UV-B輻射對84K楊酚酸類化合物積累及其生理生化的影響

蓋慶巖 王紫瑩 付玉杰 焦 驕 王慧梅 鹿 瑤 劉 婧 富錦先 徐曉杰 姚 蘭

（東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

楊樹（Populusspp.）隸屬楊柳科（Salicaceae），為多年生木本植物，是全球分布最為廣泛也是適應(yīng)性最強的樹種之一。因其生長快速、便于繁殖及抗逆性強等特點，在我國的綠化樹木中占比很大［1］，被認定為木本植物研究中的新型模式植物之一［2］。此外，楊樹具有較高的纖維素含量和木質(zhì)素含量，是制漿造紙、鋸材、木質(zhì)復(fù)合板、包裝箱、集裝箱、人造板工業(yè)、火柴桿和筷子的原材料［3］。因此對于楊樹的研究，蘊含著巨大的經(jīng)濟價值。84K楊（銀白楊×腺毛楊）是韓國選育的一個白楊派無性系雜種。春季沒有飛絮的環(huán)保型白楊派雄性無性系84K 楊的推廣，是加速防護林建設(shè)、平原綠化、西部大開發(fā)中退耕還林與改善生態(tài)的有力保障。同時由于84K 楊生長速度快，出芽率高，繁殖方便等特點逐漸成為抗性研究的典型模式植物之一。

眾所周知，植物體在應(yīng)對外界生物和非生物脅迫時會產(chǎn)生防御性次生代謝產(chǎn)物，它可保護植物體抵御昆蟲、病原微生物、干旱/水澇、高溫/低溫、食草動物等不利因素的傷害。因此，防御性次生代謝產(chǎn)物對植物體的生長發(fā)育、繁殖、材性積累等具有重要的作用［4～5］。已有研究表明楊樹在蟲害［6］、干旱［7］、低溫［8］等環(huán)境脅迫下可促使酚酸類次生代謝產(chǎn)物含量增加，包括阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、異阿魏酸等化合物［9］。因此，研究逆境脅迫下，楊樹中的酚酸類次生代謝產(chǎn)物含量的變化規(guī)律及相關(guān)生理響應(yīng)機制對其生長發(fā)育和材性積累具有重要的理論指導(dǎo)價值。

太陽輻射波長在150～400 nm，其中波長較短的為紫外光區(qū)，紫外線（UV）根據(jù)波長可以分為UV-A（320～400 nm）、UV-B（280～320 nm）和UV-C（200～280 nm）。UV-A 和UV-C 輻射對地球生物影響不大，地球上空的臭氧層也能夠阻擋對生物體有害的UV-B 輻射［10］。近年來，隨著工業(yè)社會的迅速發(fā)展，環(huán)境污染日趨嚴重，臭氧層遭到了嚴重破壞，致使到達地球表面的UV-B 輻射逐漸增強。過量的UV-B 輻射對植物體的影響主要體現(xiàn)在產(chǎn)生過量的ROS致使植物光合作用受損等，但UV-B 輻射可使植物體內(nèi)防御性次生代謝產(chǎn)物（如黃酮、多酚、木酯素、生物堿、皂苷、硫代葡萄糖苷等）積累得到增強［11～14］，此外抗氧化酶也可以消除由UV-B輻射而產(chǎn)生的過量ROS，以此保護植物體免受UVB輻射對其造成的傷害。眾所周知，植物體內(nèi)酚酸類化合物具備清除ROS 的能力，而楊樹中的防御性次生代謝產(chǎn)物是酚酸類化合物。因此，對于UV-B 輻射脅迫下，楊樹中防御性酚酸類次生代謝產(chǎn)物的變化情況及相關(guān)生理響應(yīng)機制非常值得探索研究。

