澳洲堅(jiān)果開花相關(guān)MiMADS-box基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

譚秋錦 張 濤 韋媛榮 鄭樹芳 湯秀華 王文林

（廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，龍州 532400）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）起源于澳大利亞是一種果仁含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)的果樹，果仁既可以生吃，也可以烘烤，或者作為各種加工食品的成分，特別是糖果產(chǎn)品［1］。澳洲堅(jiān)果的果殼、油粕經(jīng)加工成產(chǎn)品后可提高其經(jīng)濟(jì)附加值［2］。我國澳洲堅(jiān)果主要種植在廣西、云南等地域，由于其豐富的營養(yǎng)及特殊的口感深受消費(fèi)者喜愛。我國澳洲堅(jiān)果品種主要是引進(jìn)國外高品質(zhì)品種。在我國栽培馴化和品種選育期間，國外澳洲堅(jiān)果品種需要調(diào)動(dòng)體內(nèi)復(fù)合調(diào)控機(jī)制的相關(guān)基因應(yīng)對(duì)濕度和溫度等環(huán)境變化。由于目前國際、國內(nèi)市場(chǎng)上澳洲堅(jiān)果處于供不應(yīng)求的情況，研究其產(chǎn)量相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能為闡明開花機(jī)制打下基礎(chǔ)進(jìn)而為澳洲堅(jiān)果育種工作者提供理論指導(dǎo)。

MADS-box基因家族是一個(gè)家族成員均存在MADS-box 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族。在真菌、動(dòng)物和植物中發(fā)現(xiàn)的MADS 家族在N 端有一個(gè)高度保守的DNA 結(jié)合域，名為MADS。MADS-box基因已經(jīng)在許多不同的植物物種中被發(fā)現(xiàn)。在植物中，MADS-box主要分為I型（SRF-like MADS-box）和Ⅱ型（MEF2-like MADS-box），其中Ⅱ型具有典型的MADS、I、K、C 結(jié)構(gòu)域，也被稱為MIKC 型基因［3］。MADS 區(qū)域包含一個(gè)高度保守的區(qū)域，大約有60個(gè)氨基酸，MADS區(qū)域?qū)ｉT與DNA結(jié)合［4］。Ⅰ區(qū)由30～35 個(gè)氨基酸組成，含有較多的親水性殘基，具有DNA 特異性結(jié)合的功能［5］。K 區(qū)由65～70 個(gè)氨基酸組成，介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用。C區(qū)由約30 個(gè)疏水性氨基酸組成［6］。根據(jù)MADS-box基因編碼的K-domain 結(jié)構(gòu)域的長度和系統(tǒng)進(jìn)化分析，可將MIKC 型基因分為MIKCC和MIKC*兩類［7～8］。在開花植物中，研究表明MADS-box基因具有廣泛的功能，參與花的形成（包括生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育），開花時(shí)間的調(diào)控和營養(yǎng)生長的調(diào)控。擬南芥開花時(shí)間受三個(gè)基因通路的控制。MADS-box基因FLOWERING LOCUS C（FLC）負(fù)調(diào)控從營養(yǎng)階段到生殖階段的過程；CONSTANS（CO）基因調(diào)控光周期途徑并在長日光的條件下促進(jìn)開花；赤霉素途徑依賴于植物激素赤霉素通過激活分生組織特性基因LEAFY（LFY）傳遞信號(hào)［3］。TCP和MADS-Box轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非洲菊異型花型識(shí)別［9］。在核桃和擬南芥中，MADS-box基因AGAMOUS-LIKE12 的過表達(dá)激活了根的發(fā)育［10］。BcAP3是一個(gè)MADSbox基因，它控制著小白菜的雄蕊發(fā)育和雄性不育［11］。OsMADS18 是一種膜結(jié)合MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)節(jié)水稻株型和脫落酸的響應(yīng)［12］。MADS-box基因家族成員在擬南芥、水稻等模式植物中研究較為深入，然而澳洲堅(jiān)果相關(guān)研究甚少。本研究從“桂熱1號(hào)”品種的葉片中克隆MADS-box基因，利用生物信息學(xué)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析并構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pGREEN-MiMADS-box。研究MADS-box基因家族成員的結(jié)構(gòu)與功能為闡明澳洲堅(jiān)果開花機(jī)制打下基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料“桂熱1號(hào)”和“695”品種由廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所澳洲堅(jiān)果種質(zhì)圃（E106.79.84，N22.14.34）提供。農(nóng)桿菌GV3101 菌株、大腸桿菌（E.coil）DH5-α感受態(tài)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，Phanta高保真酶、ClonEXpress Ⅱ試劑盒、第二代TOPO克隆試劑盒均購自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取總RNA和cDNA的合成

