丹參主要化學成分及提取分離方法研究進展

李穎，趙增成，林樹乾，黃中利

(山東省農業(yè)科學院家禽研究所，山東 濟南 250023)

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，主產于山東、陜西、山西、河北、安徽、四川、江蘇等地， 味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰等功效。臨床用于治療胸痹心痛、脘腹脅痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、瘡瘍腫痛等，是最常用的活血化瘀中藥之一[1]。

丹參首載于《神農本草經》，被列為上品藥材，歷代本草均有收載[2]。古有“一味丹參，功同四物”的說法：補血生血，功過歸地；調血斂血，力堪芍藥；逐瘀生新，性倍川芎[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參可以用于多種疾病的治療，包括腦血管疾病，冠心病、帕金森、阿爾茨海默癥、腎虛、肝硬化，骨質疏松和癌癥等[4]；丹參也是國家衛(wèi)生健康委員會公布的可用于保健食品的中藥之一，多與其他中藥配伍應用于多種疾病的治療與保健康復，如肝損傷、高血脂、高血壓、黃褐斑、體疲勞、失眠、痤瘡和骨質疏松等[5]。

在丹參藥材及其制劑的質量控制方面，自早期的1980版《上海市藥品質量標準》收錄丹參片，2014年列入美國藥典，2015年版《中國藥典》一部收載，2016年丹參膠囊獲得荷蘭藥監(jiān)局植物藥注冊批準[5-6]。近年來，對丹參活性成分和藥理作用的研究不斷深入，本文就丹參所含的主要化學成分和提取分離方法進行概述。

1 丹參中的主要化學成分

丹參中的化學成分主要分為脂溶性成分、水溶性成分和其它類成分，其中脂溶性成分包括丹參酮類、揮發(fā)油類等，水溶性成分主要為酚酸類，其它類成分主要有黃酮類、多糖類、無機鹽類等。

1.1 丹參中的脂溶性成分

1.1.1 丹參酮類成分

丹參酮(tanshinone)類成分均含有鄰醌或對醌結構，根據(jù)具體結構分為丹參酮Ⅰ(tanshinone I,TSI)、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA,TSA)、丹參酮ⅡB(tanshinone B,TSB)、隱丹參酮(cryptotanshinone,CTS)、異隱丹參酮(isocryptotanshinone)、15,16-二氫丹參酮(15,16-dihydrotanshinone,DTS)，羥基丹參酮(hydroxytanshinone)、丹參酸甲酯(methyl tanshinonate)等15種成分，其中，丹參酮ⅡA活性最為突出[6-7]。丹參酮類成分可在生物體內廣泛分布，其體內代謝產物也能夠影響機體的多種反應，具有廣泛的藥理活性和臨床應用。丹參酮ⅡA的磺化產物丹參酮ⅡA磺酸鈉能溶于水，經臨床試用證明治療心絞痛效果顯著[8-10]。吳繼春等對丹參甲醇提取物的乙酸乙酯部分進行分離純化鑒定，得到了10個丹參酮類成分并首次報道了4-亞甲基丹參新酮的13C譜數(shù)據(jù)[11]。王清蓉等采用拉曼光譜法考察了在丹參根中不同組織上丹參酮類成分的分布，發(fā)現(xiàn)丹參根周皮和韌皮部中均有丹參酮類成分(主要為丹參酮ⅡA)的分布，其分布與周皮細胞顏色分布呈正相關性[12]。

1.1.2 揮發(fā)油類成分

揮發(fā)油類成分生物活性較強，療效確切，現(xiàn)代藥理研究表明具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、調節(jié)心血管系統(tǒng)和調節(jié)神經系統(tǒng)等多種作用[13]。隨著對丹參活性成分的深入研究，其揮發(fā)性成分也越來越被關注。丹參揮發(fā)油主要成分有石竹烯、正十六酸、鐵銹醇、鄰苯二甲酸二異丁酷、大根香葉烯D、油酸、正二十烷等[14]。典靈輝等用GC-MS法分析并鑒定了丹參揮發(fā)油中35種成分，主要為正十六酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、油酸、正二十烷等[15]。冀海偉等分別提取了丹參不同部位根、莖、葉、花中的揮發(fā)油并用GC-MS法對其中的成分進行結構鑒定，得到了45種成分，具體分布為根17種，莖20種，葉21種，花29種，并且不同部位中所含揮發(fā)油的沸點區(qū)域不同[16]。陳艷文等用GC-MS法從丹參地上部分提取的揮發(fā)油中共檢出104種成分，鑒定出59種，其中5種為首次從丹參揮發(fā)性成分中檢出[17]。秦川等采用GC-MS技術并結合KI值比較的方法對丹參花的揮發(fā)性成分進行了研究，共鑒定出23種化合物，多為單萜和倍半萜類化合物[18]。梁嘉鈺等采用GC-MS技術從丹參揮發(fā)油中分離出29種成分，峰面積總和為99.98%，其中桃拓酚占總揮發(fā)油含量的68.39%[19]。

