干旱脅迫對杜仲葉片結(jié)構(gòu)特征的影響

何 鳳 杜紅巖 劉攀峰 王 璐 慶 軍 杜蘭英*

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，國家林業(yè)和草原局杜仲工程技術(shù)研究中心，鄭州 450003；2. 南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037）

干旱是造成經(jīng)濟(jì)損失的主要自然災(zāi)害之一，對全球農(nóng)作物生產(chǎn)的危害相當(dāng)于其他自然災(zāi)害之和［1］。植物可通過形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化功能的變化以適應(yīng)干旱脅迫。葉片是植物進(jìn)行光合作用和呼吸作用的主要器官，隨環(huán)境變化往往表現(xiàn)出其外部形態(tài)及內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)的差異，因此研究葉片的生態(tài)解剖學(xué)特征可以揭示干旱脅迫對植物的影響［2］。氣孔是與葉片的功能有著密切關(guān)系的生理器官結(jié)構(gòu)，它既是與外界進(jìn)行氣體交換的門戶，又是水汽蒸騰的通道，與抗旱性能密切相關(guān)，植物在干旱脅迫下可通過氣孔調(diào)節(jié)來適應(yīng)［3～4］。

目前，已有諸多關(guān)于植物在干旱脅迫下葉片解剖結(jié)構(gòu)和氣孔響應(yīng)的研究。曹林青等［2］研究發(fā)現(xiàn)，油茶在中重度干旱程度下，成熟葉片出現(xiàn)葉片變薄，柵欄組織和柵海比變小，海綿組織厚度變化不顯著，氣孔面積、氣孔大小、氣孔開度減小，氣孔密度先減小后增大等解剖結(jié)構(gòu)的變化，這些變化是油茶葉片對干旱逆境的適應(yīng)特征進(jìn)而維持生存和生長。黃絹等［5］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因楊A(yù)BJ01 和非轉(zhuǎn)基因楊9#葉片厚度、上表皮厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度顯著降低，9#柵欄組織厚度顯著降低，而ABJ01 則顯著升高，表明ABJ01 具有更發(fā)達(dá)的柵欄組織，與很多植物相反，轉(zhuǎn)基因楊A(yù)BJ01 通過柵欄組織厚度的升高來適應(yīng)環(huán)境的變化。董曉民等［6］研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，2 個(gè)扁桃品種葉片厚度均明顯減小，葉肉上下表皮細(xì)胞變小，細(xì)胞間隙變小，海綿組織厚度降低，柵海比值逐漸增大，這些葉片結(jié)構(gòu)朝著耐旱的方向改變，以減少水分蒸發(fā)適應(yīng)環(huán)境變化。龐杰等［7］研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤含水量下降，沙芥幼苗葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度呈下降趨勢，海綿組織厚度呈先下降后上升的趨勢，柵欄組織和柵欄組織/海綿組織呈先上升后下降的趨勢。高彥萍等［8］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)水分脅迫，大豆葉片氣孔密度增加，氣孔開口大小和單位葉面積氣孔相對面積減小，不同抗旱類型大豆氣孔密度變化幅度大小不同。劉世鵬等［9］研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱脅迫程度的增加，5 個(gè)品種棗樹葉片氣孔密度先升后降，長度和寬度之間呈極顯著線性關(guān)系，氣孔大小先減小后增大，密度與長度、寬度之間均表現(xiàn)為極顯著的負(fù)線性關(guān)系。Chartzoulakis K 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下橄欖葉片的柵欄組織、海綿組織的細(xì)胞間隙明顯降低，細(xì)胞密度明顯升高，這些變化導(dǎo)致單位葉面積增加進(jìn)而促進(jìn)CO2的吸收，從而在氣孔導(dǎo)度低的干旱條件下保持光合速率。劉球等［11］綜述了干旱脅迫對植物葉片解剖結(jié)構(gòu)影響，為高等植物抗旱能力研究提供參考，文中介紹了不同植物葉片解剖對干旱脅迫響應(yīng)不同。因此植物適應(yīng)干旱環(huán)境的對策是多種多樣的，杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）屬杜仲科（Eucommiaceae）植物，該科僅有1 屬1 種，自古以取皮入藥而著稱，有關(guān)杜仲逆境脅迫的研究較少，且內(nèi)容多集中在逆境生理指標(biāo)［12～16］、光合特性等方面［17～19］，關(guān)于干旱脅迫下杜仲葉片結(jié)構(gòu)變化的研究較缺乏［20］。本研究選取2 年生‘華仲6 號’杜仲扦插苗為試驗(yàn)材料，干旱脅迫條件下觀察并分析其葉片外部形態(tài)特征，葉片下表皮氣孔特征、葉肉和葉脈顯微結(jié)構(gòu)，探究杜仲幼苗葉片結(jié)構(gòu)在不同程度的干旱脅迫下的變化及規(guī)律，進(jìn)一步了解其干旱適應(yīng)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心原陽基地的大棚內(nèi)進(jìn)行。2018年12月將當(dāng)年扦插生根的杜仲扦插苗‘華仲6號’幼苗移栽至高15 cm，入口直徑15 cm 的營養(yǎng)缽中，缽底有4 個(gè)小孔以保持下層土壤通氣性，每個(gè)營養(yǎng)缽中種植1 株，栽培土壤為基地內(nèi)大田栽培土，土壤質(zhì)地為壤土，全氮8.2 mg·L-1，全磷28.0 mg·L-1，全鉀5.0 mg·L-1，全鈣1 000.0 mg·L-1（全氮、全磷、全鉀、全鈣使用百靈達(dá)SKW500 儀器測定），每營養(yǎng)缽中土重約1.80 kg，田間持水量為40.11%，定植并澆透水放至大田中培養(yǎng)，保證土壤水分基本充足，確保苗木成活。

