豬源偽狂犬病病毒變異株傳代致弱株LA2017株的獲得與鑒定

鄭亞婷,郭容利,陳賽賽,喬永峰,王志勝,許夢(mèng)微,5,劉婭梅,張傳健,呂家軒,5,王繼春*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所,江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210014；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所,江蘇 南京 210014；5.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)是豬的一種以發(fā)熱、繁殖障礙和腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病[1],其流行方式包括散發(fā)與地方性流行。PR在全年任何時(shí)間均可發(fā)生,其中冬季與春季發(fā)生較多。近年來(lái)養(yǎng)豬業(yè)呈集約化發(fā)展,并且集約化程度越來(lái)越高,使PR的危害變得更為嚴(yán)重。PR由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起,PRV屬于皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科、水痘病毒屬,為一種線性雙鏈DNA病毒,其基因組全長(zhǎng)約145 kbp,共編碼70多種蛋白質(zhì)[2]。在PRV中共發(fā)現(xiàn)了11種糖蛋白,包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN。病毒對(duì)細(xì)胞的吸附需要gB和gC參與,病毒與細(xì)胞質(zhì)膜的融合需要gB、gH、gI等蛋白。與病毒增殖相關(guān)的必需蛋白包括gB、gD、gH、gK、gL以及gN,非必需蛋白主要有g(shù)C、gE、gG、gI和gM[3]。這些蛋白可以介導(dǎo)PRV與受感染動(dòng)物細(xì)胞之間的融合,促使病毒的擴(kuò)散與釋放,以及影響宿主細(xì)胞蛋白合成跟免疫逃避[4]。

目前公認(rèn)對(duì)豬偽狂犬病有效的防控方法是疫苗免疫,其中PRV基因缺失疫苗具有毒力低、免疫原性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可區(qū)分疫苗免疫與自然野毒感染動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)[4],有兩種類型,分別為自然缺失弱毒活疫苗以及基因工程人工缺失活疫苗。自然缺失弱毒活疫苗的制備方法主要包括由野毒株直接盲傳,加誘變劑或由非豬源細(xì)胞盲傳,也可以通過(guò)提高培養(yǎng)溫度傳代獲得。目前市場(chǎng)已有的自然缺失弱毒活疫苗主要有:匈牙利的Bartha株、羅馬尼亞的Bucharest株、BUK株[5]、TK200株、北愛(ài)爾蘭的NIA4株、法國(guó)的Alfort-26株[6]、前蘇聯(lián)的VGNK-I株、保加利亞的MK25株、南斯拉夫的Bkal68株和Govacc株、中國(guó)的C株等[7]。

PRV基因工程人工缺失疫苗是為降低病毒毒力,將野毒株基因組中與致病力相關(guān)的基因經(jīng)人工缺失突變后制備出的一種活疫苗,主要?jiǎng)h除的有TK、RR、gE、gI等相關(guān)基因。市場(chǎng)上已有的PRV基因工程疫苗或疫苗候選株主要包括gE/gI/TK基因缺失的SA215、缺失TK/gG基因的HB-98疫苗株、gE缺失的LA-A株[8]、gE/TK雙缺失的LA1206株[9]、gE/gI基因缺失的PRVJS-2012候選株[10]、gE/gI缺失[11]以及gE/gI/TK缺失[12]的PRVTJ株、gE/gI/TK缺失的PRVHN1201株[13],以及gE/gI缺失的PRVZJ01株[14]等。雖然目前已成功研制出缺失gC與gG基因的疫苗,可是大多數(shù)國(guó)家在豬上只允許使用缺失gE基因的疫苗,因此,可以通過(guò)血清學(xué)診斷技術(shù)來(lái)區(qū)分接種過(guò)疫苗的豬以及感染野生病毒的豬[15]。

