產品的貨架期達到二年以上。在肉類罐頭中最易發(fā)生中毒事件的就是肉毒梭菌（Clostridium botulinum）毒素中毒[1]。肉毒梭狀芽孢桿菌是低酸性罐頭食品中危害最大的微生物之一[2]，由于其產生強效神經毒素和抗性內生孢子的能力而成為重要的食品安全問題[3]。肉毒梭狀芽孢桿菌屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，專性厭氧生長[4]，最常用的殺菌方式是高溫高壓殺菌，但這種殺菌方法溫度高、時間長，不僅會導致食物因產生“蒸煮味”而口感變差[5,6]，也容易導致營養(yǎng)物質被破壞。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，高溫高壓等殺菌方法正在被改進。同時，找到肉毒梭狀芽孢桿菌低強度的殺菌方式是低酸性罐頭食品殺菌問題中的關鍵點和難點。

但肉毒梭狀芽孢桿菌屬于高致病性病原微生物，對研究人員的生命安全存在一定威脅，而生孢梭菌（Clostridium sporogenes）的性質和特征都與肉毒梭狀芽孢桿菌非常相似，所以常作為實驗室中肉毒梭狀芽孢桿菌的替代菌進行研究[7]。

生孢梭菌又譯產孢梭菌，是典型的嚴格厭氧型細菌，為梭狀芽孢桿菌屬，細胞大小（0.3～0.4）μm×（1.4～6.6）μm，芽孢卵圓形、次端生。在固體培養(yǎng)基上菌落直徑2～6 mm，中部突起，白色至淡黃色，邊緣假根狀，半透明，表面無光澤，能分解蛋白質和糖類，發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，產丁酸和少量乙酸等，存在于土壤、傷口和腸道內。生孢梭菌是不產毒素的蛋白水解型肉毒梭菌B、E、和F種的研究替代菌，本身也能引起食品的腐敗[8,9]。同時，生孢梭菌也是近幾年微生物中的研究熱潮，Valero Antonio等研究了pH、NaCl和時間對產孢梭菌的孢子萌發(fā)概率的影響[10]；郭長凱等研究了微波熱處理對生孢梭菌的影響，通過設計同步升溫曲線分析微波和傳統(tǒng)熱處理對三文魚樣品中生孢梭菌的滅活效果[11]。杜翠榮等研究了次磷酸鈉對部分革蘭氏陽性厭氧菌（特別是肉制品中肉毒梭菌）的抑制效果[12]。馬仕洪等采用抗力儀和油浴儀處理生孢梭菌的芽孢懸液，使其達到滅菌條件[13]。

生孢梭菌個體生長到一定階段，受到營養(yǎng)缺乏、環(huán)境脅迫等因素的刺激就會產生芽孢[14]，芽孢可能呈圓形或是橢圓形，直徑大于菌體直徑[15]，會使整個菌體呈梭形[16]。芽孢由外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細胞壁、內膜和內核等結構組成（圖1）。其中，芽孢的原生質體中有2,6-吡啶二羧酸（dipicolinic acid）含量高，為芽孢干重的5%～15%，能與鈣離子形成絡合物對熱和其他致死因子有極強的抗逆性，芽孢形成過程中，2,6-吡啶二羧酸隨即合成，芽孢就會具有耐熱性。

芽孢可以長時間保持休眠狀態(tài)，一旦遇到適宜的環(huán)境，芽孢就能迅速萌發(fā)成為具有代謝功能的營養(yǎng)細胞，從而降低對外界刺激的耐受力[17-20]。它對高溫、高靜壓、干燥、輻射、低溫等條件都具有極強的抗逆性[21,22]。芽孢的熱抵抗力很強，干熱180 ℃，5～15 min或高壓蒸汽121 ℃，30 min，才能被殺死。同時，芽孢在探測到外界有適宜萌發(fā)條件時就會開始萌發(fā)，生長成新的營養(yǎng)細胞[23]。

圖1 芽孢結構示意圖Fig.1 Endospore structure diagram

常見的高溫高壓的滅菌方式會使產品品質大大降低，找到一種低強度的滅菌方法，能夠較大程度的保留食物的風味和營養(yǎng)價值是食品工業(yè)的新熱點。結合芽孢萌發(fā)機理，找到芽孢萌發(fā)的最佳條件，使芽孢“先萌發(fā)，再殺滅”為這一難題提供了新思路和低強度殺菌的可行性，對將其應用于低酸性罐頭食品有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

生孢梭菌（10385），購于中國工業(yè)微生物保藏管理中心，0代菌，包裝形式為凍干管；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司；平板計數(shù)瓊脂，北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

無菌操作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫水浴鍋、恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TONY公司；20 mL玻璃瓶；厭氧盒、厭氧袋，日本三菱瓦斯化學株式會社；JJ3000型電子分析天平，常州市雙杰測試儀器廠；pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗流程

菌種活化→繼代培養(yǎng)→收集芽孢→單因素試驗→響應面試驗→結果分析

1.3.2 菌種活化與繼代培養(yǎng)

