外源H2S供體NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)特性的影響

劉建新 劉瑞瑞 劉秀麗 賈海燕 卜 婷 李 娜

（甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，慶陽 745000）

裸燕麥（Avena nudaL.）是起源于中國(guó)的一種禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena）一年生雜糧作物，我國(guó)主要在內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西和甘肅等地種植，播種面積僅次于小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）［1］。裸燕麥雖具較強(qiáng)抗逆性，但其籽粒蛋白質(zhì)和油脂含量高，種子容易劣變［2］。北方地區(qū)土壤常含較高鹽堿成分，使鹽堿脅迫成為抑制裸燕麥種子萌發(fā)的重要限制因子之一［3］。種子播前預(yù)處理是提高作物種子活力的一項(xiàng)重要措施，其中浸種是一種操作簡(jiǎn)單、便于實(shí)施的有效方法［4］。因此，探尋鹽堿條件下提高種子活力的浸種劑及適宜使用濃度對(duì)提高鹽堿地裸燕麥的成苗率具有重要意義。

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是植物體中發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子，它參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝過程調(diào)控［5］，并能增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐性。如Lai 等［6］發(fā)現(xiàn)，用NaHS 預(yù)處理能夠阻止Na-Cl 脅迫引起的紫花苜蓿（Medicago sativa）幼苗根部K+的外流，從而保持胞內(nèi)Na+和K+的穩(wěn)態(tài)。Chen等［7］進(jìn)一步證明，外源H2S 通過NO 介導(dǎo)的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)子及H+-ATPase 蛋白和基因表達(dá)來保持高鹽脅迫下大麥（Hordeum vulgare）幼苗的Na+、K+平衡。外源H2S 在植物種子萌發(fā)及逆境響應(yīng)過程中也發(fā)揮著重要作用。如外源H2S 激活β-淀粉酶活性，促進(jìn)小麥種子萌發(fā)［8］；通過增強(qiáng)活性氧清除，減緩干旱抑制水稻種子萌發(fā)［9］；并提高鹽脅迫苜蓿種子萌發(fā)抗氧化酶同工酶活性和轉(zhuǎn)錄物水平［10］；促進(jìn)NaCl 脅迫下番茄（Lycopersicon esculentum）種子活力提升［11］。然而，用外源H2S 供體NaHS 浸種對(duì)鹽堿混合脅迫下作物種子萌發(fā)特性影響的研究目前尚未見報(bào)道。本研究以裸燕麥種子為試驗(yàn)材料，模擬其在甘肅種植區(qū)土壤的鹽堿組成，研究不同濃度NaHS 浸種處理對(duì)不同強(qiáng)度鹽堿混合脅迫下種子萌發(fā)特性的影響，探索不同強(qiáng)度鹽堿條件下提高作物種子活力適宜的NaHS浸種濃度，以期為農(nóng)作物種子播前預(yù)處理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和鹽堿溶液配制

供試裸燕麥品種‘定莜9 號(hào)’種子由甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。H2S 供體硫氫化鈉（NaHS）購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。按文獻(xiàn)［12］方法分別配制NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3原液，模擬甘肅省裸燕麥種植區(qū)土壤鹽堿成分，按NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3摩爾比12∶8∶1∶9配制不同濃度鹽堿混合溶液。

1.2 種子發(fā)芽試驗(yàn)

裸燕麥種子表面消毒后洗凈、晾干，分別用濃度為0、50、100、200 和400 μmol·L-1NaHS 溶液在常溫黑暗條件下浸種8 h，然后用清水沖洗干凈。取培養(yǎng)皿（直徑120 mm）鋪一層濾紙，分別選飽滿健康、大小均一且用不同濃度NaHS 浸種的種子100 粒均勻擺在培養(yǎng)皿中，分別加入濃度為0、15、30、45、60 mmol·L-1鹽堿混合溶液5 mL，置于培養(yǎng)箱中25℃、光/暗（16 h/8 h）交替培養(yǎng)。以胚根突破種皮2 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，在種子置床后每12 h 觀察1 次，記錄種子發(fā)芽數(shù)，每次觀察時(shí)補(bǔ)充適量鹽堿溶液，共觀察6 d。發(fā)芽6 d后，每皿隨機(jī)選取10粒萌發(fā)苗用直尺測(cè)量胚芽長(zhǎng)；將每皿全部發(fā)芽苗殺青30 min 后采用稱重法測(cè)定幼苗（根、芽）干重，計(jì)算每株幼苗干重（SDW）。試驗(yàn)以每個(gè)培養(yǎng)皿為1次重復(fù)，共重復(fù)3次。