1.2 試驗(yàn)處理

于2019 年5 月1 日選取長勢基本一致的營養(yǎng)缽苗（地徑4.45±0.57 cm，苗高19.09±4.96 cm）共72 盆移至簡易避雨棚中，防止雨水進(jìn)入土壤水分控制區(qū)，每6 個(gè)營養(yǎng)缽苗放在1 個(gè)托盤里，托盤高5 cm，澆透水，托盤里盛一部分水，以保證每個(gè)營養(yǎng)缽的土壤含水量基本一致，之后每5 d澆透水1次。2019 年5 月16 日開始，對照（CK1、CK2、CK3）組每隔5 d 澆透水，干旱處理組采取自然干旱的方式進(jìn)行，按停止?jié)菜? d（5 月22 日）、11 d（5 月27 日）、16 d（6月1日）作為水分干旱脅迫處理，3個(gè)時(shí)期分別編號為T1、T2、T3。各處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)4株，每次試驗(yàn)采集對照組和干旱處理組葉片、根系附近土壤。每個(gè)重復(fù)采集頂部第1～5片成熟葉片混勻備用。從基地氣象站獲取試驗(yàn)期間氣象數(shù)據(jù)。

圖1 為營養(yǎng)缽苗土壤質(zhì)量含水量的變化和采樣期間試驗(yàn)地氣溫變化。對照組幼苗土壤質(zhì)量含水量為31.95%～34.29%，在干旱脅迫6 d、11 d、16 d 時(shí)，土壤質(zhì)量含水量分別為24.54%、12.03%、2.60%。5月18日至22日和5月28日至6月1日的平均氣溫分別為22.32℃和22.37℃，這兩個(gè)時(shí)間段的氣溫相似，5月23日至27日的氣溫最高，平均氣溫為27.58℃。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤質(zhì)量含水量的測定

采集扦插苗根部附近的土壤迅速放入鋁盒中，每個(gè)重復(fù)挖取1 個(gè)扦插苗附近的土，3 次重復(fù)，帶回實(shí)驗(yàn)室，采用烘干法測定，取其平均值。

1.3.2 葉片相對含水量的測定

取樣后將葉片表面擦拭干凈，立即稱葉片的鮮質(zhì)量（Wf），后將葉片浸入蒸餾水中24 h，取出用吸水紙吸干葉片表面水分，稱飽和質(zhì)量（Wt），最后將葉片置于105℃烘箱中殺青15 min，于80℃下烘干至恒量，稱干質(zhì)量（Wd），計(jì)算葉片相對含水量（RWC），每個(gè)處理3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.3 葉片細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀測

每個(gè)重復(fù)選取1 片葉，3 次重復(fù)，取葉片中部連著中脈剪取1.5 cm×1.5 cm 的方塊，置于FAA 固定液（70%乙醇90 mL+甲醛5 mL+乙酸5 mL）中固定，于4℃冰箱中保存，用于做常規(guī)石蠟切片，材料經(jīng)FAA 固定24 h 以上，乙醇和二甲苯系列脫水透明，浸蠟，包埋。切片（切片厚度8 μm）用番紅－固綠染色，中性樹膠封片后制成永久裝片，用顯微鏡觀察并照相，每個(gè)處理觀測6 個(gè)視野，用ImageJ 軟件觀察分析測定葉片柵欄組織、海綿組織、上表皮、下表皮、葉脈等結(jié)構(gòu)參數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.3.4 葉片下表皮氣孔結(jié)構(gòu)掃描電鏡觀測

