納米乳液提高氧化白藜蘆醇口服生物利用率及透皮吸收效率

李俊，王群，劉果，苗建銀，謝琳，曹庸

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）（2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）（3.廣州佳潔化妝品有限公司，廣東廣州 510450）

氧化白藜蘆醇（Oxyresveratrol，OXY）是一種具有多種生物活性的天然植物提取物，屬于反式羥基取代的二苯乙烯芪類化合物，在中國廣泛分布于菠蘿蜜、?？?、百合科、片麻巖科等植物的根、葉、莖和果實(shí)中[1]。含OXY的代表植物有菠蘿蜜（Artocarpus lakoocha）、桑樹（Morus albaL.）、紫檀科、藜蘆（百合科）、三棱草（莎草科）、菝葜屬（菝葜科）等。OXY因含有多個(gè)酚羥基，具有較強(qiáng)的抗氧化作用[2]，同時(shí)還具有其他生物活性，如抑制酪氨酸酶[3]、抗炎消腫[4]、抗腫瘤、抗高血脂[5,6]、中樞神經(jīng)保護(hù)[7]及帕金森癥的改善[8]等生物活性，廣泛用于營養(yǎng)保健及防止食品褐變領(lǐng)域。氧化白藜蘆醇的中等極性導(dǎo)致其水溶性較差，幾乎不溶于水，在口服給藥或經(jīng)皮給藥方面存在一定的局限性，主要是由于它的中間滲透性、主動(dòng)外排介導(dǎo)機(jī)制，使其進(jìn)入體內(nèi)在肝臟代謝作用下迅速從體內(nèi)排出[9]，導(dǎo)致口服生物利用率低，極大地限制了氧化白藜蘆醇的臨床應(yīng)用。

生物利用率是指活性物質(zhì)攝入人體后，經(jīng)胃液消化后進(jìn)入內(nèi)循環(huán)或被人體存儲的速度和程度。活性物質(zhì)的特性，胃腸道環(huán)境及自身的消化能力都會影響生物活性物質(zhì)在人體的消化吸收率。很多學(xué)者采用脂質(zhì)體包埋、環(huán)糊精包合或納米乳液等方法提高活性物質(zhì)溶解度，促進(jìn)難溶活性物質(zhì)的滲透作用[10]，有效達(dá)到作用位點(diǎn)，從而提高難溶物質(zhì)的生物利用率[11]。氧化白藜蘆醇的多種生物活性由于溶解度的限制極大地受到影響，目前，對于氧化白藜蘆醇提高生物利用率的研究較少，對其同系物白藜蘆醇的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，使用α-、β-和γ-環(huán)糊精形成的包合物都可一定程度上增加白藜蘆醇的水溶性，但在所有天然環(huán)糊精中，β-環(huán)糊精與白藜蘆醇的復(fù)合能力最強(qiáng)[12,13]。對氧化白藜蘆醇生物利用率的提高有學(xué)者采用固體脂質(zhì)體包埋技術(shù)改變其溶解度，從而提高生物利用率[14,15]。納米乳液被認(rèn)為是疏水物質(zhì)的良好載體，被廣泛用于脂類物質(zhì)的腸外給藥，例如紫杉醇和氯霉素等抗癌靜脈注射藥物[16,17]。有學(xué)者通過制備白藜蘆醇納米乳液、納米凝膠系統(tǒng)研究體內(nèi)外氧化應(yīng)激損傷的改善作用[18-20]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用不同的方法制備氧化白藜蘆醇納米乳液改變其溶解性，希望可以提高氧化白藜蘆醇的透皮吸收和口服生物利用率，并對其吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過程進(jìn)行體外消化模擬和擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模擬，為氧化白藜蘆醇的體內(nèi)外應(yīng)用奠定科研基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

氧化白藜蘆醇：實(shí)驗(yàn)室分離純化，純度＞95%；中鏈甘油三酸脂（Medium Chain Triglycerides，MCT）購于美國Stepan公司；卵磷脂購于美國Lecithin公司；高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High Glucose，DMEM）、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、PBS和HBSS緩沖液購于美國Gibico公司；HPLC用色譜純甲醇購于天轁化工；香豆素6購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其它實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

細(xì)胞株：Caco-2細(xì)胞，購于美國ATCC公司。

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物皮膚購于沃爾瑪超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī)、島津LC-15C高效液相色譜分析儀、Sotax智能藥物溶出實(shí)驗(yàn)儀，垂直式Franz cell透皮擴(kuò)散儀，德國Zeiss激光共聚焦顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 氧化白藜蘆醇的液相分析檢測