20世紀(jì)60年代PRV開(kāi)始在中國(guó)流行,之后BarthaK61株、HB-98株和SA215株疫苗的使用使疫情得到了良好的控制[16]。但是,在2011年,很多注射過(guò)BarthaK61疫苗的養(yǎng)殖場(chǎng)的豬都感染了PRV,表現(xiàn)為新生仔豬患致命性腦炎,母豬出現(xiàn)繁殖障礙,生長(zhǎng)育肥豬和仔豬大量死亡。經(jīng)分離鑒定,證實(shí)此次暴發(fā)流行是由PRV變異株引起的[17],說(shuō)明傳統(tǒng)疫苗株已經(jīng)不能完全免疫PRV的流行變異株,需要研制出針對(duì)變異株的新型疫苗[18]。

本試驗(yàn)取豬源偽狂犬病病毒強(qiáng)毒變異株AH02LA株進(jìn)行傳代,獲得了致弱株LA2017株,并對(duì)其安全性、穩(wěn)定性、免疫效力及生長(zhǎng)特性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示傳代致弱株LA2017株免疫原性好、安全性高,在ST細(xì)胞及CEF上生長(zhǎng)良好,滴度均能滿足活疫苗生產(chǎn)的要求,是一株研制針對(duì)PRV變異株疫苗的優(yōu)良候選株。

1 材料與方法

1.1 材料

毒株:偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)AH02LA株,系本研究團(tuán)隊(duì)分離鑒定的強(qiáng)毒株,已交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏,保藏號(hào)為CGMCC No.10891,保藏日期為2015年6月16日。

細(xì)胞: 雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblasts, CEF)，按常規(guī)方法制備；用于制備 CEF的SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

28～35日齡健康斷奶仔豬,以及PRV、PRRSV和CSFV抗原和抗體均為陰性；試驗(yàn)豬來(lái)自南京市六合區(qū)養(yǎng)殖戶,試驗(yàn)豬引入后在隔離環(huán)境中飼養(yǎng)。

主要試劑:LA Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、2×GC Buffer Ⅰ(Ⅱ)、DL 15000 DNA Marker來(lái)自寶生物工程(大連)有限公司。胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基為Invitrogen公司產(chǎn)品；CIVTEST SUIS ADV gB、CIVTEST SUIS ADV gE診斷試劑盒購(gòu)自西班牙HIPRA公司,其他各種試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 偽狂犬病病毒PRV AH02LA株的盲傳 將9～10日齡SPF雞胚制備CEF,培養(yǎng)液用含10%初生牛血清的DMEM,置于37 ℃培養(yǎng)箱中24～48 h,獲得單層CEF細(xì)胞。取PRV AH02LA 株F6代病毒液0.1 mL接種于六孔板CEF細(xì)胞中的1孔,吸附1 h。棄上清,用無(wú)菌PBS洗滌3次后,吸凈上清,加入含10%初生牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37 ℃培養(yǎng)箱中24～48 h。用以上方法再取細(xì)胞培養(yǎng)物上清0.1 mL接種于新鮮CEF,直至盲傳到F185代,每10～20代取樣凍存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PRV AH02LA株盲傳致弱株種子批的建立 應(yīng)用PRV AH02LA株盲傳致弱株的F20、F51、F110、F151和F185代,接種長(zhǎng)滿單層的新鮮ST細(xì)胞。培養(yǎng)36～48 h后收獲,凍融3次,以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，然后取上清,分裝保存于-70 ℃。取樣按現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢測(cè)病毒的TCID50。

1.2.3 PRV AH02LA株盲傳致弱株的安全性 應(yīng)用PRV AH02LA株盲傳致弱株的F20、F51、F110、F151和F185代,分別以0.5×106.50TCID50/mL的劑量滴鼻接種28～35日齡PRV陰性斷奶仔豬(PRRSV抗原和抗體也為陰性)各5頭,每頭接種2 mL。攻毒后每日對(duì)試驗(yàn)豬的體溫、精神狀態(tài)、飲食情況與臨床表現(xiàn)進(jìn)行檢測(cè)與觀察,直至接種后14 d。并檢測(cè)接種前和接種后的PRV gE和gB的ELISA抗體。