基于上述，本研究選用生長迅速、適應(yīng)性強的84K 楊組培苗為實驗材料，對其在不同UV-B 輻射時間下酚酸類化合物、光合色素、氧化產(chǎn)物和抗氧化酶的含量變化進行監(jiān)測，以期初步明晰楊樹在抵御UV-B 輻射下的次生代謝調(diào)控及相關(guān)生理響應(yīng)機制，為楊樹在抗逆性培育、材性積累等方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

84K 楊組培苗由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室提供，其繼代及生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.01 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA，置于溫度25±2°C、光照強度2 000 Lx、光周期16 h·d-1的環(huán)境下進行培養(yǎng)。

1.2 84K楊組培苗的UV-B輻射處理

選取在上述培養(yǎng)條件下生長30 天、生長狀態(tài)良好且一致的84K 楊組培苗，放置于UV-B 燈下進行輻射處理（輻射強度控制在3 W·m-2），在不同時間點（0、0.5、1、2、4、6、8、12、16 和24 h）取樣，樣品經(jīng)自來水沖洗后，一部分迅速置于液氮中速凍，-80°C條件下保存，用于后續(xù)光合色素和ROS相關(guān)指標的測定；剩余部分樣品置于鼓風(fēng)干燥箱中，在45°C 條件干燥至恒重，用于后續(xù)酚酸類化合物的提取和檢測。因為受組培苗實驗材料所限，每個時間點我們采集了3 株84K 楊組培苗作為后續(xù)各項指標的檢測材料，且每個實驗重復(fù)3次。

1.3 酚酸類化合物的提取和檢測

6種酚酸類化合物標準品（阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸和異阿魏酸）均購自維克奇生物科技有限公司。分別精確稱取一定質(zhì)量的酚酸標準品溶解在甲醇（UPLC-MS級）中制成母液。用甲醇對標準品母液進行不同程度的稀釋，配置成一系列濃度的標準品溶液。所有標準品溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后儲存在棕色進樣瓶中，并置于-20°C 條件下保存。將上述干燥的84K楊組培苗用研缽充分粉碎，精確稱取0.1 g 樣品并加入2 mL 40%乙醇溶液，放置于超聲機中在40°C條件下提取60 min，靜置冷卻后8 000 r·min-1離心3 min 取上清溶液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾2 次后，保存于棕色進樣瓶中待測。

使用安捷倫1290超高效液相色譜儀串聯(lián)安捷倫6460 四極桿MS 檢測器對所有待測樣品進行分析檢測。色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18 柱，柱溫30°C；流速為0.4 mL·min-1，進樣量為1 μL。流動相由水（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫程序為：0～3 min，90%～75% A；3～3.1 min，75%～25%A；3.1～4.5 min，25%A；4.5～5 min，25%～90%A。質(zhì)譜條件為：毛細管電壓3.5 KV（ESI-），干燥氣溫度350°C，氣流10 L·min-1，霧化器電壓50 psi，加速電壓為4 V。在多反應(yīng)監(jiān)測模式下對6 個目標酚酸類化合物進行定性和定量分析，各目標化合物監(jiān)測離子對分別為：阿魏酸（m/z193.1→134.1）、咖啡酸（m/z179.0→135.1）、沒食子酸（m/z169.0→125.0）、原兒茶酸（m/z153.0→109.0）、綠原酸（m/z353.1→191.1）和異阿魏酸（m/z193.1→178.0）。由上述系列已知濃度的標準品溶液在上述檢測條件下，繪制每個目標化合物的標準曲線，樣品中目標化合物含量由標準曲線進行換算測定。

1.4 光合色素含量的提取和檢測

精確稱取上述冷凍的84K 楊組培苗葉片樣品0.05 g，將其置于研缽中，加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移到離心管中并加入5 mL提取溶液（丙酮∶95%乙醇=1∶1）中提取12 h。光合色素采用吸光光度法測定，具體條件如下：葉綠素A（Chl A）在663 nm波長下測定；葉綠素B（Chl B）在645 nm 波長下測定；類胡蘿卜素（Car）在480 nm 波長下測定；總?cè)~綠素含量Chl為Chl A和Chl B含量的總和［15］。