1.3 萌發(fā)參數(shù)的計(jì)算

發(fā)芽結(jié)束后，根據(jù)記錄和測(cè)定結(jié)果，分別計(jì)算種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、平均發(fā)芽時(shí)間等萌發(fā)參數(shù)。

式中：Gt為t（d）的種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

式中：S為胚芽長(zhǎng)。

式中：Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt為相應(yīng)天數(shù)的發(fā)芽數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

為綜合反映NaHS 浸種對(duì)鹽堿脅迫下種子萌發(fā)的影響，分別計(jì)算Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 的隸屬函數(shù)值，通過客觀法賦權(quán)，計(jì)算綜合評(píng)價(jià)值D［12］。所有數(shù)據(jù)用SPSS20.0 軟件單因素或雙因素方差分析，其中百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換后分析，SSR 法檢驗(yàn)差異顯著性，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子發(fā)芽率的影響

由表1 可知，在不同濃度NaHS 處理下，裸燕麥種子發(fā)芽率（Gp）隨鹽堿濃度增大呈顯著下降變化，說明鹽堿混合脅迫顯著抑制裸燕麥種子的發(fā)芽率。在0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下，與0 μmol·L-1NaHS 處理（CK）相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理均能一定程度提高Gp，200和400 μmol·L-1NaHS處理的Gp差異不顯著或明顯下降；在45 和60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS 處理的Gp與CK 差異不顯著或使Gp顯著降低。說明50或100 μmol·L-1NaHS 浸種能夠提高30 mmol·L-1以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子的發(fā)芽率。

表1 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of soaking seeds with NaHS on germination percentage of naked oat seeds under salt-alkali stress（%）

2.2 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子發(fā)芽指數(shù)的影響

表2 顯示，除15 mmol·L-1鹽堿脅迫能顯著提高0 μmol·L-1NaHS 處理的發(fā)芽指數(shù)（Gi）外，隨鹽堿濃度提高，不同濃度NaHS 處理的Gi均呈顯著下降趨勢(shì)。在0～45 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理的Gi與0 μmol·L-1NaHS 處理相比均有一定程度提高，200和400 μmol·L-1NaHS處理的Gi 差異不顯著或顯著下降；在60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS 處理的Gi均低于0 μmol·L-1NaHS處理。

表2 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子發(fā)芽指數(shù)的影響Table 2 Effect of soaking seeds with NaHS on germination index of naked oat seeds undersalt-alkali stress

2.3 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子活力指數(shù)的影響

表3 表明，在不同濃度NaHS 處理下，隨鹽堿濃度提高，裸燕麥活力指數(shù)（Vi）呈持續(xù)顯著下降趨勢(shì)。50和100 μmol·L-1NaHS處理顯著提高了0 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Vi，50 μmol·L-1NaHS 處理使15 和30 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Vi 一定程度提高，而其他濃度NaHS 處理的Vi 顯著下降。說明50 μmol·L-1NaHS 浸種可以提高30 mmol·L-1及以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子的活力指數(shù)。

表3 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子活力指數(shù)的影響Table 3 Effect of soaking seeds with NaHS on vigor index of naked oat seeds under salt-alkali stress

2.4 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子平均發(fā)芽時(shí)間的影響

從表4可知，隨鹽堿濃度提高，0和50 μmol·L-1NaHS 處理的平均發(fā)芽時(shí)間（MGT）無顯著差異，100～400 μmol·L-1NaHS 處理的MGT 呈顯著降低趨勢(shì)。在0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下，不同濃度NaHS處理的MGT無顯著差異；在45和60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS處理的MGT低于0 μmol·L-1NaHS 處理。說明NaHS 浸種不會(huì)影響30 mmol·L-1及以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子萌發(fā)的平均發(fā)芽時(shí)間，但會(huì)縮短45 mmol·L-1以上濃度鹽堿脅迫下的平均發(fā)芽時(shí)間。

2.5 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥萌發(fā)苗單株干重的影響

由表5 可見，隨著鹽堿濃度和NaHS 濃度提高，裸燕麥萌發(fā)苗單株干重（SDW）均呈顯著下降趨勢(shì)。與0 μmol·L-1NaHS處理相比，除50 μmol·L-1NaHS 處理使0 和15 mmol·L-1鹽堿脅迫下的SDW差異不顯著外，其他濃度NaHS處理均使不同濃度鹽堿脅迫下的裸燕麥萌發(fā)苗SDW 顯著下降。說明用50～400 μmol·L-1NaHS 浸種并不能促進(jìn)裸燕麥萌發(fā)苗的生長(zhǎng)。