1.2.4 PRV AH02LA株盲傳致弱株的免疫保護(hù)效力 應(yīng)用PRV AH02LA株盲傳致弱株的F151和F185代,選取28～35日齡PRV陰性斷奶仔豬(PRRSV抗原和抗體也為陰性),以0.5×106.00TCID50/mL的劑量頸部肌肉注射，分別接種5頭試驗(yàn)豬,每頭接種2 mL。在21 d后,用PRV AH02LA株以106.50TCID50/mL的劑量對(duì)這兩組與對(duì)照組同時(shí)進(jìn)行滴鼻攻毒,每頭接種2 mL。攻毒后每日進(jìn)行體溫監(jiān)測(cè),觀察試驗(yàn)豬的精神狀態(tài)、飲食以及臨床表現(xiàn),并通過(guò)鼻拭子樣品來(lái)檢測(cè)排毒,持續(xù)至攻毒后14 d。分別在攻毒前、攻毒后14 d檢測(cè)PRV gE和gB的ELISA抗體。設(shè)BarthaK61疫苗作為對(duì)照。

1.2.5 病毒的克隆純化 制備CEF并鋪于六孔細(xì)胞板中,將獲得的F151代致弱毒株稀釋至200～500 TCID50/mL,將其加入1孔細(xì)胞中,吸附1 h后吸去病毒液,細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗3次后,用含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲基纖維素和10%初生牛血清的DMEM培養(yǎng),置37 ℃下12～18 h。挑取單個(gè)病毒蝕斑,接種于新鮮的CEF,吸附1 h后,再經(jīng)洗滌后加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲基纖維素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按以上挑斑克隆純化步驟進(jìn)行3輪后,獲得了1株病毒,將其命名為PRV LA2017株(保藏號(hào):CGMCC No.18170)。

1.2.6 PRV LA2017株的序列測(cè)定

1.2.6.1 病毒DNA的提取 按文獻(xiàn)[19]所述的方法進(jìn)行,病毒以0.01感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)接種CEF。當(dāng)細(xì)胞病變大約為80%時(shí),去上清,在六孔板中加入2 mL/孔的消化液、20 μL/孔的蛋白酶K,于37 ℃緩慢振蕩過(guò)夜。將消化液分裝至EP管中,加入苯酚、氯仿(1∶1)混合液,輕搖5～10 min,以12000 r/min離心5 min；取上清至1個(gè)新的EP管,加入等體積的氯仿,輕搖5～10 min,以12000 r/min離心5 min；再取上清至1個(gè)新的EP管中,加入Rnase,使其終體積為20 μL/mL,置于37 ℃下孵育30 min。加入等體積的異丙醇及上清體積1/10的3 mol/L醋酸鈉,緩慢上下翻轉(zhuǎn)混勻后,以12000 r/min于4 ℃離心30 min；棄上清,用70%酒精洗滌沉淀2次,以12000 r/min 于4 ℃離心5 min；然后棄上清,置于通風(fēng)處晾干沉淀,在管底加入100～300 μL的滅菌水,置于37 ℃下30 min以溶解DNA,最后于-20 ℃保存。

1.2.6.2 PRVgC、gD和US6-US2序列的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 以GenBank中的PRV全基因組序列(GenBank: JF797218)為參考,使用Vector NTI軟件,設(shè)計(jì)gC、gD和US6-US2基因鑒定引物(詳見(jiàn)表1)。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

以病毒DNA為模板,按表1中的引物與表2中的體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序如下:94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s,58 ℃ 40 s,72 ℃延伸合適時(shí)間,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物用含1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,切出特異性條帶,用DNA凝膠回收試劑盒回收,產(chǎn)物送至華大基因公司測(cè)序。

1.2.7 PRV LA2017株的穩(wěn)定性檢測(cè) 將PRV LA2017株接種CEF，連續(xù)傳代,從F1代傳至F35代。分別提取F18和F35代病毒的DNA,并以此為模板,按上述體系與程序進(jìn)行PCR,將所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,切出特異性條帶,用DNA凝膠回收試劑盒回收,將產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

