順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株生物學(xué)特性影響的實驗研究①

張 君 歐冊華 劉 莉 賈 飛 洋 超 趙 鵬

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，瀘州 646000)

乳腺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性生命健康[1]。雖然我國乳腺癌發(fā)病率相對發(fā)達(dá)國家較低，但近年來我國乳腺癌患者逐年遞增，且發(fā)病率趨于年輕化[2-3]。手術(shù)切除和化療輔助治療為目前主要的治療方式，但手術(shù)切除和化療輔助治療均會給患者帶來嚴(yán)重的生理和心理創(chuàng)傷，因此尋求藥物輔助抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的運動及活性尤為重要[4]。順式阿曲庫銨是阿曲庫銨的一種同分異構(gòu)體，是一種手術(shù)麻醉藥物[5]。YABASIN等[6]研究表明，順式阿曲庫銨可通過線粒體誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本文旨在研究順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株生物學(xué)特性影響，以期了解順式阿曲庫銨對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的作用機(jī)制，從而為乳腺癌的輔助治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2藥物與試劑 順式阿曲庫銨購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(國藥準(zhǔn)字：H20060869)；E-cadherin、Vimentin抗體購自上海滬尚生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶購自上海生工生物股份有限公司；EDU(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine)購自美國Sigma公司；N-cadherin抗體購自Santa Cruze Biotechnology 公司；Bax、Bcl-2抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司；細(xì)胞色素C(cytochrome C)、PARP和cleaved PARP抗體購自南京建成生物工程研究所；VEGF抗體購自武漢博歐特生物科技有限公司；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst染色劑購自武漢默沙克生物科技有限公司；VEGF熒光試劑盒購自江萊生物有限公司；TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱購自日本SanYo公司；BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司；Line gegn 9600 PCR儀購自石家莊奧龍科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將各組乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。每2 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞長滿瓶底后消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞用PBS緩沖液清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶溶液消化，當(dāng)細(xì)胞變圓即將脫離瓶壁時，停止消化。計數(shù)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2藥物干預(yù) 調(diào)整對數(shù)生長期細(xì)胞濃度為1×105個/ml，以100 μl/孔接種于96孔板，37℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)(約16 h)，各組分別使用含0、5、10、20 μmol/L順式阿曲庫銨的完全培養(yǎng)基 200 μl 培養(yǎng)24 h。并根據(jù)處理濃度分為對照組、順式阿曲庫銨5 μmol/L組、順式阿曲庫銨10 μmol/L組、順式阿曲庫銨20 μmol/L組。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測 取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，根據(jù)EDU染色試劑盒說明書，用完全培養(yǎng)基將EDU稀釋至10 μmol/L，每孔加入100 μl，孵育4 h 后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，多聚甲醛固定，Apollo染色，立即檢測或用抗熒光淬滅封片后檢測細(xì)胞增殖情況。采用克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長，取對數(shù)生長期細(xì)胞，制作1×105個/ml單細(xì)胞懸液并計數(shù)，并將細(xì)胞接種至6孔板中梯度培養(yǎng)，2周后顯微鏡下可見明顯克隆形成，結(jié)晶紫染色后拍照，并計算克隆形成率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，使用胰酶消化，在4℃離心機(jī)中離心 5 min 收集細(xì)胞；收集細(xì)胞后加入100 μl Binding Buffer重懸，并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI輕輕混勻；室溫避光孵育 15 min并加入400 μl Binding Buffer使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5Hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡 取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，待乳腺癌MCF-7細(xì)胞長至80%匯合度，胰蛋白酶消化，以1.5×106個/孔接種于6孔板，預(yù)先置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋的SiO2溶液，再次培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次后每孔加入1 ml Hoechst 33342染色液于37℃培養(yǎng)箱中孵育25 min，而后室溫下避光孵育15 min，在熒光顯微鏡下以紫外光激發(fā)，觀察并計數(shù)。每組隨機(jī)選取視野，計算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)(每組不少于1 000個)，并計算凋亡率。

1.2.6劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 將劃痕實驗插件置于24孔板，取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，調(diào)整對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞調(diào)至5×105個/孔，37℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)，次日小心移去劃痕實驗插件，用完全培養(yǎng)基潤洗3次，加入10 μmol/L 絲裂霉素，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基，100倍顯微鏡下拍照記為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后拍照，分析細(xì)胞的遷移情況，實驗重復(fù)3次。