將樣品用甲醇溶解，超聲震蕩，溶解完全后，過0.45 μm微孔濾膜，避光冷藏，準(zhǔn)備上樣。色譜柱為島津反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇和0.1%磷酸水溶液；檢測波長328 nm；室溫；進(jìn)樣體積20 μL；流速1.0 mL/min。采用梯度洗脫，甲醇在0～12 min濃度保持17%，20～27 min線性升至90%，27～33 min降至17%[21]。

1.3.2 氧化白藜蘆醇納米乳液的制備

氧化白藜蘆醇納米乳液（OXY-E）的制備流程主要分為以下幾個(gè)步驟：（1）將乳化劑（卵磷脂、吐溫等）溶于去離子水中，磁力攪拌或快速攪拌狀態(tài)下溶解完全，稱為水相；（2）將氧化白藜蘆醇在加熱狀態(tài)下溶于MCT，冷卻至室溫備用，稱為油相；（3）水相保持5000 r/min快速攪拌，將油相緩慢加入水相，并持續(xù)快速攪拌（5000 r/min），油相完全加入后將速度升至20000 r/min，攪拌10 min，每隔1 min暫停10 s，形成氧化白藜蘆醇均勻乳液；（4）將高速攪拌后的乳液加入清洗好的高壓均質(zhì)機(jī)內(nèi)，在高于500 Mpa的壓力下，高壓均質(zhì)3個(gè)循環(huán)，得到氧化白藜蘆醇納米乳液，稀釋1000倍后進(jìn)行粒徑測試。

1.3.3 氧化白藜蘆醇體外溶出實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[22]并進(jìn)行了優(yōu)化，分別用去離子水配制堿性緩沖劑（6.805 g/L KH2PO4+0.896 g/L NaOH）和1%的吐溫80溶液，分別將吸液管和排出管放入1%的吐溫80溶液中，將溶出儀提前預(yù)熱至37 ℃，水浴循環(huán)運(yùn)行20 min。在上樣池將1 mL樣品加入至滲透膜的空腔中，開始模擬消化實(shí)驗(yàn)，于0.5、1、2、4、6、8、12、24 h的時(shí)間點(diǎn)分別從排出液接收瓶中取樣0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)充0.5 mL吐溫80溶液（1%），實(shí)驗(yàn)前2 h的緩沖液是由1%吐溫80溶液配制1 N的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至1.2，模擬胃部的酸性環(huán)境，2 h之后加入堿性緩沖液調(diào)節(jié)pH至6.8，模擬由胃到小腸的環(huán)境，將取出的樣品中加入0.5 mL乙醇，超聲、混勻、過膜后采用HPLC檢測氧化白藜蘆醇的含量。

1.3.4 體外脂解實(shí)驗(yàn)

表1 體外模擬消化液的成分表Table 1 The composition of lipolysis buffer in vitro

脂解過程主要是負(fù)責(zé)三酰甘油（Triacylgycerol，TAG）分解代謝的生化途徑，包括長鏈脂肪酸和甘油主鏈之間的酯鍵水解以及游離脂肪酸的釋放，此模型為一個(gè)動(dòng)態(tài)的體外脂解模型，形象地模擬了體內(nèi)脂類消化的過程。體外脂解實(shí)驗(yàn)（Lipolysis）的方法參照文獻(xiàn)[23]，具體實(shí)驗(yàn)步驟為：將胰蛋白酶于冰箱拿出提前回溫至室溫，調(diào)整油浴至37 ℃保持穩(wěn)定。將1 g胰蛋白酶溶于5 mL預(yù)冷的緩沖溶液中，攪拌15 min后2000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清，置于冰上，備用。將相當(dāng)于250 mg油相的樣品添加至9 mL的模擬消化液（表1）中在37 ℃油浴中孵育10 min，保持溫度恒定，用0.25 M的NaOH調(diào)消化液pH為7.5。向樣品中加入1 mL的胰蛋白酶立刻開始滴定，保持pH在7.50±0.02波動(dòng)。連續(xù)滴定2 h，記錄消耗的NaOH的量，消化完后立刻將樣品置于冰上。用低溫超高速離心機(jī)在4 ℃，以50000 r/min的轉(zhuǎn)速離心40 min，將離心后的中間相移至另一干凈的離心管中，冷藏保存。將樣品過膜處理，取200 μL中間相樣品與400 μL的DMSO振搖混勻后，進(jìn)行HPLC含量分析，參照文獻(xiàn)計(jì)算生物利用度和脂肪分解度[10]。

1.3.5 體外模擬小腸上皮細(xì)胞Caco-2攝取實(shí)驗(yàn)

Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)條件為：采用含有10%胎牛血清、1%雙抗和1%非必需氨基酸的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、相對濕度95%、5% CO2條件下的生物培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。Caco-2模擬小腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)驗(yàn)方法[24,25]，采用生長分化至30代以后的Caco-2細(xì)胞株，待細(xì)胞分化融合達(dá)到80%后，用胰酶消化，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為按1.5×105cells/mL，接種于12孔板的Transwell小池中，Transwell的上層（AP側(cè)）加細(xì)胞液0.5 mL，同時(shí)在Transwell的底層（BL側(cè)）加入1.5 mL培養(yǎng)基。隔天更換培養(yǎng)基，每隔一天測定其跨膜電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER），觀察細(xì)胞形態(tài)，連續(xù)培養(yǎng)21 d后，測定電阻值判斷是否符合跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的條件。

用電阻儀進(jìn)行跨膜電阻的測定，使用前先將電極在培養(yǎng)基中平衡2 h后再用酒精消毒，室溫放置，最后再緩沖液中平衡15 min。將電極兩點(diǎn)分別置于上下池中，每孔檢測三次，記錄電阻值?？缒る娮璺蠗l件者被納入細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，采用如下公式計(jì)算跨膜上皮細(xì)胞電阻：

TEER=（測得的電阻值-空白培養(yǎng)皿電阻值）×插入式培養(yǎng)皿的有效膜表面積A

其中：TEER單位Ω×cm2，單層膜表面積A=1.1 cm2。

單細(xì)胞模型建好后，按照以下步驟進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)：首先用HBSS緩沖液洗兩遍，再在37 ℃搖床中孵育15 min。將經(jīng)過模擬胃液消化后的氧化白藜蘆醇樣品和納米乳液樣品加于細(xì)胞單層膜上，分別考察AP-BL和BL-AP兩個(gè)方向的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)情況。每隔20 min取一次樣，共作用2 h，對樣品進(jìn)行前處理后，上HPLC液相分析氧化白藜蘆醇的含量。

1.3.6 可視化監(jiān)測Caco-2細(xì)胞攝取

通過激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）可定性觀察Caco-2細(xì)胞對氧化白藜蘆醇納米乳液的攝取情況，了解作用過程中細(xì)胞形態(tài)的變化[26]，具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

將細(xì)胞懸浮液分別接種于鋪有細(xì)胞爬片的12孔板中，接種密度為1×105cells/孔。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，以時(shí)間倒序的方式加入香豆素6標(biāo)記的氧化白藜蘆醇納米乳液（香豆素的濃度在2～4 μg/mL），氧化白藜蘆醇上樣濃度與Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)相同，分別在0.5、1、2、3、6 h時(shí)間段加入熒光標(biāo)記物，作用時(shí)間結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS反復(fù)洗3次，再用4%多聚甲醛固定15 min后，將多聚甲醛棄掉，用10 μg/mL的DAPI（4′,6′-diamidino-2-phenyl-indole）標(biāo)記細(xì)胞核30 min，用預(yù)冷的PBS反復(fù)洗3次后，將細(xì)胞爬片轉(zhuǎn)移到載玻片上，置于CLSM觀察。

1.3.7 透皮吸收實(shí)驗(yàn)

Transdermal Drug Delivery Systems（TDDS）經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，被廣泛用于檢測配方藥物在皮膚的吸收情況[27]。本文采用的儀器為垂直式Franz Cell全自動(dòng)透皮擴(kuò)散儀研究氧化白藜蘆醇納米乳液在皮膚表面的滲透吸收并通過激光共聚焦方法可視化監(jiān)測藥物經(jīng)皮擴(kuò)散的過程。

Franz cell透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)操作參照文獻(xiàn)[28]，步驟如下：首先，配制含有5%吐溫80的PBS緩沖液（pH 7.4）作為接收液加入至Franz cell接收池中至刻度線。然后，將豬肩部位的皮膚去除皮下脂肪，根據(jù)接收池的大小用解剖刀分成等大的皮膚小塊，于-80 ℃冰箱保存，使用之前在PBS中水浴水溫至37 ℃，保持10 min。系統(tǒng)提前升溫至37 ℃，接收液持續(xù)進(jìn)行磁力攪拌，將經(jīng)過PBS處理后的皮膚樣品置于給藥池底部，保持皮膚表皮面朝上，將皮膚夾在給藥池和接收池中間。隨后，將樣品加于給藥池的皮膚表面，在不同時(shí)間點(diǎn)于取樣口取樣200 μL，并補(bǔ)充200 μL的緩沖液，將取到的樣品通過高效液相檢測含量，取樣間隔時(shí)間點(diǎn)分別為0、0.5、1、2、4、8、12和24 h。實(shí)驗(yàn)完成后，將皮膚組織從透皮擴(kuò)散儀取下，對其進(jìn)行米字型剪切后用80%乙醇沸水浴萃取30 min后，取萃取液進(jìn)行HPLC檢測，用以分析皮膚組織內(nèi)部滯留樣品含量[29]。