每個(gè)重復(fù)選取1 片葉，3 次重復(fù)，取葉片中部主脈一側(cè)剪取1 cm×1 cm 的方塊，置于電鏡固定液（2.5%的戊二醛）中固定，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆米鲭婄R掃描，每個(gè)處理在掃描電子顯微鏡下觀察15個(gè)視野并拍照。從中選取1 張100 倍鏡的視野統(tǒng)計(jì)氣孔數(shù)目和閉合氣孔的數(shù)目，計(jì)算氣孔密度（個(gè)/mm2）和氣孔閉合百分比；從中選取2 張400 倍鏡視野用ImageJ 軟件測量每個(gè)氣孔的面積、長度、寬度，氣孔長度為平行于氣孔器的最長值，氣孔寬度為垂直于氣孔器的最寬值，求取2個(gè)視野下氣孔面積、長度、寬度的平均值。每個(gè)處理3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2016 和SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)分析、顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉片解剖結(jié)構(gòu)和下表皮氣孔特征

‘華仲6號’葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)為長橢圓形，葉緣鋸齒，葉尖尾尖，基部圓形，葉片嫩綠顯光澤，與一般雙子葉植物的葉相同（見圖2A）。葉片解剖結(jié)構(gòu)可分為表皮、葉肉、葉脈，為背腹型葉。上下表皮均由1層表皮細(xì)胞組成，排列緊密。上表皮細(xì)胞較厚，由類橢圓形細(xì)胞排成1層；下表皮較上表皮薄，細(xì)胞體積較小，類長方形。葉肉有明顯的柵欄組織和海綿組織的分化，柵欄組織緊靠上表皮，排列緊密，細(xì)胞呈長圓柱形，內(nèi)含類似小泡樣結(jié)構(gòu)；海綿組織靠近下表皮，細(xì)胞較大，近橢圓形，靠近柵欄組織的葉肉細(xì)胞排列較為緊密，靠近下表皮的葉肉細(xì)胞排列較為松散無序，胞間隙較大，便于氣孔與葉肉之間的聯(lián)系（見圖2B）。

主脈由表皮、厚角組織、薄壁組織、韌皮部、形成層、木質(zhì)部構(gòu)成，為外韌型，略呈凹槽狀，木質(zhì)部導(dǎo)管徑向排列緊密，韌皮部細(xì)胞較小呈密集無規(guī)則分布，形成層較明顯。韌皮部的外側(cè)有薄壁組織和厚角組織，共11～16 層細(xì)胞，厚角組織3～4層細(xì)胞，較為發(fā)達(dá)（見圖2C）。

氣孔器是指氣孔與兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞組成的復(fù)合體。植物體通過保衛(wèi)細(xì)胞來調(diào)控氣孔的開張度，從而調(diào)節(jié)氣體的出入和水分蒸騰。從電鏡掃描照片看（見圖2D），下表皮向表面隆起，有大量氣孔器分布，氣孔器由兩個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞組成，呈橢圓形，無副衛(wèi)細(xì)胞，兩個(gè)腎形細(xì)胞對稱排列，氣孔呈紡錘形。保衛(wèi)細(xì)胞由幾個(gè)普通的表皮細(xì)胞不規(guī)則地圍繞，屬于無規(guī)則型。下表皮具角質(zhì)層，呈棱狀突起往往沿著某一方向延伸。氣孔器的兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞表面光滑，在氣孔器周圍，常由4～5 條棱狀突起角質(zhì)層環(huán)繞，個(gè)別的氣孔器外由光滑的突起包圍。氣孔與下表皮細(xì)胞處于相似的水平。

2.2 干旱脅迫下杜仲葉片相對含水量和表型特征變化

隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，對照組的葉片相對含水量維持在74.88%～76.59%，干旱處理組葉片相對含水量持續(xù)下降；干旱脅迫6 d、11 d、16 d時(shí)，葉片相對含水量分別為75.63%、73.58%、56.11%（見圖3A）。處理組，干旱脅迫6 d 時(shí)，葉片相對含水量與對照無顯著差異，葉片長勢良好，無旱害癥狀（見圖3A，B）；干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片相對含水量與對照無顯著差異，葉片出現(xiàn)微卷曲特征（見圖3A，C）；在干旱脅迫16 d 時(shí)，葉片相對含水量極顯著低于對照組，葉片明顯萎蔫卷曲下垂（見圖3A，D）。