1.2.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，Transwell小室中將5 μg 纖黏連蛋白用移液器均勻涂抹在小室內(nèi)的PVDF聚碳酸濾膜外表面；膜內(nèi)側(cè)表面涂5 μg matrigel。調(diào)整細(xì)胞量2×105個/孔，設(shè)置3個復(fù)孔；加入不同濃度的阿曲庫銨于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)4 h。PBS清洗3次并去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞，以多聚甲醛固定；400倍顯微視野下隨機(jī)選取10個視野，倒置顯微鏡下采用雙盲計數(shù)法統(tǒng)計膜下表面的細(xì)胞數(shù)目平均值。實驗重復(fù)3次。

1.2.8Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平 取上述藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，吸除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基保存于滅菌離心管。1 200 r/min離心10 min后加入裂解液重懸細(xì)胞，冰中裂解30 min，再次以1 200 r/min離心10 min，加入200 μl Loading Buffer 緩沖液，100℃煮沸 10 min；以BCA法測定蛋白濃度后，SDS-PAGE電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜后放入 TBST 溶液中緩慢搖動洗膜5 min，再將 PVDF 膜放入配制好的一抗(1∶500)中孵育，室溫下?lián)u動30 min后放入4℃恒溫箱中過夜。取出后使用TBST洗滌3次后放入二抗反應(yīng)液中室溫孵育 2 h；封閉液：二抗為2 000∶1；曝光后以Actin為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值為相對蛋白表達(dá)水平。

1.2.9免疫熒光法檢測VEGF陽性表達(dá)情況 取對數(shù)生長期乳腺癌MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105個/ml，取2 ml接種于6孔板，37℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)(約16 h)。按照VEGF熒光試劑盒說明書加入固定液固定10 min，棄固定液，PBS清洗3次，加入免疫染色液，室溫封閉1 h，加入DAPI染液，室溫染色5 min，洗滌液洗滌2次，加入抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.10RT-PCR檢測VEGF基因表達(dá) TRIzol 試劑提取各組細(xì)胞總 RNA，測定 RNA 濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA后PCR擴(kuò)增，按照試劑盒操作說明書檢測RNA表達(dá)水平，以Actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算RNA的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0軟件，作圖軟件采用GraphPda Prism5，方差分析使用單因素方差分析，使用單因素方差分析時，以P<0.05為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果 相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組EDU陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10 μmol/L、20 μmol/L組EDU陽性細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.05，圖1A)。由圖1B可知，相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L 組細(xì)胞克隆形成率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L 組細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.05)。

圖1 細(xì)胞增殖能力檢測結(jié)果

2.2細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 由圖2A可知，相比于對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細(xì)胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。由圖2B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細(xì)胞凋亡率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

2.3細(xì)胞運動能力檢測結(jié)果 相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組侵襲細(xì)胞數(shù)目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著降低(P<0.05，圖3A)。相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細(xì)胞遷移率無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05，圖3B)。

圖3 細(xì)胞運動能力檢測結(jié)果

2.4細(xì)胞運動相關(guān)蛋白檢測結(jié)果 由圖4A可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組N-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；由圖4B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Viminten陽性斑點數(shù)無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Viminten陽性斑點數(shù)顯著降低(P<0.05)。

圖4 細(xì)胞運動相關(guān)蛋白檢測結(jié)果

2.5微管形成實驗結(jié)果及VEGF表達(dá)情況 由圖5A可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組節(jié)點數(shù)目無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L 組節(jié)點數(shù)目顯著降低(P<0.05)；由圖5B可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組VEGF蛋白表達(dá)水平及VEGF mRNA表達(dá)無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L VEGF蛋白表達(dá)水平及VEGF mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

圖5 微管形成實驗結(jié)果及VEGF表達(dá)情況

2.6凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果 由圖6可知，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Bax、Bcl-2、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Bax、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖6 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，其在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7]。王文廉等[8]研究表明VEGF可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖及遷移，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步生長。本研究表明，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組VEGF蛋白表達(dá)水平及VEGF mRNA表達(dá)無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組VEGF蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低。EDU染色結(jié)果顯示，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)目無顯著變化，順式阿曲庫銨10 μmol/L組陽性細(xì)胞數(shù)目顯著降低。平板克隆實驗結(jié)果分析顯示，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組細(xì)胞克隆形成率無顯著變化，順式阿曲庫銨10 μmol/L組細(xì)胞克隆形成率顯著降低。提示順式阿曲庫銨可有效降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力，但當(dāng)順式阿曲庫銨劑量低于5 μmol/L時作用效果并不明顯。宋瑩等[9]研究表明，抑制VEGF-A表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)論一致。