1.5 氧化產(chǎn)物含量的提取和檢測

本項研究中，84K 楊組培苗中氧化產(chǎn)物（過氧化氫、超氧陰離子與丙二醛）含量是通過蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒進行測定，具體測定方法如下：

過氧化氫（H2O2）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后轉(zhuǎn)移至EP 管中用試劑定容至1 mL。在8 000 r·min-1，4℃條件下離心10 min 后取上清溶液置于冰上待測，隨后將測定管與對照管中依次加入一定劑量的提取劑與樣本混勻下室溫靜置5 min 后倒入比色皿中，測定415 nm處吸光值A(chǔ)。計算△A=A測定-A對照；

超氧陰離子（OFR）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后在10 000 r·min-1，4°C 條件下離心20 min后取上清溶液置于冰上待測，隨后將測定管與空白管中依次加入一定劑量的提取劑與樣本混勻后，在8 000 r·min-1，25°C條件下離心5 min后倒入比色皿中，測定530 nm處吸光值A(chǔ)。計算△A=A測定-A空白；

丙二醛（MDA）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后在8 000 g，4°C 條件下離心10 min，取上清溶液置于冰上待測。吸取0.6 mL 試劑盒試劑于1.5 mL 離心管中，再加入0.2 mL 樣本混勻。在95°C 水浴中保溫30 min 后置于冰上冷卻，隨后在10 000 g，25°C條件下離心10 min。吸取上清液于1 mL倒入比色皿中，測定532 和600 nm 處的吸光值，記為A532和A600，計算△A=A532-A600。

1.6 抗氧化酶活性檢測

本項研究中，84K 楊組培苗中抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶）是通過蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒進行測定，具體測定方法如下：

超氧化物歧化酶（SOD）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后在8 000 r·min-1，4°C 條件下離心10 min取上清置于冰上待測，隨后將測定管與對照管中依次加入一定劑量的提取劑與樣本混勻下室溫靜置30 min 后倒入比色皿中，測定450 nm 處吸光值A(chǔ)；

過氧化物酶（POD）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后在8 000 r·min-1，4°C 條件下離心10 min 取上清置于冰上待測，隨后在比色皿中加入50 μL樣本和950 μL 工作液混勻，記錄470 nm 下1 min 時吸光值A(chǔ)1和2 min時的吸光值A(chǔ)2。計算△A=A2-A1；

過氧化氫酶（CAT）首先按照植物鮮重（g，F(xiàn)W）：提取液體積（mL）為1∶10 的比例進行冰浴勻漿后在8 000 r·min-1，4°C 條件下離心10 min 取上清置于冰上待測，隨后將測定管與對照管中依次加入一定劑量的提取劑與樣本，混勻后取1 mL 溶液于比色皿中，測定405 nm處吸光值A(chǔ)。計算△A=A對照-A測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)使用Origin 2018 軟件進行作圖。運用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果差異性顯著分析是通過單變量方差分析（ANOVO）結(jié)合鄧肯檢驗在P＜0.05 的顯著水平上實現(xiàn)的。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B 輻射對84K 楊組培苗中酚酸類化合物含量的影響

已有研究表明，楊樹中防御性次生代謝產(chǎn)物為酚酸類化合物，具體包括阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、異阿魏酸等［9］。據(jù)此，我們對UV-B 輻射脅迫下這6 種目標酚酸類化合物的含量變化進行研究。在本項研究中，UV-B 輻射設(shè)定為一個溫和的強度3 W·m-2（有利于觸發(fā)植物次生防御代謝反應(yīng)），不同UV-B 輻射時長下84K楊組培苗中6 種目標酚酸類化合物含量采用UPLC-MS/MS 進行定性和定量分析（如1.3 中所述）。實驗結(jié)果如圖1 所示，在UV-B 輻射脅迫下，84K 楊組培苗中除沒食子酸外的5 種酚酸化合物含量均有所增加，且總體呈先下降而后逐漸上升最終再下降的趨勢，其中在12～16 h 期間積累量最高，尤其是綠原酸含量增加幅度最大（15倍左右）。整體而言，適當?shù)腢V-B 輻射可以增加84K 楊組培苗中的酚酸類化合物的積累。