2.3 干旱脅迫下杜仲葉片解剖結(jié)構(gòu)特征變化

由圖4 可見，從葉片的橫切面可以看出，對照組葉片解剖結(jié)構(gòu)細(xì)胞充盈，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間隙小，排列整齊（見圖4 CK1，CK2，CK3），葉片上、下表皮厚度分別為14.43～14.48 μm、12.64～12.72 μm，柵欄組織、海綿組織厚度分別為54.19～54.36 μm、85.20～85.88 μm（見表1）。由表1 可知，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，處理組柵欄組織的厚度與對照組相比變化不顯著；在干旱脅迫6 d、11 d 時(shí)，分別與對照CK1、CK2 相比，葉片的上、下表皮細(xì)胞厚度、海綿組織厚度均變化不顯著；在干旱脅迫16 d時(shí)，與對照CK3 相比，柵欄組織厚度、上表皮細(xì)胞厚度均變化不顯著，葉片海綿組織厚度、下表皮細(xì)胞厚度均顯著降低，分別降低了40.66%、27.04%，細(xì)胞之間相互擠壓變形；在干旱脅迫6 d、11 d 時(shí)，葉片的柵海比為0.64，與對照一致；在干旱脅迫16 d 時(shí)柵海比為1.07，顯著大于對照。由此說明，杜仲扦插幼苗葉片能忍受短期的干旱脅迫，葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)在短期的干旱脅迫下幾乎不受影響，超過一定長時(shí)間的干旱脅迫，葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化。

表1 干旱脅迫下杜仲葉肉結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Leaf mesophyll structure parameters of E.ulmoides under drought stress

2.4 干旱脅迫對杜仲葉片下表皮氣孔特征變化

圖5 是不同干旱脅迫時(shí)間下杜仲葉片下表皮氣孔器分布與氣孔特征。由表2可知，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，杜仲葉片氣孔密度呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢；在干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片氣孔密度最大，為308.03 個(gè)·mm-2，顯著大于對照；在干旱脅迫6 d 和16 d 的葉片氣孔密度，與對照相比均差異不顯著，分別為207.28、210.74 個(gè)·mm-2；葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度隨著干旱脅迫時(shí)間的延長變化趨勢一致，均呈先下降后升高的趨勢；在干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度為最小，與干旱脅迫6 d 相比，分別下降了59.22%，32.41%，28.40%，此時(shí)氣孔的閉合百分比最高，顯著高于對照。

表2 干旱脅迫下杜仲葉片下表皮氣孔特征值Table 2 Leaf stomatal structure eigenvalue of lower epidermis of E.ulmoides under drought stress

由表2 可知，在干旱脅迫6d 時(shí)，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均顯著大于對照CK1，氣孔密度差異不顯著；在干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均顯著低于CK2；在干旱脅迫16 d 時(shí)，葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均與CK3無顯著差異。

由表2 可知，對照組之間相比，葉片氣孔密度相近，無大的變化；CK2 的葉片氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均明顯大于CK1、CK3。

由表3可知，干旱脅迫6 d、11 d、16 d杜仲扦插幼苗葉片氣孔的長度、寬度、密度相關(guān)性及線性回歸方程，氣孔長度與寬度呈顯著正相關(guān)（R=0.896），氣孔長度、寬度與氣孔密度均呈顯著負(fù)相關(guān)（R=0.774，R=0.795）。

3 討論

作為直接接觸外界環(huán)境的器官，葉片是植物進(jìn)化過程中對環(huán)境變化比較敏感、可塑性較強(qiáng)的器官，其外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征的變化能較好地反映出植物對干旱等逆境的適應(yīng)性［21～23］。葉片表皮上的氣孔，通過控制植物與外界的氣體和水分交換來適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，當(dāng)土壤持續(xù)缺水、水分高度蒸發(fā)時(shí)，氣孔控制是植物限制水分丟失，防止植物受害的一種重要生理機(jī)制［24］。在研究干旱脅迫對植物生長的影響時(shí)，常用葉片氣孔密度和大小的變化來進(jìn)行分析［9］。