澳洲堅(jiān)果RNA 的提取、反轉(zhuǎn)錄及濃度測(cè)定參考王文林的方法［13］。將提取的RNA及反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，配制1%瓊脂糖凝膠并進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2 克隆MADS-box基因全長

根據(jù)澳洲堅(jiān)果轉(zhuǎn)錄組序列，利用primer primer6.0 軟件設(shè)計(jì)引物MiMADS-box F，5′-TTCGTTCGTTTCAGGTTTCAG-3′，MiMADS-box R，5′-TCTCATCAGAGCCGCTTCC-3′，引物序列由公司合成。以澳洲堅(jiān)果“桂熱1 號(hào)”品種正常葉片的cDNA 為模板，按照高保真酶試劑盒說明書，利用PCR 擴(kuò)增Mi MiMADS-box的全長序列，將目的條帶按照膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，目的片段連接PCE2 TA/Blunt-Zero 載體，室溫反應(yīng)5 分鐘，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR 檢測(cè)后挑取陽性克隆測(cè)序。

1.2.3 MADS-box亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

通過CD designV1.04 軟件設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)插入片段的同源重組引物MiMADS-box-ORFHindⅢ-F，5′-gtcgacggtatcgataagcttATGGGAAGAGGTCCGGTTCA-3′，MiMADS-box-ORRBamH Ⅰ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′。以PCE2 TA/Blunt-Zero-MiMADS-box 的質(zhì)粒為模板利用PCR克隆目標(biāo)插入片段。利用內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ對(duì)綠色熒光融合表達(dá)載體pGREEN 改造載體進(jìn)行雙酶切并膠回收，按照ClonEXpress Ⅱ試劑盒說明書進(jìn)行連接，利用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選并測(cè)序檢測(cè)。

1.2.4 MiMADS-box生物信息學(xué)分析

參照樊松樂的方法對(duì)MiMADS-box-ORF 進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析［14］。利用DNAMAN 工具軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。MEGAX 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（neighbor-joining，bootstrap 值設(shè)為1000）。用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的蛋白序列從PlantTFDB、NCBI下載。

2 結(jié)果與分析

2.1 MiMADS-box基因克隆

以澳洲堅(jiān)果“桂熱1 號(hào)”品種葉片的cDNA 為模板，采用PCR 擴(kuò)增MiMADS-box，結(jié)果如圖1A 所示，擴(kuò)增出了與預(yù)期大小相符的特異性條帶。測(cè)序驗(yàn)證后，將cDNA 序列命名為MiMADS-box。Mi‐MADS-box基因的cDNA 全長序列1 180 bp，包含729的開放閱讀框（ORF），編碼242個(gè)氨基酸。

2.2 MiMADS-box蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

ProtParam 工具在線分析MiMADS-box 氨基酸編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：分子式C1212H1971N363O378S10，總原子數(shù)3 934，分子量為27 996.79 Da，等電點(diǎn)9.22，總平均親水性為-0.917，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）為38，帶負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為31，不穩(wěn)定系數(shù)為57.39（該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)是76.94，推測(cè)MiMADSbox蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定的親水蛋白。

2.3 MiMADS-box蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

NetPhos 3.1 在線分析工具預(yù)測(cè)MiMADS-box蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明，MiMADS-box 氨基酸序列可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)共有21 個(gè)，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)14，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)6 個(gè)，酪氨酸磷酸位點(diǎn)1 個(gè)。利用TMPred 在線工具分析預(yù)測(cè)表明MiMADS-box 蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP-5.0 Server分析預(yù)測(cè)MiMADS-box 存在信號(hào)肽的概率為0.04%。PlantmPLoc2 預(yù)測(cè)分析MiMADS-box 蛋白定位于細(xì)胞核中。綜上MiMADS-box 編碼一個(gè)非分泌型且無跨膜結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。