2.2 UV-B 輻射對84K 楊組培苗葉片中光合色素含量的影響

已有研究表明，UV-B 輻射對植物體生長發(fā)育的直接影響在于其會干擾植物體內(nèi)葉綠體系統(tǒng)，改變?nèi)~綠素和類胡蘿卜素的含量，進而影響植物體的光合作用［16］。因此，我們需要對UV-B 輻射下84K 楊組培苗葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的含量變化進行研究。植物葉片的表型是顯示植物光合色素是否受影響的最直觀方式。如圖2 所示，UVB輻射在16 h前對84K楊組培苗葉片無明顯傷害，在24 h時出現(xiàn)輕微灼燒現(xiàn)象。如圖3A～C 所示，隨著UV-B 輻射處理時間的增加，葉綠素A、葉綠素B和總?cè)~綠素含量除0.5 h 外較輻射前均有所提高。在0.5 h 時，84K 楊組培苗葉片中葉綠素A、葉綠素B 和總?cè)~綠素含量均低于對照，這體現(xiàn)了UV-B 輻射脅迫對植物體的瞬時傷害效應(yīng)。在16 h時，84K楊組培苗葉片中葉綠素含量達到了最高值，可能是因為組培苗中酚酸類化合物有效防護了UV-B輻射對植物體產(chǎn)生的傷害，從而保護甚至增強了84K 楊組培苗中光合色素的合成和積累，酚酸類化合物含量變化與葉綠素含量變化趨勢相一致說明了這一點。此外，類胡蘿卜素與酚酸類化合物含量變化趨勢也相一致（見圖3D）。類胡蘿卜素是一種抗氧化劑，在生物膜上、電子吸收和傳遞過程中起著重要作用，有保護葉綠素的作用。同時，類胡蘿卜素中具有的共軛雙鍵，能夠吸收紫外線，可有效減弱其對光合色素的破壞［17］。作為葉綠素的保護色素，類胡蘿卜素和酚酸類化合物一樣，在應(yīng)對UV-B 輻射對于84K 楊組培苗傷害方面具有相同的防御性作用。因此，其含量變化與酚酸類化合物含量變化較為一致。

2.3 UV-B 輻射對84K 楊組培苗中氧化產(chǎn)物含量和抗氧化酶活性的影響

UV-B 輻射是通過誘使植物體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS 而對細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子和膜系統(tǒng)產(chǎn)生傷害［18］。我們推測UV-B 輻射脅迫對上述酚酸類化合物和光合色素含量的影響可能與ROS 的產(chǎn)生有關(guān)，因此，我們對ROS 系統(tǒng)中的典型指標包括氧化產(chǎn)物含量（H2O2、MDA 和OFR）和抗氧化酶活性（SOD、POD 和CAT）進行測定。以此來驗證UV-B 輻射下ROS 的產(chǎn)生情況。作為生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，UV-B 輻射下84K 楊組培苗中H2O2、MDA 和OFR 含量變化如圖4A～C 所示，隨著UV-B 輻射時長的增加，所有氧化產(chǎn)物指標的含量在不同時間點下均高于輻射前，表明UV-B 輻射促進了84K 楊組培苗中ROS 的過量產(chǎn)生。此外，作為生物體內(nèi)活性氧分子的清除酶，UV-B 輻射脅迫下84K 楊組培苗中SOD、POD 和CAT 活性變化如圖4F 所示，隨著UV-B 輻射時長的增加，除CAT外，SOD和POD活性出現(xiàn)了不同程度的變化，尤其是POD活性在UV-B輻射處理下活性顯著增強，這也體現(xiàn)了84K 楊組培苗應(yīng)對UV-B輻射所引起的ROS傷害的積極防御反應(yīng)。