發(fā)達(dá)的柵欄組織可避免植物葉肉細(xì)胞受強(qiáng)光灼傷的同時(shí)，充分利用衍射光進(jìn)行光合作用，有利于植物保持水分以及更好地保護(hù)內(nèi)部組織，從而提高植物的存活率并有助于植物生長［25］。葉肉柵欄組織發(fā)達(dá)、海綿組織厚度相對減少及葉片組織緊密度增大等特征，有助于CO2從孔下室傳導(dǎo)至光合作用場所，在氣孔導(dǎo)度較低的情況下維持植物較高的光合速率，提高植物的保水能力和抗旱能力［26］。隨著水分虧缺的嚴(yán)重，柵欄組織與海綿組織的比值會逐漸增大，葉片緊密程度不斷提高，表示植株抗旱能力在增強(qiáng)［27］。本研究中，‘華仲6號’杜仲扦插幼苗葉片的上表皮細(xì)胞厚度較下表皮細(xì)胞厚，海綿組織厚度厚于柵欄組織，柵欄組織表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱適應(yīng)能力其厚度受干旱脅迫的影響不大。從干旱脅迫11～16 d，杜仲葉片的相對含水量顯著下降，葉片嚴(yán)重失水從而使海綿組織厚度顯著降低，細(xì)胞之間相互擠壓變形，柵欄組織與海綿組織的比值顯著增大且比值大于1，葉片緊密程度提高以此來提高杜仲葉片的抗旱能力。由楊秀平［28］等人研究得知杜仲葉片上表皮細(xì)胞無氣孔，具角質(zhì)層，下表皮角質(zhì)層薄，本研究中由于染色的原因，下表皮的角質(zhì)層未看清楚。

本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，土壤含水率的降低，杜仲扦插幼苗葉片氣孔密度表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢，而氣孔面積、氣孔長度和氣孔寬度則表現(xiàn)為增加—減少—增加的趨勢，且氣孔長寬與氣孔密度均呈顯著的負(fù)線性相關(guān)，干旱脅迫下氣孔的長度和寬度減少和增大具有同步性。在干旱脅迫6 d 時(shí)，可能是因?yàn)檫m度的干旱脅迫有助于杜仲葉片氣孔的開張，對氣孔密度無影響；在干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片氣孔密度顯著變大可能是由于水分脅迫影響了細(xì)胞的伸長，使葉面積變小，從而提高了單位葉面積上的氣孔個(gè)數(shù)，有研究表明氣孔密度越大，越有利于蒸騰作用快速地將熱量散掉，從而葉片可以避免因溫度過高使葉綠體及原生質(zhì)變性［29］，氣孔大小減少能降低杜仲葉片水分蒸騰，使葉片具有保水作用；在干旱脅迫16 d 時(shí)，氣孔密度下降到對照水平，氣孔大小變大，可能是因?yàn)槿~片受到嚴(yán)重水分脅迫，光合作用受到嚴(yán)重影響，減少了植株的能量供應(yīng)，植株為了維持基本的生理過程，通過增大氣孔使光合作用速率不至于降到過低的程度［9］。氣溫也能影響氣孔的大小、密度［30］，本研究中，在干旱脅迫的第7～11 d，氣溫相對于其他兩個(gè)采樣時(shí)間均較高，可能是因?yàn)闇囟冗m宜葉片的生長，對照CK2 的氣孔面積、氣孔長度、氣孔寬度均明顯大于CK1 和CK3。

綜上所述，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，杜仲扦插幼苗葉片會出現(xiàn)嚴(yán)重的干枯卷曲，因此在栽培種植過程中扦插幼苗可以忍受短時(shí)間的干旱，在葉片出現(xiàn)萎蔫時(shí)要及時(shí)澆水。杜仲扦插幼苗厚度變薄的主要原因是海綿組織厚度變小，在干旱脅迫11 d 時(shí)，葉片氣孔產(chǎn)生小而密、氣孔閉合增多的生態(tài)適應(yīng)特征，在干旱脅迫16 d 時(shí)氣孔呈現(xiàn)大而疏的適應(yīng)特征。植物抗旱性是復(fù)合性狀，體現(xiàn)在生長形狀、生理特征、光合特性、解剖結(jié)構(gòu)特征、分子基因表達(dá)等方面的變化［31］，本試驗(yàn)重點(diǎn)關(guān)注‘華仲6 號’扦插幼苗的葉片結(jié)構(gòu)對抗旱性的響應(yīng)，存在一定局限性。干旱脅迫對‘華仲6 號’幼苗葉面積的影響，以及葉面積和氣孔密度之間的關(guān)聯(lián)，干旱脅迫下氣孔性狀對葉片光合作用、蒸騰作用等重要生理過程的調(diào)節(jié)功能，溫度、植物激素等與氣孔開閉的關(guān)系，其他生理生化方面和分子水平方面抗旱機(jī)制有待進(jìn)一步研究。