物質(zhì)滲透后皮膚組織上的滯留量：

其中：A是有效的滲透擴(kuò)散面積；V是萃取液的總體積；C是活性物質(zhì)在萃取液中的質(zhì)量含量。

物質(zhì)累積皮膚滲透量：

其中：A是有效的滲透擴(kuò)散面積；V是總的透過皮膚的溶液；Cn是在第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)接收池中物質(zhì)的質(zhì)量濃度；Ci是第i個(gè)樣品的質(zhì)量濃度，Vi是第i個(gè)樣品的體積。

1.3.8 透皮吸收可視化監(jiān)測

為了觀察氧化白藜蘆醇納米乳液在皮膚表面的滲透、吸收情況，采用激光共聚焦方法監(jiān)測透皮吸收過程，具體實(shí)驗(yàn)流程：按照Franz cell透皮擴(kuò)散操作步驟，將氧化白藜蘆醇納米乳液用尼羅紅染色后，給藥池中加樣后，在1、6、12 h分別中斷擴(kuò)散，取下動(dòng)物皮膚組織，用緩沖液將皮膚表面輕輕沖洗干凈，用OCT（Optimal Cutting Temperature Compound）包埋后置于-20 ℃冰箱固定，備用。用冷凍切片機(jī)沿皮膚的橫斷面連續(xù)切3～5片8 μm厚的薄片，鋪于帶靜電的載玻片上，將DAPI染色液滴于皮膚組織上染色20 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007、Origin 8.6、GraphPad Prism 5、和PASW Statistics 18軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的方式表達(dá)，數(shù)據(jù)圖的結(jié)果用誤差棒（Error Bar）表示標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，不同字母表示顯著性差異（p＜0.05），數(shù)值表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（n=3）。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化白藜蘆醇納米乳液粒徑分布

納米乳液作為非平衡體系，不能自發(fā)形成，需要通過外界的能量輸入（物理的機(jī)械作用力或化合物的電荷作用），通常使用高速剪切攪拌、高壓均質(zhì)或超聲波等方法產(chǎn)生強(qiáng)烈的破壞力，混合并破壞油相和水相體系，進(jìn)而導(dǎo)致較大的液滴被分解成較小的液滴形成納米乳液[30]，通過本實(shí)驗(yàn)方法制備的氧化白藜蘆醇納米乳液用蒸餾水稀釋后通過馬爾文激光粒度儀測定乳液的粒徑分布。納米乳液粒徑分布分散系數(shù)（Polydispersity，PDI），PDI是評價(jià)納米乳液分散性的指標(biāo)，其數(shù)值越小，說明分散性越好，PDI＜0.5的粒子分散性良好。粒子質(zhì)量（Sample Quality）是由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的數(shù)字相關(guān)器根據(jù)測定溶液中懸浮顆粒的擴(kuò)散速度、顆粒大小變化導(dǎo)致散射光強(qiáng)波動(dòng)信號轉(zhuǎn)化的相關(guān)函數(shù)計(jì)算分析的結(jié)果，可以得出乳液中離子的擴(kuò)散系數(shù)和粒徑的大小分布情況。

表2 納米乳液的粒徑分布Table 2 The particle size of nano-emulsion

表2結(jié)果顯示吐溫80作為乳化劑制備的納米乳液粒徑（111 nm）顯著低于吐溫20（256.23 nm）和吐溫40（298.87 nm）的，選用2%卵磷脂為乳化劑的乳液粒徑比吐溫系列的顯著變?。╬＜0.05），由表2中PDI和粒子質(zhì)量數(shù)據(jù)表明，采用卵磷脂制備的納米乳液粒徑均勻，分散性良好（PDI＜0.5），粒子質(zhì)量良好，2%卵磷脂制備的氧化白藜蘆醇納米乳液的粒徑最小，達(dá)到84 nm，因此選擇氧化白藜蘆醇納米乳液的乳化體系為2%卵磷脂，納米乳液氧化白藜蘆醇含量經(jīng)HPLC檢測結(jié)果為10.15 mg/mL。