1.2 丹參中的水溶性成分

丹參中的水溶性成分主要為酚酸類化合物，包含丹參素、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛、紫草酸等。除了原兒茶醛和原兒茶酸以外，以丹參素和咖啡酸為結構單元，形成不同的二聚體、三聚體、四聚體及鹽類衍生物等。二聚體包括迷迭香酸、迷迭香酸甲酯、丹酚酸F、丹酚酸G、丹酚酸D和原紫草酸等；三聚體有丹酚酸A、丹酚酸C、丹酚酸L、紫草酸及其酯化衍生物等；四聚體包括丹酚酸B(紫草酸B)及其鹽和酯化衍生物、丹酚酸E等，最早發(fā)現(xiàn)的丹參素的化學名為β-3,4二羥基苯乳酸，是各種丹酚酸的基本結構[20-23]。其中，丹酚酸B是含量最大的有效成分，近年來被廣泛的研究。Wei Li等從丹參中分離得到兩個新的三聚體丹酚酸T和丹酚酸U[24]。沙秀秀等對丹參不同部位在不同生長期時的丹酚酸類成分含量的研究表明，丹參莖葉及花序中含有豐富的丹酚酸類化學成分且不同生長期含量差異較大[25]。張正付等對滇丹參中酚酸類成分進行分離純化，得到了12個酚酸類化合物[26]。

1.3 其它類成分

丹參中的其它成分主要包括黃酮類、多糖類以及無機鹽等。黃酮類成分多分布于莖葉中，在不同生長期含量也有所變化[27]。周鳳琴等對不同產地的丹參葉的化學成進行了研究，發(fā)現(xiàn)丹參葉中主要含酚酸類、黃酮類、皂苷類及香豆素類成分，可能含有氨基酸、多肽、蛋白質、有機酸、糖及其苷類及揮發(fā)油等[28]。Fan Yang等采用高速逆流色譜法(HSCCC)從丹參中分離得到了5個黃酮類化合物，分別為蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-Ο-α-L-鼠李糖吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-β-D-葡萄糖苷、芹菜-7-Ο-β-D-葡萄糖苷[4]。Huiting Zeng等采用超高效液相-質譜聯(lián)用法(UPLC-TQ-MS/MS)以及高效液相-蒸發(fā)光散射檢測器法(HPLC-ELSD)研究了丹參根、莖、葉、花在不同生長時期的成分含量，結果表明根中主要成分為丹酚酸、丹參酮類和水蘇糖；地上部分主要成分為丹酚酸、黃酮類和三萜類[29]。汪紅等將丹參粗多糖用DEAE-Sepharose Fast Flow純化后，經脫色、流水透析、冷凍干燥后得到SMP 1和SMP 0.5兩種多糖并進行了結構鑒定[30]。湯偉采用大孔樹脂法及離子交換層析柱法精制純化丹參粗多糖，分離純化得到SMP1、SMP2、SMP3三個組分[31]。張玲等用電感耦合等離子發(fā)射光譜法分別測定白花丹參和紫花丹參中的微量元素，結果表明白花丹參根部銅、硼、鈦、鍶等微量元素的含量顯著高于紫花丹參；白花丹參花中鎳、硼和銅等三種元素含量顯著高于紫花丹參；鐵、鎂、錳、鈷、鎘、鋇、鍶、鈦、錫、鋅、鉻、鋰和釩等13種元素的含量都不同程度低于紫花丹參[32-33]。