2.4 MiMADS-box 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

NCBI 保守結(jié)構(gòu)域工具分析預(yù)測(cè)表明Mi-MADS-box 蛋白存在MADS superfamily 和K-box superfamily 結(jié)構(gòu)域，其位置分別位于2-79 和83-167，推測(cè)其屬于Ⅱ型（MEF2-like MADS-box）也稱為MIKC 型基因（見圖2A）。利用SOPMA 分析Mi-MADS-box 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α 螺旋占51.65%，延長鏈占10.33%，β折疊占4.55%，無規(guī)卷曲占33.47（見圖2B）。利用PHYRE分析MiMADSbox的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3C所示。

2.5 MiMADS-box系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖4所示，澳洲堅(jiān)果MiMADS-box與大豆Gm-CAULIFLOWER A（Glycine max，XP_003547792.1、擬 南 芥AtMADS-box（Arabidopsis thaliana，NP_177074.1）、荷花NnCAULIFLOWER A（Nelumbo nu‐cifera，XP_010260844.1）、黃 花 假 煙 堇PlFRUITFULL（Pseudofumaria lutea，AGX01535.1）和碎米蕨葉 黃 堇CcFRUITFULL（Corydalis cheilanthifolia，AGX01538.1）進(jìn)行同源性分析，相似性分別為68.18%，61.24%，72.80%，75%和71.83%。多序列比對(duì)分析并根據(jù)圖3A 分析的結(jié)果標(biāo)注MiMADSbox 保守結(jié)構(gòu)域（見圖2A）。利用TBtools 中的MEME工具分析澳洲堅(jiān)果MiMADS-box與其在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)親緣性較高的MIMADS-BOX 蛋白序列，預(yù)測(cè)了排名前三的motif（見圖3B）。系統(tǒng)進(jìn)化分析澳洲堅(jiān)果MiMADS-box 與76 個(gè)擬南芥MICK 型 家 族 成 員，MiMADS-box 與AT1G69120.1（AGL7/AP1） 、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AGL79）親 緣 關(guān) 系 較 近，AT1G69120.1（AGL7/AP1）、AT1G26310.1 （AGL10/CAL1） 、 AT5G60910.1（AGL8/FUL）、AT3G30260.1（AHL79）屬于擬南芥MIKCC型的FUL-AP1 亞族成員（見圖4），推測(cè)Mi-MADS-box 與FUL-AP1 亞族成員具有相似的功能［15～16］。

2.6 MiMADS-box基因組織表達(dá)模式分析

“桂熱1號(hào)”和“695”品種澳洲堅(jiān)果不同組織枝條、花、和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明MiMADS-box基因在“桂熱1號(hào)”品種的葉片中表達(dá)最高，花中的表達(dá)量較低，葉片中MiMADS-box基因表達(dá)量是花的21倍左右；“695”品種中，MiMADS-box主要在花中表達(dá)最高，花中的表達(dá)量是葉片的12.5 倍左右?！肮馃? 號(hào)”和“695”品種同一組織MiMADS-box基因的表達(dá)在花和葉片中相差較大，特別是其在花中的表達(dá)量“695”是“桂熱1 號(hào)”的30 倍左右（見圖5）。

2.7 MADS-box亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

利用PCR 克隆目標(biāo)插入片段MiMADS-box-ORF，擴(kuò)增出了特異性目標(biāo)條帶（見圖1B）。利用內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ對(duì)綠色熒光融合表達(dá)載體pGREEN 改造載體進(jìn)行線性化。利用同源重組的方法構(gòu)建了pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP融合表達(dá)載體，并利用pGREEN 鑒定引物35S：5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′和MiMADS-box-ORRBamHⅠ-R，5′-tttactcatactagtggatccTTCCCGTGACAGCATCCAA-3′，并挑取陽性克隆送測(cè)序（見圖6）。選擇測(cè)序正確的陽性克隆進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，保存菌種。

3 討論

澳洲堅(jiān)果是澳大利亞東部亞熱帶雨林特有的一種堅(jiān)果作物，在澳大利亞、南非、夏威夷、巴西、中國和其他國家都有種植。澳洲堅(jiān)果是無性繁殖的，不同品種之間需要異花傳粉［17］。不同的澳洲堅(jiān)果品種的雜交花粉會(huì)造成澳洲堅(jiān)果的核質(zhì)量、果仁質(zhì)量、殼質(zhì)量和核回收率的差異［18］。澳洲堅(jiān)果的全球產(chǎn)量約為10 萬噸（果仁），其中86%來自五個(gè)最大的生產(chǎn)國，包括澳大利亞（32%）、南非（30%）、肯尼亞（12%）、美國（8%）和馬拉維（4%）［19］。在國內(nèi)和國際市場(chǎng)上整體上處于供不應(yīng)求的狀態(tài)。分子育種在植物遺傳改良中扮演著重要的角色，不但能縮短育種周期，還可產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)效益?；蚩寺?、載體構(gòu)建、結(jié)構(gòu)與功能分析是分子育種的基礎(chǔ)。

