微波消融治療腫瘤的免疫效應研究進展

周潔龍 程實 張余

微波消融(microwave ablation)可通過電磁波使生物體內(nèi)的極性分子(主要是水分子)反復快速摩擦產(chǎn)生高溫，從而實現(xiàn)腫瘤的滅活，目前廣泛應用于腫瘤的臨床治療[1]。作為一種局部熱療技術，微波消融在2013年被寫入肝癌治療臨床實踐指南，同時也應用于肺癌和結直腸癌等的治療[2-4]。微波消融具有升溫速度快、瘤內(nèi)溫度高、凝固性壞死徹底和激發(fā)機體抗腫瘤免疫效應等特點，與其他熱療技術相比，微波不受焦痂及干燥影響，對周邊血流影響較小，在滅活腫瘤組織的同時對周圍組織損傷較輕，因此特別適用于骨和肺等高阻抗(電阻大)臟器腫瘤的治療[5-6]。

微波消融不僅可通過熱效應直接殺傷腫瘤，還可通過消融過程中腫瘤抗原和危險信號分子的釋放誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應，使患者在腫瘤治療中獲益[7-10]。但是，目前對微波消融激發(fā)免疫反應機制尚缺乏深入的研究。對微波治療腫瘤的免疫效應的探究有利于微波消融在臨床中的應用及推廣。在此對已有的微波消融治療腫瘤的免疫原性死亡機制及相關病理改變過程的文獻報道進行綜述，并展望微波消融聯(lián)合免疫治療等方法在腫瘤治療中的應用前景。

一、微波消融誘導腫瘤免疫原性死亡

腫瘤的免疫原性死亡是指腫瘤在發(fā)生凋亡或者壞死的過程中通過釋放免疫原性分子如腫瘤抗原和危險相關模式分子(danger-associated molecular patterns,DAMPS)等誘導的免疫反應[11]。微波消融通過產(chǎn)生高熱使腫瘤細胞壞死并釋放溶酶體酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，組織發(fā)生缺血-再灌注損傷，產(chǎn)生并釋放鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)，增強抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)對腫瘤細胞抗原的攝取和處理，三磷酸腺苷(adenosine triphosphatase,ATP)招募和激活樹突狀細胞(dendritic cell，DC)，高表達免疫原性分子如高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box1 protein,HMGB-1)結合樹突狀細胞Toll 樣受體4(toll-like receptor-4,TLR-4)并啟動炎性反應，熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)作為分子伴侶協(xié)助APC攝取腫瘤抗原并誘導APC成熟，激活腫瘤特異性細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL),誘導適應性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生再一次腫瘤殺傷效應[9,12-17]

二、采用微波消融治療腫瘤激活機體免疫效應的病理過程

1.局部炎性反應：微波消融造成的腫瘤局部高溫環(huán)境使腫瘤在較短時間內(nèi)發(fā)生凝固性壞死，炎性細胞釋放一系列DAMPS，例如HSP，ATP和白細胞介素(interleukin,IL)等，引起局部炎性反應。有研究結果表明HSP與腫瘤抗原結合后形成復合物并釋放，被APC攝取后提呈給T細胞啟動免疫效應，例如單核細胞和巨噬細胞的極化[18-19]。此外，局部的炎性環(huán)境促進細胞因子如粒細胞集落刺激因子的釋放，也有助于促使T細胞和APC向腫瘤組織局部浸潤，發(fā)揮免疫作用[20]。Yu等[7]采用大鼠皮下骨肉瘤模型進行微波消融實驗，發(fā)現(xiàn)外周血中晚期炎癥指標HMGB-1釋放增多，可作為新腫瘤抗原與TLR-4結合誘導產(chǎn)生炎性反應。此外，該研究者將經(jīng)微波消融后的K7M2骨肉瘤細胞或UMR106骨肉瘤細胞的上清液注射到裸鼠體內(nèi)，2周后皮下種植K7M2或UMR106骨肉瘤細胞，檢測外周血得到HMGB-1升高的結果。盡管微波消融升溫速度快，瘤內(nèi)溫度高，但由于消融持續(xù)時間相對較短，腫瘤抗原暴露不充分，引起的局部炎性反應及繼發(fā)反應較為微弱[21-22]。以上研究結果表明，微波消融導致的凝固性壞死可引起局部炎性反應，局部的炎性因子及炎性細胞可介導抗腫瘤免疫反應，但是其具體機制仍有待探究。