2.2 氧化白藜蘆醇體外溶出及釋藥擬合

圖1 OXY體外藥物溶出及釋藥擬合曲線Fig.1 Dissolution profiles and drug release fitting curve of OXY

活性物質(zhì)經(jīng)口服進(jìn)入人體后，包埋的活性成分要首先通過胃腸道吸收進(jìn)入血液再進(jìn)一步分布到體內(nèi)的靶向器官或組織，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生理生化反應(yīng)，起到治療疾病的作用。氧化白藜蘆醇納米乳液口服給藥的體外消化實(shí)驗(yàn)分為胃液消化和腸液消化兩個(gè)階段。本實(shí)驗(yàn)采用Sotax USP-4藥物溶出儀，相同濃度的氧化白藜蘆醇懸浮液和納米乳液各1 mL分別置于藥物溶出儀的給藥池中，在連續(xù)的兩個(gè)pH環(huán)境下，模擬和分析氧化白藜蘆醇納米乳液在胃腸內(nèi)的釋放。初始的2 h，緩沖液pH為1.2模擬胃部的消化環(huán)境，2 h以后調(diào)整pH至6.8，模擬小腸內(nèi)的消化吸收。氧化白藜蘆醇在不同時(shí)間點(diǎn)的釋放量如圖1a所示，在2 h OXY納米乳液和懸浮液在胃液中的釋放量分別為35.07%和17.63%，OXY在納米乳液中的釋放量是懸浮液中的2倍。2 h后隨著pH的升高，OXY在小腸的釋放顯著升高（p＜0.01），4 h時(shí)OXY在納米乳液的釋放量達(dá)到65.32%，12 h后釋放速度趨于平緩，24 h OXY納米乳液和懸浮液在腸液中的釋放量分別為95.25%和68.34%，納米乳液顯著地提高了氧化白藜蘆醇在胃和腸的藥物釋放量（p＜0.05）。

分別采用一級釋藥模型、Korsemeyer-Peppas模型和零級釋藥模型對氧化白藜蘆醇納米乳液在不同時(shí)間點(diǎn)的溶出數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明Korsemeyer-Peppas的擬合效果最好，R2=0.9801，藥物釋放計(jì)算公式：

其中：n為擴(kuò)散指數(shù)，n=0.3972表示本實(shí)驗(yàn)條件下氧化白藜蘆醇納米乳液的藥物釋放主要受到Fickian擴(kuò)散的影響[31]。

李曉芳等[32]制備的黃豆苷元固體分散體可以顯著提高難溶性藥物的溶出速率，比原料藥本身提升了6倍，其體外釋藥動(dòng)力學(xué)符合Korsemeyer-Peppas模型。

2.3 氧化白藜蘆醇體外脂解實(shí)驗(yàn)

圖2 氧化白藜蘆醇及其納米乳液體外脂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對比Fig.2 Comparison of in vitro lipolysis result of OXY, OXY loaded MCT and OXY nano-emulsion

將氧化白藜蘆醇納米乳液（OXY-E），氧化白藜蘆醇油相（OXY-MCT）和氧化白藜蘆醇懸浮液（OXY）分別在進(jìn)食和禁食狀態(tài)下進(jìn)行脂解實(shí)驗(yàn)，樣品處理后經(jīng)液相檢測計(jì)算得到氧化白藜蘆醇的生物利用率進(jìn)食狀態(tài)下分別為61.22%，52.83%和23.47%，禁食狀態(tài)下為56.12%，45.59%和22.45%（圖2a），結(jié)果顯示氧化白藜蘆醇納米乳液比化合物本身的生物利用率提升了3倍，升高的原因主要是由于MCT的快速消化能力及乳液對氧化白藜蘆醇溶解度的提高。另外從OXY-E和OXY-MCT的溶脂程度可以看出，在禁食狀態(tài)下脂解的程度分別為86.12%和68.59%，而在進(jìn)食狀態(tài)下二者都有升高，脂解程度分別為98.22%和72.83%，OXY-E的脂解程度顯著高于OXY直接溶于MCT中（p＜0.05）。

因此表明氧化白藜蘆醇納米乳液具有更徹底的脂質(zhì)消化和更持久的脂解速率，這可能是由于納米乳液在脂肪酶催化脂肪水解后形成了更小的粒徑，增大了其比表面積[15]，使消化更徹底。結(jié)果表明所有樣品在進(jìn)食狀態(tài)下的生物利用率和脂解程度顯著高于禁食狀態(tài)的，意味著在OXY納米乳液口服使用時(shí)應(yīng)和膳食一起服用，以保證較高的生物利用率[23]，因此通過制備氧化白藜蘆醇納米乳液可以有效地提高氧化白藜蘆醇的生物利用率。納米乳液在溶解親油性活性物質(zhì)方面非常有效，納米乳液給藥系統(tǒng)的粒徑非常小，在口服、腸外、眼部和局部途徑給藥藥物遞送方面可提高一些親脂性食品或藥物成分的生物利用率。有研究報(bào)道納米乳液O/W型納米乳液可以提高維生素類疏水食品活性成分在腸道的釋放量，從而提高其生物利用率[33]。