3 討論

本項研究結(jié)果表明除沒食子酸外，5種目標酚酸類化合物含量在UV-B 輻射下大多數(shù)時間均呈上升趨勢，很明顯UV-B 輻射促進了84K 楊中防御性酚酸類化合物的合成和積累。劉景玲等［19］對丹參進行不同時長的UV-B 輻射，發(fā)現(xiàn)丹參中咖啡酸等酚酸化合物隨著脅迫時間的增加整體含量呈上升趨勢。黨悅方等［20］發(fā)現(xiàn)低劑量的UV-B 輻射可以促進夏枯草中總酚含量升高。這些研究均與本項研究結(jié)果較為一致。通常情況下，UV-B 輻射會導(dǎo)致植物細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，一方面ROS 可對植物細胞大分子和生物膜造成傷害［21］，可直接觸發(fā)抗氧化酶系統(tǒng)活性用以清除過量的ROS；另一方面ROS 可作為重要的信號分子，觸發(fā)細胞內(nèi)產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)，最終激活具有抗氧化活性的防御性次生代謝產(chǎn)物生物合成酶基因表達上調(diào)從而使其含量升高，用以清除過量的ROS，維持細胞內(nèi)氧化還原水平的平衡。本項研究中，84K楊組培苗中酚酸類化合物含量隨著UV-B 輻射增加總體呈上升趨勢可歸因于這類化合物所具有的抗氧化活性，可清除UV-B 輻射脅迫所導(dǎo)致的過量ROS。此外，植物體內(nèi)的酚酸類物質(zhì)被報道具有吸收紫外光的特點［22］，因此目標酚酸類化合物含量上升的結(jié)果也可能是因為84K 楊組培苗為了應(yīng)對持續(xù)增加的UV-B 輻射，通過不斷合成該類化合物用以減弱UV-B 對植物體的傷害。同時，在本研究中觀察到了酚酸類化合物含量在UV-B 輻射脅迫的前期和后期呈降低趨勢，這可能是因為在輻射的前期植物體無法對脅迫進行及時的防御響應(yīng)，輻射的后期由于UV-B 輻射劑量過大，超過84K 楊組培苗的耐受極限，對其體內(nèi)防御系統(tǒng)產(chǎn)生了不可逆的傷害，從而導(dǎo)致酚酸類化合物含量出現(xiàn)了降低（如圖2 葉片在24 h 時出現(xiàn)了灼傷現(xiàn)象）。

葉綠素是綠色植物進行光合作用所需最重要的色素，同時它也是衡量植物體對UV-B 輻射耐受性的重要生理指標之一［23］。本研究結(jié)果表明，光合色素隨UV-B 輻射的增加總體呈上升趨勢。張娟等［24］對豌豆芽苗菜進行不同程度的UV-B 輻射，發(fā)現(xiàn)其葉綠素含量隨著UV-B 輻射脅迫強度的增加呈上升趨勢。褚潤等［25］對蘆葦進行不同程度的UV-B 輻射脅迫，發(fā)現(xiàn)低強度的UV-B 輻射對葉綠素的合成和積累有促進作用。韓雯等［26］對擬南芥進行不同程度的UV-B 輻射，發(fā)現(xiàn)適宜強度UV-B輻射可使葉綠素的含量得到增強。這些研究均與本項研究結(jié)果較為一致。本項研究中，隨著UV-B輻射時長的增加，一方面84K 楊組培苗中酚酸化合物含量的持續(xù)增加，有利于清除體內(nèi)ROS 從而保護了葉綠素的合成不受影響；另一方面，植物在UV-B（非白光）照射下，為了保持其正常的光合作用，將會增強葉綠素的合成?；谏鲜鰞蓚€原因，84K 楊組培苗葉片中葉綠素的含量在UV-B 輻射下呈現(xiàn)了不僅未受影響反而得到增強的結(jié)果。此外，我們發(fā)現(xiàn)了光合保護素類胡蘿卜素的含量變化與防御性酚酸類化合物含量變化趨勢較為一致，這是因為類胡蘿卜素可以減弱UV-B 對光合電子轉(zhuǎn)移鏈的破壞［27］，并且還可以吸收過量光能來保護葉綠素不被氧化［28］從而抵御UV-B 輻射對光合色素的傷害。