本研究從澳洲堅(jiān)果“桂熱1 號(hào)”的葉片克隆了MiMADS-box基因，推導(dǎo)的氨基酸序列為729 bp ORF，編碼242 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MiMADS-box 存 在MADS superfamily 和K-box superfamily結(jié)構(gòu)域，推測(cè)屬于澳洲堅(jiān)果MIKCC型基因家族成員。MiMADS-box 定位于細(xì)胞核是一個(gè)無信號(hào)肽、無跨膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定親水蛋白。

澳洲堅(jiān)果MiMADS-box 與大豆GmCAULIFLOWER A 擬南芥AtMADS-box、荷花NnCAULIFLOWER A、黃花假煙堇PlFRUITFULL 和碎米蕨葉黃堇CcFRUITFULL 同源性較高。系統(tǒng)進(jìn)化分析證明MiMADS-box 與AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 親 緣 關(guān) 系 較 近，AGL7/AP1、AGL10/CAL1、AGL8/FUL、AGL79 屬 于 擬 南 芥MIKCC型的FUL-AP1（SQUA）亞族成員［20］。從圖5可知，“桂熱1 號(hào)”中，MiMADS-box在花中的表達(dá)量最低，“695”中花中的表達(dá)量最高。MADS-box基因控制植物的多種生物過程，包括營養(yǎng)生長和生殖發(fā)育，主要在花序、花和果實(shí)的發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。隨后，構(gòu)建pGREEN-MiMADS-box-ORF-GFP 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 以期利用亞細(xì)胞定位技術(shù)證明MiMADS-box 轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核及利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。在擬南芥中，MIKCc基因家族被分為13個(gè)分支。在水稻中也發(fā)現(xiàn)了FLC分支以外的所有分支的代表。在擬南芥中，有6個(gè)屬于FLC分支的基因參與了春化和自主途徑的開花控制［21］。矮牽牛AP1/SQUA 亞家族的4 個(gè)成員對(duì)于花序分生組織的特性是必需的［22］。Chen 等構(gòu)建大豆AP1同源基因GmAP1 亞細(xì)胞載體，實(shí)驗(yàn)表明定位于細(xì)胞核。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得突變體植株進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明GmAP1 調(diào)控大豆花期和株高［23］。荷花NnAP1在控制花分生組織的特性和花器官的形成中起著重要的作用［24］。擬南芥AGL8基因在花序分生組織中表達(dá)，并受APETALA1 負(fù)調(diào) 控［25］。其 他 植 物AGL9/SEP 蛋 白 相 比，Gm-MADS28 調(diào)控花器官數(shù)量、花絲長度和花粉釋放［26］。SPL10 可 直 接 與AGL79啟 動(dòng) 子 結(jié) 合，miR156/SPL10通過調(diào)控AGL79（定位于細(xì)胞核）在植物側(cè)根生長中發(fā)揮作用［27］。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，黃瓜（Cucumis sativusL.）的APETALA1-like基因過表達(dá)可誘導(dǎo)其提早開花和葉片發(fā)育異常［28］。BpAP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺葉片和雄花序中這7 條基因（BpAP1、BpPI、BpMADS4、BpMADS5、FT、TFL1和LFY）的表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期均顯著高于NT（野生型）和BpAP1抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因白樺［29］。李爽等人構(gòu)建了prokⅡ-PsnAP1-1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并侵染煙草，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草比野生型提早開花［30］。王企等人對(duì)核桃FRUITFULL（Jr‐FUL）基因進(jìn)行了克隆、生物信息學(xué)及熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明JrFUL 參與核桃開花中，可能對(duì)雄花的開放有促進(jìn)作用［31］。綜上，推測(cè)Mi-MADS-box 參與調(diào)控澳洲堅(jiān)果開花及花器官發(fā)育的過程，筆者成功的構(gòu)建了該基因的植物表達(dá)載體，為深入研究其調(diào)控機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。