2.4 氧化白藜蘆醇納米乳液Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果

在進(jìn)行Caco-2細(xì)胞單層模型轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)之前，首先要確定氧化白藜蘆醇及其乳液的消化液作用于Caco-2細(xì)胞的安全劑量。因此需要進(jìn)行Caco-2細(xì)胞的安全毒理測試，本文采用MTT法對不同濃度氧化白藜蘆醇及其乳液處理的細(xì)胞的存活率進(jìn)行檢測。

由圖3a MTT方法測定的Caco-2細(xì)胞的存活率可以看出，濃度在2.5～20 μg/mL范圍內(nèi)的氧化白藜蘆醇及其乳液的消化液作用后Caco-2細(xì)胞的存活率均在90%以上，且空載的乳液作用后Caco-2細(xì)胞的存活率也在90%以上，表明此范圍物質(zhì)及其乳液的空載壁材對Caco-2細(xì)胞是安全無毒的。

對于口服藥物來說，小腸是吸收的主要場所，因此藥物的跨腸道表皮細(xì)胞滲透是產(chǎn)生藥效的決定性環(huán)節(jié)。藥物通過被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)、載體媒介轉(zhuǎn)運(yùn)、膜動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞旁路通道轉(zhuǎn)運(yùn)4種機(jī)制經(jīng)過胃腸道上皮細(xì)胞被轉(zhuǎn)運(yùn)。藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，一般通過一種或多種轉(zhuǎn)運(yùn)形式，了解藥物在體內(nèi)吸收的機(jī)制、速度和程度，尤其對于口服生物利用度較低的藥物，研究影響其吸收的因素，對于改善物的吸收性質(zhì)，提高藥物的臨床療效具有重要的意義。因此本實(shí)驗(yàn)對氧化白藜蘆醇在小腸壁兩側(cè)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行研究，了解納米乳液對于吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速度的影響，明確其轉(zhuǎn)運(yùn)方式。納米乳液提高生物利用率主要與活性物質(zhì)的運(yùn)載量、乳液穩(wěn)定性、可控釋放和小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效率有關(guān)。Lu等[10]將水溶性極差的姜黃素，制備成以有機(jī)凝膠為油相的納米體系，極大地提升了體外脂解的速度，并通過Caco-2模擬小腸上皮細(xì)胞模擬研究了姜黃素納米乳液的主要吸收機(jī)制，通過小鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明姜黃素納米乳液的口服生物利用率提升了9倍。

圖3 Caco-2單細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results of Caco-2 transport experiment

由圖3b中可以看出，氧化白藜蘆醇樣品從AP側(cè)加樣，加樣量為0.5 mL，乳液樣品透過量為2.69 μg，占上樣量的31.98%，氧化白藜蘆醇透過量1.62 μg，占上樣量的17.5%，可以看出從AP至BL側(cè)方向，乳液滲透速率大于氧化白藜蘆醇物質(zhì)本身；另外氧化白藜蘆醇從BL側(cè)加樣（圖3c），加樣量為1.5 mL，乳液的透過量1.42 μg，占上樣量的5.62%，氧化白藜蘆醇透過量0.52 μg，占上樣量的1.86%，總的來說AP側(cè)向BL側(cè)的滲透速率大于BL向AP方向的，OXY-E樣品的透過量明顯高于OXY樣品，因此，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，氧化白藜蘆醇的納米乳液可以顯著提升其在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量（p＜0.05），轉(zhuǎn)運(yùn)量提升2～4倍。