表5 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)苗單株干重的影響Table 5 Effect of soaking seeds with NaHS on dry weight of each plant of naked oat seedlings undersalt-alkali stress（mg）

2.6 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值的影響

不同發(fā)芽指標(biāo)對(duì)NaHS 和鹽堿濃度的響應(yīng)存在差異，為綜合反映裸燕麥種子萌發(fā)狀況，采用隸屬函數(shù)計(jì)算上述發(fā)芽指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)值（D）。從表6 可知，隨著鹽堿濃度提高，不同濃度NaHS處理的D值均表現(xiàn)為顯著下降變化。與0 μmol·L-1NaHS處理相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 不同程度提高了0～45 mmol·L-1鹽 堿 脅 迫 下 的D 值，200 和400 μmol·L-1NaHS 的D 值差異不顯著或明顯降低；在60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，不同濃度NaHS 處理的D值無顯著差異。

表6 NaHS浸種對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)值（D）的影響Table 6 Effect of soaking seeds with NaHS on comprehensive evaluation value of membership function（D）for naked oat seed germination under saline-alkali stress

2.7 鹽堿與NaHS 濃度對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的雙因素方差分析

從表7 可見，鹽堿濃度對(duì)Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值的影響極顯著；NaHS 濃度對(duì)Gp、Gi、Vi、SDW和D值的影響極顯著，對(duì)MGT的影響顯著；鹽堿濃度和NaHS 濃度的交互作用對(duì)Gp、Gi、Vi、SDW的影響極顯著，對(duì)MGT和D值的影響顯著。

表7 鹽堿濃度和NaHS濃度對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的雙因素方差分析Table 7 Two-way analysis of variance for salt-alkali and NaHS concentrations on seed germination of naked oat

與CK 相比，15 mmol·L-1鹽堿脅迫除顯著降低Vi 和SDW 外，對(duì)Gp、Gi、MGT 和D 值無顯著影響；除30 mmol·L-1鹽堿脅迫的MGT 無顯著變化外，30～60 mmol·L-1鹽堿脅迫的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D 值顯著降低（見表8）。表9 表明，與CK 相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理下Gp 變化不顯著，Gi、Vi 和D 值升高，MGT 和SDW 下降；200 和400 μmol·L-1NaHS 處理顯著降低了Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D值。

表9 NaHS濃度對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)影響的多重比較Table 9 Multiple comparisons of the effects of NaHS concentration on seed germination of naked oat

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的影響

中國(guó)大約有1/4 耕地面積的鹽漬化土壤，鹽堿脅迫成為抑制作物種子萌發(fā)，從而導(dǎo)致出苗不齊和幼苗生長(zhǎng)速率降低的障礙因素［3～4］。裸燕麥這一重要雜糧作物雖然具有耐鹽堿的優(yōu)良特性［1］，但鹽堿脅迫仍對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用，進(jìn)而造成其產(chǎn)量和品質(zhì)下降［13］。有研究表明，低鹽（50～100 mmol·L-1）脅迫對(duì)燕麥種子萌發(fā)［14］、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)［15］及根數(shù)［4］增加有一定促進(jìn)作用，但較高強(qiáng)度鹽堿脅迫顯著抑制燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，表現(xiàn)為隨鹽堿脅迫加劇，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)下降，胚根和胚芽生長(zhǎng)減緩［3］，植株干重和葉面積［16］、莖長(zhǎng)和莖生物量降低［17］。有關(guān)燕麥種子萌發(fā)對(duì)不同類型鹽堿響應(yīng)的研究結(jié)果顯示，無論是單鹽或復(fù)鹽脅迫［18］，還是中性鹽或堿性鹽脅迫［19］，總體上表現(xiàn)為單鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制程度大于復(fù)鹽脅迫，堿性鹽脅迫的抑制程度大于中性鹽脅迫。本研究進(jìn)一步表明，鹽堿混合脅迫對(duì)裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值有極顯著的影響（見表1～7），隨著鹽堿混合脅迫濃度提高，裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值呈顯著下降趨勢(shì)，其中15 mmol·L-1鹽堿脅迫對(duì)Gp、Gi、MGT 和D 值的影響不顯著，卻使Vi和SDW 顯著降低（見表8），說明低濃度鹽堿混合脅迫雖不影響種子萌發(fā)，而顯著抑制萌發(fā)苗的生長(zhǎng)；30～60 mmol·L-1鹽堿混合脅迫使裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D值顯著下降（見表8），表明中高濃度的鹽堿混合脅迫對(duì)裸燕麥種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用。這與楊科等［20］的鹽堿混合脅迫對(duì)不同品種燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響的趨勢(shì)基本一致，但程度有所不同。