1.2.8 PRV LA2017株的生長(zhǎng)特性鑒定 將PRV LA2017株F1、F18和F35代以0.004 MOI分別接種長(zhǎng)滿單層的六孔板上的CEF和ST細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中吸附1 h,棄上清,細(xì)胞用PBS洗3次后,換2 mL/孔、含3% FBS的DMEM,放回37 ℃培養(yǎng)箱中。分別于接種后0、6、12、24、36、48和72 h測(cè)定培養(yǎng)物中病毒含量。設(shè)PRV AH02LA株F5代種毒為對(duì)照,采用相同方法檢測(cè),重復(fù)3次。細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒含量檢測(cè)按照以下方法:在指定時(shí)間點(diǎn)分別將培養(yǎng)物全部取出,經(jīng)-70 ℃與37 ℃反復(fù)凍融3次后取0.5～1.0 mL,以500 r/min離心5 min后,取100 μL上清液,加入到900 μL DMEM培養(yǎng)基中并混合均勻,再?gòu)闹形?00 μL,加入900 μL DMEM培養(yǎng)基中,重復(fù)以上步驟至10-10,即作10～1010倍比稀釋。將CEF與ST細(xì)胞鋪滿單層至96孔細(xì)胞板中,取不同滴度的病毒稀釋液分別接種CEF或ST細(xì)胞,每個(gè)濃度設(shè)置4～8個(gè)重復(fù),置于37 ℃培養(yǎng)箱中吸附2 h,棄去病毒液,用PBS洗滌3次后,在每孔中加入100 μL含3% FBS的DMEM培養(yǎng)基。放回培養(yǎng)箱中,在12 h之后,觀察細(xì)胞有無(wú)出現(xiàn)病變,持續(xù)3 d,用Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50,統(tǒng)計(jì)所有時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度,以此繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV AH02LA株盲傳致弱株的獲得與安全性

對(duì)PRV AH02LA株盲傳致弱株的F20、F51、F110、F151和F185代分別制備了種子批,病毒含量分別為108.25、108.00、108.00、107.875和108.00TCID50/mL。在接種健康斷奶仔豬后,F20、F51和F110代試驗(yàn)豬的體溫全部明顯升高,部分出現(xiàn)臨床癥狀,包括打噴嚏、食欲不振或廢絕、精神萎靡、呼吸困難、轉(zhuǎn)圈或臥地、四肢劃水狀等,甚至發(fā)生死亡；在接種后14 d，PRV gE和gB的ELISA抗體均為陽(yáng)性。F151和F185代接種豬的體溫均未超過(guò)39.5 ℃,飲食和精神均正常,未出現(xiàn)任何豬偽狂犬病癥狀；在接種后14 d，PRV gB的ELISA抗體均為陽(yáng)性,而PRV gE的ELISA抗體均為陰性(表3)。

表3 PRV AH02LA 株盲傳致弱株不同代次的安全性

2.2 PRV AH02LA株盲傳致弱株免疫后的攻毒保護(hù)作用

用PRV AH02LA株盲傳致弱株的F151和F185代對(duì)健康斷奶仔豬分別進(jìn)行免疫接種,在免疫后21 d同時(shí)用PRV AH02LA株對(duì)這兩組、BarthaK61疫苗免疫組以及對(duì)照組進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示:在攻毒之后，對(duì)照組試驗(yàn)豬全部出現(xiàn)體溫升高的癥狀,至41.5 ℃以上,并伴有打噴嚏、精神萎靡、食欲不振或廢絕、呼吸困難、轉(zhuǎn)圈或臥地、四肢劃水狀等癥狀,其中3頭試驗(yàn)豬死亡；經(jīng)檢測(cè)，攻毒后2～5 d均有排毒；經(jīng)血清學(xué)檢測(cè),攻毒前PRV gB和gE的ELISA抗體全部為陰性；在攻毒后14 d用試劑盒對(duì)存活豬的PRV gB和gE ELISA抗體進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果全部為陽(yáng)性。而接種了PRV AH02LA株盲傳致弱株F151和F185代的試驗(yàn)豬在攻毒后體溫全部正常,沒(méi)有超過(guò)40.0 ℃,同時(shí)飲食和精神狀況沒(méi)有出現(xiàn)異常,也未出現(xiàn)任何豬偽狂犬病癥狀,并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)排毒現(xiàn)象；在攻毒前PRV gB的ELISA抗體均為陽(yáng)性,而PRV gE的ELISA抗體均為陰性；在攻毒后14 d,PRV gB和gE的ELISA抗體均為陽(yáng)性。BarthaK61免疫對(duì)照組的試驗(yàn)豬均出現(xiàn)發(fā)病,并且體溫高至40.5 ℃以上,且在攻毒后2～5 d均可檢測(cè)到排毒,排毒可持續(xù)3～5 d(表4)。