2 丹參中主要化學成分的提取分離方法

2.1 傳統(tǒng)提取方法

傳統(tǒng)提取方法主要包括煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，多以水或者不同體積分數(shù)的乙醇為溶劑，是當今產業(yè)化的主體[34]。王萍等以丹酚酸B的含量和浸膏得率為指標，采用PB試驗結合Box-Behnken響應面法優(yōu)化丹參水提液的提取工藝，篩選出最佳工藝為液料比為12.5∶1，提取3次，每次100 min[35]。劉濤等以丹酚酸B和迷迭香酸提取量的綜合評分為指標，通過正交試驗考察丹參莖葉的最佳提取工藝，篩選出最佳工藝為12倍量的20%乙醇，提取2次，每次1.5 h[36]。任雪峰等以總蒽醌的提取率為指標，以乙醇為溶劑采用響應面分析法優(yōu)化丹參中蒽醌的提取工藝，篩選出最佳工藝為料液比1∶9，提取時間2 h，提取溫度70 ℃[37]。李國轉等以HPLC特有峰總面積、干浸膏得率和三個主要成分(隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA)的含量為指標，采用正交試驗法優(yōu)化丹參酮類提取物的工藝，篩選出最佳工藝為以8倍量的95%的乙醇為溶劑，提取3次，每次0.5 h；以5個成分(丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B)的含量、丹參總酚酸提取物干浸膏得率及丹參總酚酸提取物的HPLC特征圖譜的共有峰總面積之和為綜合評判指標，采用正交試驗法優(yōu)化丹參總酚酸的提取工藝，篩選出最佳工藝為料液比為1∶12(g·mL-1)、提取時間為1.5 h、醇沉溶液的含醇量為70%[38-39]。梁嘉鈺等以揮發(fā)油含量為指標，采用正交設計法篩選出最佳工藝為丹參粉碎度100 μm，提取5 h，浸泡0 h，7倍加水量[19]。李敏等以丹參酮ⅡA提取率為評價指標，先采用正交試驗進行優(yōu)化，再通過R語言結合BP神經網絡及遺傳算法對正交試驗數(shù)據(jù)進行目標尋優(yōu)，篩選出最佳工藝為乙醇體積分數(shù)90%，液料比8∶1，提取時間2 h，提取次數(shù)3次[40]。黃東輝以丹參酮提取率為指標，結合單因素和正交實驗，得出乙醇回流法最佳工藝條件為料液比1∶8，溫度70 ℃，浸泡時間1 h，回流時間2 h[41]。

2.2 新技術提取方法

為了解決傳統(tǒng)提取方法中存在的提取率低、有效成分易分解或破壞及能源消耗大等問題，越來越多的新型提取技術包括半仿生提取法、酶輔助提取法、超聲提取法、閃式提取法、微波法和超臨界流體萃取法等被應用于中藥提取中[34]。

2.2.1 半仿生-酶提取法

蔡華等以丹酚酸B得率、總酚酸得率和干浸膏收率為指標，采用正交試驗優(yōu)選半仿生-纖維素酶提取法提取房陵丹參水溶性成分提取工藝，篩選出最佳提工藝為水解酶用量3 mg·g-1，酶解時間2 h，料液比1∶22[42]。許令俠整合了生物酶解提取與超聲輔助萃取工藝，開發(fā)了丹參酮IIA和丹酚酸B協(xié)同提取方案，并采用益生菌對丹參進行生物轉化，優(yōu)選了轉化菌株和轉化工藝參數(shù)，采用正交實驗，篩選的最佳提取工藝流程為：丹參低溫烘干后首先采用超微粉碎處理至1 000～3 000目，在固液比為1∶20，pH 3的水體系內，添加1.5%(W/W)的復合酶(纖維素酶：果膠酶=2∶1)，45 ℃超聲處理20 min。過濾后收集濾液部分；濾渣則在70%乙醇，固液比為1∶20條件下，60 ℃超聲處理30 min，固液分離收集濾液[43]。

2.2.2 臨界流體萃取法

肖飛等以丹參酮ⅡA、隱丹參酮及總丹參酮提取率為考察指標，采用正交試驗優(yōu)選丹參超臨界CO2萃取工藝，并用超聲強化方法改進提取工藝，篩選出最佳工藝為藥材粉碎過20目篩，以與藥材等量的95%乙醇作夾帶劑，萃取壓力25 MPa，溫度40 ℃，時間2 h；通過超聲強化作用，萃取壓力可降至18 MPa，時間縮短至1.5 h，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、總丹參酮的提取率分別提高0.5%、1.11%、0.28%[44]。鄧秀清以丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮ⅡA和隱丹參酮5種成分的含量作為評價指標，采用響應面優(yōu)化法對丹參亞臨界水提取工藝和超聲強化亞臨界水提取方法進行了優(yōu)化，篩選出了最佳提取工藝，并確定超聲強化-亞臨界水提取方法可以降低提取溫度并提高提取率[45]。林輝等以丹參飲中隱丹參酮、丹參酮ⅡA等成分的含量為指標，采用均勻設計實驗優(yōu)選丹參飲中脂溶性成分超臨界CO2提取的最佳工藝條件，篩選出最佳條件為提取壓力30 MPa、提取溫度45 ℃、提取時間2.5 h[46]。