3.2 外源H2S 對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)特性的影響

利用外源信號(hào)物質(zhì)緩解作物鹽堿脅迫是一種有效方式。目前在緩解燕麥鹽堿脅迫傷害上施用的外源信號(hào)物質(zhì)主要有NO 和H2O2等［21～22］，而利用外源氣體信號(hào)H2S 供體NaHS 浸種能否緩解鹽堿脅迫對(duì)作物種子萌發(fā)抑制的研究迄今鮮見報(bào)道。有研究表明，用NaHS 處理能夠減弱NaCl 脅迫對(duì)紫花苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抑制［10］；NaCl 脅迫下兩種耐鹽性不同的番茄種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨著NaHS 濃度提高呈先升后降趨勢(shì)［11］。前人的這些研究以單一中性鹽脅迫為對(duì)象，主要針對(duì)NaHS 處理濃度對(duì)作物種子活力的影響。本研究模擬土壤鹽堿環(huán)境，探討了鹽堿混合脅迫下鹽堿濃度和NaHS 浸種濃度交互對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)特性的影響，并采用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)了外源H2S 對(duì)鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發(fā)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaHS 濃度及NaHS 濃度和鹽堿濃度的交互作用對(duì)Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D值有顯著或極顯著的影響（見表7）。本試驗(yàn)中，50和100 μmol·L-1NaHS 處理沒有引起Gp 的顯著改變，卻使Gi、Vi 和D 值升高，MGT 和SDW 下降；200和400 μmol·L-1NaHS 處 理 的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值均顯著降低（見表1～6，9）。Gp是最終發(fā)芽率高低的體現(xiàn)，Gi 和MGT 反映發(fā)芽速率的快慢，Vi 和SDW 與發(fā)芽苗的健壯程度相關(guān)［14～15］。這說明用50 和100 μmol·L-1NaHS 浸種雖不能提高鹽堿混合脅迫下裸燕麥種子的發(fā)芽率和促進(jìn)萌發(fā)苗生長(zhǎng)，相反還對(duì)幼苗生長(zhǎng)有抑制作用，但可加快種子的萌發(fā)速率，而200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種則顯著抑制裸燕麥種子的萌發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，50 和100 μmol·L-1NaHS 不同程度提高了0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Gp（見表1）和Vi（見表3）及0～45 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Gi（見表2）和D 值（見表6），而MGT 和SDW 變化不大或顯著下降（見表4～5）；200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種則降低了不同濃度鹽堿脅迫下的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值，50～400 μmol·L-1NaHS 浸 種 使60 mmol·L-1鹽堿脅迫下的各發(fā)芽指標(biāo)無顯著變化或明顯下降（見表1～6）。這說明用NaHS浸種能夠緩解鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的抑制，但緩解作用與鹽堿脅迫強(qiáng)度和NaHS濃度有關(guān)?？傮w來看，50和100 μmol·L-1NaHS 能夠緩解45 mmol·L-1以下濃度鹽堿脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，其中50 μmol·L-1NaHS 的 效 果 好 于100 μmol·L-1，而200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種反而會(huì)加重鹽堿脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，NaHS 浸種不能緩解60 mmol·L-1鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的抑制。這與鮑敬等［23］以小麥種子為材料的研究結(jié)果基本一致。而外源H2S 促進(jìn)鹽堿脅迫下作物種子萌發(fā)的作用機(jī)理尚需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

外源H2S 供體NaHS 浸種可以提高裸燕麥種子在鹽堿混合脅迫下的萌發(fā)能力，且這種作用與NaHS 濃度及鹽堿濃度有關(guān)，以50 μmol·L-1NaHS浸種緩解低于45 mmol·L-1鹽堿混合脅迫的效果最佳，NaHS 對(duì)60 mmol·L-1鹽堿混合脅迫抑制裸燕麥種子萌發(fā)無緩解作用，高濃度（200和400 μmol·L-1）NaHS加重鹽堿脅迫對(duì)裸燕麥種子萌發(fā)的抑制。