對于Caco-2單層細(xì)胞模擬小腸吸收模型，滲透速率低于10-7cm/sec為慢速滲透，介于10-7cm/sec和10-6cm/sec為中速，大于10-6cm/sec為快速吸收，表觀滲透因子ER小于1/2則轉(zhuǎn)運(yùn)模式為主動(dòng)外排機(jī)制，ER介于1/2和2之間為被動(dòng)滲透機(jī)制，ER大于2為主動(dòng)吸收機(jī)制。由圖3d氧化白藜蘆醇及其乳液作用于Caco-2單細(xì)胞層2 h后，OXY樣品的滲透速率分別為Papp（AP-BL）值4.95×10-6cm/sec和Papp（BL-AP）值3.30×10-6cm/sec，則其表觀滲透因子ER=Rpapp（AP-BL）/（BL-AP）=1.49，OXY為中等速度，推測為被動(dòng)滲透，對于OXY-E消化后的樣品的滲透速率Papp（AP-BL）值1.69×10-5cm/sec和Papp(BL-AP)值8.94×10-6cm/sec，表觀滲透系數(shù)ER=Rpapp（AP-BL）/(BL-AP）=1.89，OXY-E的滲透速度上升至快速，同樣為被動(dòng)滲透。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OXY-E乳液樣品的滲透速度明顯高于氧化白藜蘆醇樣品自身的，極大地提高了OXY在小腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)速率和吸收效果（p＜0.01）。胡婷婷等[34]利用Caco-2細(xì)胞模型研究8-異丙胺亞甲基橙皮素（IPHP）在小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，分別對其作用濃度、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速度和轉(zhuǎn)運(yùn)方式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，IPHP在Caco-2細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是被動(dòng)擴(kuò)散，且其轉(zhuǎn)運(yùn)不受P-gp外排蛋白的影響。

2.5 氧化白藜蘆醇納米乳液Caco-2細(xì)胞攝取

圖4 氧化白藜蘆醇對Caco-2細(xì)胞的攝取Fig.4 Uptake of OXY-E in Caco-2 cells

通過氧化白藜蘆醇作用于Caco-2單細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)表明氧化白藜蘆醇納米乳液在2 h內(nèi)可以極大地提高其在小腸上皮細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)速度，為了進(jìn)一步觀察氧化白藜蘆醇納米乳液與Caco-2細(xì)胞作用過程中進(jìn)入細(xì)胞的速度和對細(xì)胞形態(tài)變化的影響，將氧化白藜蘆醇納米乳液用香豆素6染色后進(jìn)行體外模擬脂解消化再作用于Caco-2細(xì)胞，細(xì)胞核用DAPI染色，在氧化白藜蘆醇納米乳液作用不同時(shí)間段觀察物質(zhì)進(jìn)入Caco-2細(xì)胞的量和細(xì)胞的狀態(tài)。

由圖4b可以看出氧化白藜蘆醇作用0.5 h后有微弱的綠色熒光出現(xiàn)，表明物質(zhì)開始進(jìn)入細(xì)胞核，隨著時(shí)間的增長綠色熒光逐漸增強(qiáng)，消化后乳液透過速度較快，大概2 h熒光達(dá)到最強(qiáng)，圖4a結(jié)果顯示，0.5 h進(jìn)入Caco-2細(xì)胞中乳液的熒光強(qiáng)度占細(xì)胞核總熒光強(qiáng)度的比值為14.38%，1 h和2 h占比顯著增強(qiáng)（p＜0.01），分別為23.79%和38.36%。2 h時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)OXY-E的熒光占比最高，3 h和6 h的熒光強(qiáng)度占比與2 h無顯著差異，與細(xì)胞的激光共聚焦圖的熒光強(qiáng)度結(jié)果一致，表明2 h時(shí)，OXY-E在Caco-2細(xì)胞的吸收達(dá)到最高，且細(xì)胞形態(tài)保持良好，通過本實(shí)驗(yàn)可以觀察物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度與氧化白藜蘆醇納米乳液細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的選擇符合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化白藜蘆醇納米乳液作用Caco-2細(xì)胞2 h后，吸收達(dá)到最強(qiáng)。

2.6 氧化白藜蘆醇納米乳液對透皮吸收的作用

由于黑色素細(xì)胞集中在表皮的最底層，藥物透過皮膚表皮屏障到達(dá)真皮的交界處才可有效發(fā)揮作用。為了使藥物具有更好的皮膚滲透性，很多研究者對促透體系進(jìn)行研究，并通過經(jīng)皮給藥體系（Franz cell透皮擴(kuò)散儀）研究活性物質(zhì)的透皮吸收性能[27]。

氧化白藜蘆醇納米乳液和氧化白藜蘆醇懸浮液分別作用于Franz cell的皮膚組織上，在0.5、1.0、2.0、3.0、6.0、9.0和12.0 h分別取樣檢測氧化白藜蘆醇的透過量，圖5a顯示納米乳液可顯著提高氧化白藜蘆醇的皮膚透過量，1 h氧化白藜蘆醇透過量極低，納米乳液和懸浮液的透過量分別為13.28和2.08 μg/cm2skin，6 h時(shí)透過量顯著增加，納米乳液和懸浮液的透過量分別為51.76和5.73 μg/cm2skin，12 h時(shí)皮膚組織在溶液的浸泡下開始溶脹，透過量比6 h顯著增加，納米乳液和懸浮液的透過量分別為86.85和9.49 μg/cm2skin，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米乳液可以顯著提高氧化白藜蘆醇的透皮吸收效率。