2.2.3 超聲提取法

郜舒蕊等以迷迭香酸、隱丹參酮、丹酚酸B及丹參酮ⅡA提取量為指標，采用均勻設計法篩選出最佳超聲提取工藝為乙醇體積分數(shù)75%，液料比200 mL·g-1，提取時間10 min[47]。戴金明等用不同溫度的水超聲后提取后檢測丹酚酸B的含量，結果采用70～100 ℃的溫度的水所超聲提取的丹酚酸B的含量高且較穩(wěn)定[48]。王燕華等以丹參多糖提取率為指標，采用響應面實驗優(yōu)化超聲波提取法，篩選出最優(yōu)提取條件為超聲功率212 W、超聲時間18 min、顆粒大小55目[49]。林大專等以丹酚酸B和丹參酮ⅡA的含量為指標，采用正交實驗設計優(yōu)化超聲輔助回流提取工藝，篩選出最佳條件為用6倍量70%乙醇超聲提取2次，每次30 min，提取溫度50 ℃，再用30%乙醇回流提取3次，每次90 min，料液比1：10[50]。鄒蔓姝等以丹參酮ⅡA與丹酚酸B的提取率為指標，比較了不同濃度乙醇提取、乙醇超聲提取和超臨界CO2(SFE-CO2)萃取3種提取方法，結果SFE-CO2萃取法對丹參酮ⅡA的提取率明顯高于乙醇超聲提?。灰掖汲曁崛『蚐FE-CO2萃取無顯著性差異，但均明顯優(yōu)于不同濃度乙醇提取[51]。張海榮等在單因素試驗的基礎上，釆用三因素三水平響應面分析法，確定超聲提取丹參多糖最佳工藝條件為：超聲功率90 W、超聲溫度50 ℃、提取時間30 min、液固比為55∶1，提取次數(shù)為2次，丹參多糖產率為8.23%[52]。

2.3 提取方法統(tǒng)計

丹參提取工藝參數(shù)與結果見表1。

表1 丹參提取工藝參數(shù)與結果

2.4 分離純法方法

中藥材成分非常復雜，有效成分的分離純化一直是研究的難點，也是制約中藥臨床應用和藥理研究的主要因素。除了傳統(tǒng)的醇沉法、酸堿沉淀法和萃取法等分離純化方法外，一些新的技術如大孔樹脂技術，超臨界流體技術、柱層析技術、膜分離技術等逐漸應用于中藥的分離純化。與傳統(tǒng)方法相比，消耗的溶劑量更小，時間更短，所得成分純度更高。

王延翠用超臨界流體色譜(SFC)法分離純化丹參乙醇提取物，利用HPLC進行純度測定，利用UV、NMR進行結構的鑒定，得到了隱丹參酮、丹參酮I、甘西鼠尾新酮、丹參酮IIA、丹參新酮5個化合物[53]。張毅等利用聚酰胺凝膠柱分離，乙醇/水梯度洗脫以分離純化，經過核磁共振譜(1H NMR、13C NMR)確證了結構，并經薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)分析，得到丹參酮IIA純度達到93%以上[54]。Zhaokun Yin等將丹參乙醇提取物用硅膠柱分步洗脫后用葡聚糖凝膠柱進一步分離，經過高效液相色譜和核磁共振譜確證了結構，得到了丹參堿G和4-甲基-9-(乙氧羰基)-8-萘酸2個化合物[9]。鄒蔓姝等采用SIP1905大孔樹脂裝柱，分步洗脫純化丹參提取物中的丹酚酸B，得量占固體物量的64.89%[51]。馬繼超等采用大孔樹脂，用不同濃度乙醇洗脫，提純丹酚酸B。得到的最佳工藝為：用pH=4.5酸水加抗氧劑提取，然后上大孔樹脂柱，先用pH=2.0酸水和20%乙醇分別洗脫除雜，最后用50%乙醇洗脫精制，得到丹酚酸B提取物。丹酚酸B含量可達50%，收率可達30%以上[55]。

3 小結

丹參是臨床使用最多的大宗藥材之一，活血化瘀的功效顯著，是第一個被納入美國藥典的傳統(tǒng)中藥。目前，越來越多的提取分離純化鑒定的新技術開始應用于中藥的研究，很大程度上加快了丹參的研究進展。然而，目前對丹參藥材的研究主要集中于丹參根莖，活性成分的研究主要集中于丹參酮類和丹酚酸類兩大類成分，藥理和臨床的研究主要集中于心腦血管疾病，對于其它部位、成分和藥理活性的研究還不夠系統(tǒng)，需要進一步完善。