眾所周知，植物在正常生長環(huán)境下，其體內(nèi)的活性氧將維持在一個穩(wěn)定的水平，當其受到逆境脅迫時，植物體內(nèi)會大量積累活性氧，將會打破細胞內(nèi)氧化還原平衡。進而引起生物大分子聚合以及膜脂過氧化，破壞細胞的正常結(jié)構(gòu)與生理功能［29］。在植物受到氧化損傷時，體內(nèi)的酶促防御系統(tǒng)（抗氧化酶）與非酶促防御系統(tǒng)（非酶類抗氧化物質(zhì)）將協(xié)同清除細胞內(nèi)的活性氧自由基。在本實驗中隨著UV-B 輻射的增強，84K 楊組培苗中H2O2、MDA 和OFR 含量均在不同時間出現(xiàn)了增高現(xiàn)象。

崔曉曉等［30］發(fā)現(xiàn)UV-B 輻射會增加懷地黃中氧化產(chǎn)物的含量。周璇等［31］發(fā)現(xiàn)UV-B 輻射會增加沙棘幼苗中氧化產(chǎn)物的含量。董開升［32］等發(fā)現(xiàn)UV-B 輻射會增加孔石莼、鼠尾藻中氧化產(chǎn)物的含量，同時酚酸類化合物與抗氧化酶含量皆有不同程度的響應(yīng)變化。本項研究中，84K 楊組培苗中氧化產(chǎn)物含量的升高表明了UV-B 輻射脅迫確實觸發(fā)了ROS 的過量產(chǎn)生。同時，抗氧化酚酸類化合物含量的整體增加與抗氧化酶（特別是POD）活性的增強展現(xiàn)了84K 楊組培苗的酶促防御系統(tǒng)與非酶促防御系統(tǒng)對于ROS 的協(xié)同清除現(xiàn)象，也是對UV-B輻射所引起的氧化應(yīng)激的典型防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

本項研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在溫和的輻射強度下（3 W·m-2），適當?shù)腢V-B 脅迫處理（12～16 h）有利于84K 楊組培苗中除沒食子酸外的5 種目標酚酸類化合物（阿魏酸、咖啡酸、原兒茶酸、綠原酸和異阿魏酸）的合成和積累。同時，防御性酚酸類次生代謝產(chǎn)物和類胡蘿卜素可對葉綠素形成有效保護，對其在UV-B 輻射下的合成和積累產(chǎn)生了積極的影響（含量整體呈現(xiàn)上升趨勢）。研究還發(fā)現(xiàn)UVB 輻射確實觸發(fā)了84K 楊組培苗中ROS 的過量產(chǎn)生，抗氧化酚酸類化合物與抗氧化酶（特別是POD）對ROS 的清除展示出了協(xié)同效果，體現(xiàn)了植物體對UV-B 輻射脅迫所引起的氧化應(yīng)激的典型防御反應(yīng)?？傮w而言，本項研究初步明晰了楊樹在抵御UV-B 輻射下的次生代謝調(diào)控及相關(guān)生理響應(yīng)機制，為未來楊樹的抗逆性培育方面提供了一定的理論依據(jù)。