分別采用一級釋藥模型、Higuchi模型、Korsemeyer-Peppas模型和零級釋藥模型對氧化白藜蘆醇納米乳液在不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚透過量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明Higuchi模型的擬合效果最好，如圖5b所示，R2=0.9934，表明藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)是由Fickian擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)的，Higuchi模型是根據(jù)Fick定律對時(shí)間的算術(shù)平方根推算的，在分析藥物經(jīng)皮貼片、局部軟膏和類似系統(tǒng)活性物質(zhì)的藥物運(yùn)轉(zhuǎn)方面非常適用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Higuchi模型適用于描述氧化白藜蘆醇納米乳液的局部釋放過程[35,36]。

圖5 氧化白藜蘆醇納米乳液皮膚透皮吸收過程Fig.5 Skin transdermal absorption process of OXY

由圖5c中可以看出，藍(lán)色熒光為豬皮的皮膚組織的橫斷面，經(jīng)熒光染色的氧化白藜蘆醇納米乳液作用于皮膚后，1 h開始進(jìn)行皮膚表皮上層，根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果在6 h時(shí)開始透過皮膚表皮層進(jìn)入體液循環(huán)，從6 h的皮膚組織可以看出氧化白藜蘆醇乳液已經(jīng)開始有部分到達(dá)表皮和真皮的交界處，12 h后紅色熒光物質(zhì)充滿整個(gè)表皮層，說明物質(zhì)在表皮層和真皮層已經(jīng)開始積累和透過，且由圖中可以看出12 h是皮膚組織開始變得有些松散，不夠緊致，12 h后的皮膚組織已經(jīng)開始變形。通過體外透皮吸收研究表明納米乳液可顯著提高氧化白藜蘆醇的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)量，使活性物有效達(dá)到表皮基底層，發(fā)揮作用。

由氧化白藜蘆醇納米乳液透皮吸收及可視化實(shí)驗(yàn)可以看出，納米乳液可以增強(qiáng)氧化白藜蘆醇往皮膚深層的擴(kuò)散，因此有助于氧化白藜蘆醇天然化妝品配方設(shè)計(jì)。氧化白藜蘆醇納米乳液如納米級液滴、粘度低、透明度高的特性非常適合化妝品配方體系[30]。同時(shí)由于對氧化白藜蘆醇的包埋，增強(qiáng)了它的理化穩(wěn)定性，因此納米乳液的制備使氧化白藜蘆醇在藥劑配方、食品原料和化妝品原料的給藥體系有更廣闊的應(yīng)用前景[37]。

3 結(jié)論

本文采用MCT和卵磷脂制備氧化白藜蘆醇納米乳液，并對其口服生物利用率及透皮吸收性能進(jìn)行研究，得到以下結(jié)論：

3.1 納米乳液顯著地提高了氧化白藜蘆醇在胃和腸的藥物釋放量，氧化白藜蘆醇納米乳液的藥物釋放符合Korsemeyer-Peppas釋藥動(dòng)力學(xué)模型，過程主要受到Fickian擴(kuò)散的影響。

3.2 氧化白藜蘆醇納米乳液顯著地提高了氧化白藜蘆醇的口服生物利用率，在模擬消化液中的生物利用率比化合物本身提升了3倍，且在進(jìn)食狀態(tài)下的生物利用率和脂解程度顯著高于禁食狀態(tài)的。

3.3 氧化白藜蘆醇的納米乳液顯著提升其在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)量，納米乳液使氧化白藜蘆醇在小腸上皮細(xì)胞的擴(kuò)散速度由中速上升至快速，擴(kuò)散形式為被動(dòng)滲透。氧化白藜蘆醇納米乳液對Caco-2的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，作用Caco-2細(xì)胞2 h后，吸收達(dá)到最強(qiáng)，且細(xì)胞形態(tài)保持良好。

3.4 納米乳液可以顯著提高氧化白藜蘆醇的透皮吸收效率，透皮吸收過程符合Higuchi釋藥模型，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)由Fickian擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)，適用于描述氧化白藜蘆醇納米乳液的局部釋放過程。

3.5 本文通過制備納米乳液顯著地提高了氧化白藜蘆醇的口服生物利用率及經(jīng)皮吸收效率，有效地發(fā)揮氧化白藜蘆醇活的生物活性。