表4 PRV AH02LA 株盲傳致弱株免疫后的攻毒保護(hù)作用

2.3 偽狂犬病病毒PRV LA2017株的PCR鑒定與序列測(cè)定

以PRV LA2017株的DNA為模板,以gC F/R這1對(duì)引物擴(kuò)增獲得了3700～4000 bp的特異性片段,測(cè)序結(jié)果表明其gC基因序列與AH02LA株完全一致。以gD F/R這1對(duì)引物擴(kuò)增獲得了1300～1600 bp的特異性片段,測(cè)序結(jié)果表明其gD基因序列與AH02LA株完全一致。以US6-US2 F/R這1對(duì)引物擴(kuò)增獲得了2000～2300 bp的特異性片段(圖1),測(cè)序結(jié)果表明該毒株缺失了從gI基因第118位核苷酸至28K基因第251位核苷酸的共3686 bp堿基,包括gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因(圖2)。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL15000)。

圖2 PRV LA2017株基因缺失片段結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 偽狂犬病病毒PRV LA2017株的穩(wěn)定性檢測(cè)

測(cè)序結(jié)果顯示: F18和F35代病毒的gC和gD基因與LA2017株F1代完全一致；US6-US2片段基因缺失的位點(diǎn)也與LA2017株F1代完全一致(圖3),表明該毒株傳代35代以內(nèi)穩(wěn)定。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL15000)。

2.5 PRV LA2017株的生長(zhǎng)特性鑒定

從病毒的體外生長(zhǎng)曲線可以看出,PRV LA2017株在CEF細(xì)胞(圖4)或ST上(圖5)F1、F18和F35代具有相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征，在接種后24～48 h都達(dá)到峰值,在CEF上滴度達(dá)到108.0TCID50/mL以上,在ST細(xì)胞上滴度最高可達(dá)到109.5TCID50/mL以上,均能滿足活疫苗生產(chǎn)的要求。

圖5 PRV LA2017株在ST細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線

3 討論

PRV進(jìn)行感染后只能在豬上存活,因此PR主要在豬群中發(fā)生。從2011年以來(lái),中國(guó)豬群中PRV變異株大規(guī)模流行,其致病力增強(qiáng),抗原性也發(fā)生了改變。目前疫苗免疫仍是防控豬偽狂犬病,凈化以及控制野毒感染的有效方法。目前市場(chǎng)上應(yīng)用的主要是Bartha K61等傳統(tǒng)疫苗,但這些疫苗均不能在PRV的流行變異株感染的情況下提供完全保護(hù)。

本實(shí)驗(yàn)室將自行分離鑒定的偽狂犬病病毒變異株AH02LA株在CEF上進(jìn)行盲傳致弱,獲得了PRV LA2017株(保藏號(hào):CGMCC No.18170)。與PRV AH02LA株相比,兩者gC和gD基因的序列完全一致,PRV LA2017株的缺失片段共有3686 bp堿基,從gI基因的第118位核苷酸開(kāi)始,至28K基因第251位核苷酸,包括gI部分基因、gE全部基因、11K全部基因和28K部分基因。gC和gD作為PRV重要的保護(hù)性抗原基因,在盲傳過(guò)程中序列未發(fā)生改變,說(shuō)明PRV LA2017的免疫原性基本上未受到盲傳的影響。高俊鋒等[20]分離到了豬偽狂犬病毒C株,經(jīng)6代盲傳后,提取病毒DNA并擴(kuò)增gE基因,測(cè)序結(jié)果顯示, PRV C株在第989～4468位基因缺失,此缺失片段大小為3570 bp,包含全部的gE基因。武吉強(qiáng)等[21]將1株偽狂犬病病毒變異毒株(JS-2012株)連續(xù)傳代致弱,將所得毒株命名為JS-2012-F120株,兩者相比,JS-2012-F120在gE、gI基因區(qū)域有2307個(gè)堿基缺失,說(shuō)明gE基因所在位點(diǎn)可能存在某些特殊結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其容易發(fā)生缺失。本試驗(yàn)只檢測(cè)了F151代(PRV LA2017)的gE基因,因此這種缺失是逐步發(fā)生的還是一次性發(fā)生的？有待于進(jìn)一步研究。