細(xì)胞的侵襲和遷移受上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)調(diào)節(jié)[10-11]。EMT是指上皮細(xì)胞能暫時喪失細(xì)胞極性獲得間質(zhì)細(xì)胞移動能力。腫瘤細(xì)胞能夠通過細(xì)胞極性喪失改變自身細(xì)胞形態(tài)與其他細(xì)胞分離[12-13]；N-鈣黏蛋白(N-cadherin，CDH2)也稱為鈣黏著蛋白-2或神經(jīng)鈣黏著蛋白，是人體由CDH2 基因編碼的蛋白質(zhì)。N-鈣黏蛋白是在多種組織中表達(dá)并起到介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞黏附功能的跨膜蛋白。付麗梅等[14]研究表明，N-cadherin陽性表達(dá)率與癌的浸潤深度、分化程度、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且隨著癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生N-cadherin蛋白表達(dá)量顯著增加。唐瑩等[15]研究表明，Vimentin是一種間質(zhì)細(xì)胞來源的骨架蛋白，在維持間質(zhì)細(xì)胞特性中起關(guān)鍵作用。其研究還表明，Vimentin表達(dá)出現(xiàn)異常時，細(xì)胞骨架蛋白的構(gòu)成也會發(fā)生顯著改變，這種改變會導(dǎo)致正常上皮細(xì)胞變成纖維狀且易于游動遷移，促使細(xì)胞的侵襲、遷移能力增強(qiáng)。EMT晚期時Vimentin表達(dá)量通常會顯著強(qiáng)加，這也是EMT晚期的顯著標(biāo)志之一[16]。本研究表明，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組E-cadherin N-cadherin蛋白表達(dá)及Viminten陽性斑點數(shù)無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組N-cadherin蛋白表達(dá)及Viminten陽性斑點數(shù)顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高。同時Transwell結(jié)果及劃痕實驗結(jié)果也表明使用10 μmol/L順式阿曲庫銨后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲及遷移能力顯著降低。這可能是由于順式阿曲庫銨可通過抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附能力，阻止腫瘤細(xì)胞運動，從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞擴(kuò)散的效果。郭昭澤等[17]研究表明，調(diào)節(jié)EMT過程可使乳腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力減弱，與本研究得出的結(jié)論一致。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-PARP，c-PARP)是一種與DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的酶[18]。PARP影響細(xì)胞凋亡與Caspase 家族的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3密切相關(guān)[19]。當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動時會激活Caspase-3，將PARP剪切成 85 kD 和 31 kD 2個片段，破壞PARP與DNA 的相互作用可導(dǎo)致PARP的靶蛋白Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶活性增強(qiáng)，促使DNA裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。除了Caspase家族基因可以調(diào)控凋亡外，Bcl-2 家族的基因也是常見的凋亡控制基因。Bcl-2 家族主要通過Bcl-2和Bax這兩種蛋白表達(dá)量觀察細(xì)胞是否凋亡[20-22]。Bax和Bcl-2表達(dá)呈相反趨勢，當(dāng)Bcl-2表達(dá)下降時 Bax 表達(dá)上升，此時會促進(jìn)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2 表達(dá)升高，Bax表達(dá)降低時，則會抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號后，Bax/Bcl-2比值升高，線粒體膜電位變化并最終提高線粒體外膜通透性，同時會將cytochrome C釋放至細(xì)胞質(zhì)，并與 Apaf-1、procaspase-9形成復(fù)合體進(jìn)而激活Caspase-3 進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞凋亡過程[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比對照組，順式阿曲庫銨5 μmol/L組Bax、Bcl-2、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平無顯著變化，順式阿曲庫銨10、20 μmol/L組Bax、cytochrome C、PARP和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高。流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，當(dāng)順式阿曲庫銨處理濃度達(dá)到 10 μmol/L時，細(xì)胞凋亡率顯著升高，說明低劑量順式阿曲庫銨對乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡影響較小，當(dāng)處理劑量達(dá)到10 μmol/L時細(xì)胞凋亡率顯著升高。王瑩等[25]研究表明，通過促進(jìn)線粒體凋亡途徑可有效促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，順式阿曲庫銨可顯著抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移并促進(jìn)其凋亡。其作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞EMT過程并促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子Bax及Caspase家族凋亡因子相關(guān)，且在低劑量時作用效果不顯著，當(dāng)劑量超過10 μmol/L時，效果顯著。本研究未涉及體內(nèi)實驗，計劃在后續(xù)實驗中將乳腺癌MCF-7細(xì)胞注射至小鼠體內(nèi)，在小鼠體內(nèi)進(jìn)行成瘤實驗，進(jìn)一步探討順式阿曲庫銨在小鼠體內(nèi)是否可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。