1.3.2.1 菌種活化

在無菌操作臺中開啟菌種凍干管，加入1 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，將凍干粉菌種溶解，取0.1 mL凍干粉菌液轉移到裝有10 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的玻璃瓶中[24]，用無菌棉塞在玻璃瓶口，將玻璃瓶至于35 ℃的厭氧盒中培養(yǎng)24 h。

1.3.2.2 菌種繼代培養(yǎng)

取0.1 mL上述活化后的新鮮培養(yǎng)物加至10 mL硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)24 h，重復兩次[25]。

1.3.3 芽孢懸浮液的制備

7 d后取少量培養(yǎng)液做芽孢染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)有大量芽孢存在。取培養(yǎng)液至無菌離心管中，2000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液；6000 r/min，4 ℃離心10 min取底部沉淀，加入無菌水混勻，重復離心3次，再次加入無菌水混勻，獲得芽孢懸浮液，置于4 ℃冰箱內保存?zhèn)溆肹26]。

1.3.4 單因素試驗

試驗單元為含有芽孢濃度為108CFU/mL的1.5 mL硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基液體。參考肉毒梭狀芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)最佳時間和溫度[1]設置本試驗中單因素的水平及梯度。

1.3.4.1 不同水浴時間處理

將樣品在水浴溫度為80 ℃，pH值為5.0條件下分別處理5、10、15、20、25 min，重復三次。

1.3.4.2 不同溫度處理

將樣品在水浴時間為20 min，pH值為5.0條件下下分別處理70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃，重復三次。

1.3.4.3 不同pH值處理

在pH值低于4.6的條件下，大多數(shù)芽孢不會萌發(fā)且生長受到抑制。將樣品在水浴溫度為85 ℃，處理時間為20 min條件下分別調整pH值為4、5、6、7、8，重復三次。

1.3.5 響應面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，根據(jù) Box-Behnken設計原理，以芽孢萌發(fā)率為響應值，選取溫度(A)、時間(B)、pH值(C)為影響因子，每個因子取三個水平，以（-1，0，1）編碼，進行3因素3水平響應面實驗，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 芽孢平板計數(shù)

將處理前后的芽孢懸浮液進行平板稀釋，每個平板中加入0.1 mL的稀釋菌液，在35 ℃的厭氧盒中進行培養(yǎng)，48 h后進行計數(shù)[27]。

2 試驗結果與數(shù)據(jù)分析

2.1 單因素試驗結果

查閱文獻可知，芽孢常見的萌發(fā)溫度為60 ℃～80 ℃，而梭菌屬比桿菌屬的細菌耐熱性更強，芽孢更難萌發(fā)。本實驗在預實驗的基礎上將溫度設定為70、75、80、85、90 ℃等5個梯度，將時間設定為5、10、15、20、25 min等5個梯度，將pH值設定為4、5、6、7、8等5個梯度，進行單因素實驗。

2.1.1 不同處理溫度對芽孢萌發(fā)率的影響

圖2 不同溫度對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.2 Effect of processing temperature on spore germination

由圖2可知，生孢梭菌芽孢的萌發(fā)率隨著溫度的升高而增加，當溫度達到80 ℃時，萌發(fā)率最高達到79.13%，然后隨著溫度的升高而降低。大部分芽孢的萌發(fā)溫度在60 ℃～80 ℃，可知溫度達到80 ℃時，熱作用對生孢梭菌芽孢外壁的刺激達到最大，促使芽孢萌發(fā)。

2.1.2 不同處理時間對芽孢萌發(fā)率的影響

圖3 不同時間對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of different time on spore germination rate

由圖3可知，生孢梭菌芽孢的萌發(fā)率隨著時間的增長而升高，當時間達到20 min時，萌發(fā)率最高達到78.04%，然后隨著溫度的升高而降低。大部分芽孢的萌發(fā)時間在10～30 min，可知當熱處理時間達到20 min時，生孢梭菌芽孢萌發(fā)成新的菌體的數(shù)量最多，萌發(fā)率達到最高。

2.1.3 不同處理pH值對芽孢萌發(fā)率的影響

由圖4可知，生孢梭菌芽孢的萌發(fā)率在pH值為5時，萌發(fā)率最高達到75.89%，然后隨著pH值的升高而降低。對于酸性食品，其pH低于4.6，大多數(shù)芽孢不會萌發(fā)且生長受到抑制，當生孢梭菌芽孢在pH值為5時，萌發(fā)率最高達到最高，但在pH值為4時，萌發(fā)率并沒有大幅度降低，可能是因為實驗操作過程中，調節(jié)降低pH值時，花費時間較長，使部分芽孢在調節(jié)pH值時就已經萌發(fā)。

圖4 不同pH值對芽孢萌發(fā)率的影響Fig.4 Effect of different pH on spore germination rate

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

用Box-Behnken設計原理設計試驗結果，以溫度（A）、時間（B）、pH值（C）為自變量，以生孢梭菌的芽孢萌發(fā)率為結果分析值，運用響應面測試結果，見表2。