我們?cè)谝郧暗难芯恐杏肂arthaK61弱毒苗經(jīng)肌肉注射接種后1周攻毒,發(fā)現(xiàn)在攻毒后的14 d內(nèi),經(jīng)BarthaK61弱毒苗接種的免疫豬沒(méi)有出現(xiàn)豬偽狂犬病臨床癥狀；從攻毒后2～3 d開(kāi)始,通過(guò)檢測(cè)鼻拭子均能發(fā)現(xiàn)排毒情況,并持續(xù)3 d左右,最長(zhǎng)可持續(xù)4 d[22]。而試驗(yàn)豬在接種BarthaK61后21 d用強(qiáng)毒攻毒的結(jié)果顯示并未受到有效保護(hù),說(shuō)明BarthaK61株的活疫苗并不能阻止變異株的排毒,只可以提供短時(shí)間的保護(hù),但是不能長(zhǎng)期維持。在本試驗(yàn)中,用PRV LA2017接種28～35日齡健康斷奶仔豬,21 d后應(yīng)用PRV AH02LA株進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示:免疫豬在攻毒前、后的體溫均未超過(guò)40.0 ℃,飲食和精神均正常,未出現(xiàn)任何豬偽狂犬病癥狀；攻毒前PRV gB的ELISA抗體均為陽(yáng)性,而PRV gE的ELISA抗體均為陰性；攻毒后14 d，PRV gB和gE的ELISA抗體均為陽(yáng)性。說(shuō)明PRV LA2017具有較高的安全性，并且可以對(duì)免疫豬起到完全的保護(hù)作用,而且能阻止排毒,非常有利于我國(guó)偽狂犬病毒變異株的凈化。PRV LA2017株在傳至35代后,gC、gD基因以及基因缺失位點(diǎn)序列與LA2017株F1代完全一致,體現(xiàn)出其良好的穩(wěn)定性。

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)指的是細(xì)胞在生物反應(yīng)器中自由懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)生長(zhǎng)增殖的一種培養(yǎng)方法,可以在很大程度上減少人力物力的投入,有可控性強(qiáng)、規(guī)模大、單產(chǎn)效能高、細(xì)胞質(zhì)量好、病毒效價(jià)高、批間差異小等優(yōu)勢(shì),同時(shí)可以監(jiān)控并且查找其生產(chǎn)的過(guò)程[23],因此可以作為PRV LA2017疫苗制備方法的研究方向。雞胚成纖維細(xì)胞具有制備方法簡(jiǎn)單、細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，適應(yīng)性、耐受性及穩(wěn)定性高、不易被豬外源病毒污染等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)PRV疫苗生產(chǎn)[24]。ST細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞傳代細(xì)胞系,具有可懸浮培養(yǎng)、可增殖的病毒種類多、不致瘤、具有較高的安全性、較好的遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn),其在最近一段時(shí)間以來(lái)在豬瘟疫苗的生產(chǎn)中有很多應(yīng)用。有多種細(xì)胞可適應(yīng)PRV的增殖并能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變,研究表明,CEF與ST細(xì)胞相比較,PRV在ST細(xì)胞上產(chǎn)生病變更快,并且在CEF細(xì)胞上的增殖效率明顯低于在ST細(xì)胞上的[25-27]。在本試驗(yàn)中,PRV LA2017株在CEF上的滴度達(dá)到了108.0TCID50/mL以上,在ST細(xì)胞上的滴度最高可達(dá)到109.5TCID50/mL以上,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致,均能滿足活疫苗生產(chǎn)的要求。本試驗(yàn)表明所獲得的PRV LA2017株可以作為預(yù)防和控制我國(guó)PRV新疫情的DIVA疫苗候選株。