利用Box-Behnken使用方法原理得出實驗結果，再利用Design Expeart 7.0分析軟件對肉毒梭狀芽孢桿菌芽孢萌發(fā)率回歸性總結分析和方差分析，見表3。

表2 響應面分析實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

表3 二次響應面回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic response surface regression model

據(jù)表3，理論模型p<0.05，芽孢萌發(fā)率的系數(shù)R2=0.9816，調整R2=0.9580，說明理論模型顯著，非試驗因素的影響較??；失擬項p=0.1 064＞0.05，不顯著，可以說明模型比較可信。所以可以用該模型理論值和對具體結果進行測試和結果值預測。獲得的芽孢萌發(fā)率Y對自變量水浴溫度（A）、水浴時間（B）和pH值（C）的多元回歸方程：

此方程說明生孢梭菌萌發(fā)率與3個不同自變量的相關性顯著，試驗結果可靠。

通過響應面的數(shù)字組合分析得到芽孢萌發(fā)的最佳條件為：當溫度80.90 ℃，時間20.72 min，pH值4.69時，生孢梭菌芽孢萌發(fā)率最高達到80.00%。

2.3 響應曲面圖和等高線圖分析

2.3.1 溫度和時間兩兩因子交互作用

圖5 溫度和時間響應曲面圖Fig.5 Temperature and time response surface diagram

圖6 溫度和時間等高線圖Fig.6 Temperature and time contour plot

由圖5和6可知，該響應面的坡度大且等高線的形狀不圓但較扁，說明時間溫度的交互作用很強。溫度坡度更大且等高線聚積，說明溫度對芽孢萌發(fā)率的影響更大。

2.3.2 溫度和pH值兩兩因子交互作用

由圖7和8可知，溫度和pH值的交互作用響應面等高圖的等高線呈圓形，說明其交互作用不顯著。pH值坡度更大且等高線聚積，說明pH值對芽孢萌發(fā)率的影響更大。

圖7 溫度和pH值響應曲面圖Fig.7 Response surface diagram of temperature and pH values

圖8 溫度和pH值等高線圖Fig.8 Temperature and pH contour plot

圖9 時間和pH值響應曲面圖Fig.9 Time and pH response surface graph

圖10 時間和pH值等高線圖Fig.10 Time and pH contour plot

2.3.3 時間和pH值兩兩因子交互作用

由圖9和10可知，時間和pH值的交互作用響應面等高圖的等高線形狀較圓。pH值坡度更大且等高線聚積，說明pH值對芽孢萌發(fā)率的影響更大。

2.4 響應面驗證試驗

通過Design-Expert軟件對回歸方程分析，得到溫度為80.90 ℃，時間為20.72 min，pH值為4.69時，生孢梭菌芽孢萌發(fā)率最高達到80.00%。為了驗證該方法的可靠性并考慮到實際情況,將最佳工藝參數(shù)修正為溫度為80 ℃，時間為21 min，pH值為4.7，在此條件下進行驗證試驗，重復三次，芽孢平均萌發(fā)率為79.66%，理論值和試驗值相差不大,說明模型可以較好地模擬和預測生孢梭菌芽孢萌發(fā)率,從而也證明了采用響應面法優(yōu)化生孢梭菌芽孢萌發(fā)條件參數(shù)的可行性。

3 結論

3.1 單因素實驗的最佳條件為：溫度80 ℃、時間21 min、pH值為5。通過單因素實驗，找到了各個影響因素的最佳范圍，并對其用了3因素3水平的響應面法實驗設計優(yōu)化生孢梭菌芽孢萌發(fā)條件。根據(jù)響應面法得到生孢梭菌芽孢優(yōu)化的最佳條件為溫度80.90 ℃、時間20.72 min、pH值為4.69時，生孢梭菌的芽孢最高萌發(fā)率達到80%，還有一部分芽孢沒有萌發(fā)，原因可能是剩余芽孢為“超級芽孢”很難萌發(fā)。

3.2 生孢梭菌（肉毒梭菌）作為肉制品和罐頭食品中的主要致病菌之一，近年來逐漸引起許多國內外學者的關注和重視。雖然高溫高壓等條件可以達到殺滅生孢梭菌的目的，但不僅容易破壞產品品質，且生孢梭菌具有高度的可逆性，找到一種更佳的殺菌方式仍是當前食品工業(yè)所面臨的嚴峻考驗。近年來隨著人民生活水平的逐漸提高，全世界對食品安全問題的關注度的提高，滅活食品中的致病菌是今后食品行業(yè)的重點方向。本文試驗可結合芽孢萌發(fā)機理，利用芽孢的最佳萌發(fā)條件，為殺滅芽孢這一難題提供了新思路和低強度殺菌的可行性，對提高食品的安全性，將其應用于低酸性罐頭食品的殺菌有重要意義和實際應用價值。