2．募集活化免疫效應細胞：微波消融使腫瘤細胞在高溫下產(chǎn)生一系列病理變化，細胞膜穩(wěn)定性下降，細胞器及蛋白質(zhì)變性失活暴露于細胞外環(huán)境中，被APC如DC識別并呈遞給局部募集的T細胞[23]。微波消融作為一種外界熱刺激，引起腫瘤細胞HSP-70表達增多，HSP-70與細胞內(nèi)多肽結合形成HSP-70-多肽抗原復合物，有效激活并在消融區(qū)域富集DC和腫瘤特異性T細胞，DC的成熟和活化與腫瘤細胞釋放HSP的含量直接相關[24]。有研究者對82例肝細胞癌患者采用經(jīng)皮微波消融治療癌腫結節(jié)，術后隨訪2～26個月，在消融及未消融區(qū)域的結節(jié)中，T細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)和巨噬細胞數(shù)量顯著升高，消融結節(jié)中升高更為明顯[8]。對病灶局部微波消融募集CD8+T細胞也有較多研究。Chen等[25]以10 W功率對C57BL/6J小鼠肝癌模型進行癌灶微波消融，術后第10天提取小鼠脾細胞加入培養(yǎng)的肝癌細胞中，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞被殺傷，CD8+T細胞數(shù)量明顯升高，提示抗腫瘤效應可能主要來源于CD8+T細胞。有研究結果表明，采用微波消融殺傷腫瘤能夠募集T細胞以及其他免疫細胞如巨噬細胞、DC細胞等的抗腫瘤免疫效應和抑制腫瘤復發(fā)轉移效應[16,19,26]。Leuchte等[27]對23例肝癌患者接受微波消融治療后外周血T細胞與疾病結局的關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)約30%患者經(jīng)微波消融治療后出現(xiàn)腫瘤相關抗原特異性T細胞反應，外周血中γ-干擾素(interferon-γ,IFNY-γ)及IL-5升高，且與患者長期緩解及更長的無進展生存期相關，經(jīng)微波消融治療后腫瘤局部T細胞浸潤明顯增多。

3.激活抗腫瘤適應性免疫：經(jīng)微波消融治療后發(fā)生壞死或者亞壞死的骨腫瘤細胞能夠活化特異性T細胞，例如CD4+和CD8+T細胞，使機體產(chǎn)生適應性免疫反應，同時建立抗腫瘤記憶性免疫，控制局部腫瘤生長及復發(fā)，減少腫瘤遠處轉移[28]。對實體腫瘤進行微波消融治療后，腫瘤細胞微觀表現(xiàn)為細胞膜破裂、蛋白質(zhì)等多種分子變性以及細胞骨架和代謝過程發(fā)生改變。諸多基因和分子水平的病理改變狀態(tài)被稱為腫瘤變異負荷[29-30]。不同亞型的腫瘤抗原或突變多肽成為腫瘤微環(huán)境中適應性免疫的起點，APC將不同的腫瘤抗原呈遞給T淋巴細胞和其他細胞，不同類型T細胞進一步分化成熟，產(chǎn)生直接性抗腫瘤免疫或記憶性免疫應答[31]。在進行微波消融治療后，之前處于亞壞死狀態(tài)的腫瘤細胞向壞死發(fā)展，不斷成為腫瘤新抗原或突變多肽的來源，記憶性淋巴細胞可多次分化、識別并產(chǎn)生抗腫瘤效應。因此，保持并延長記憶性淋巴細胞的抗腫瘤活性，對抑制載瘤患者的腫瘤復發(fā)、遠處轉移及改善遠期生存質(zhì)量均有重大意義。

4.間接逆轉局部腫瘤免疫耐受：抑制調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoy T cell,Treg)被認為可逆轉腫瘤免疫耐受。Treg分布在許多惡性腫瘤及周圍組織中，能夠調(diào)節(jié)CD8+或CD4+T細胞，導致抗腫瘤免疫效應的減弱。關于Treg與卵巢癌、胃腸道惡性腫瘤和肝細胞癌等惡性腫瘤的進展和預后的關系已有較多研究，有臨床相關性研究和功能研究結果表明CD8+T細胞與Treg比值的升高與惡性腫瘤患者的預后不良和治療耐受相關，而且該項指標對患者預后不良預測的準確性高于單純的Treg數(shù)量值[4,32-33]。微波消融聯(lián)合免疫療法抑制Treg逆轉局部腫瘤免疫耐受的潛力有望改善日益增多的耐受免疫治療和化學治療的惡性腫瘤患者的現(xiàn)狀，但其具體機制仍需要深入的研究。骨肉瘤等高度惡性骨腫瘤患者的微波消融治療也是目前研究的重點方向。

三、腫瘤的微波消融聯(lián)合免疫治療研究現(xiàn)狀

1.臨床研究：已有臨床應用微波消融聯(lián)合免疫治療提高患者抗腫瘤免疫功能的研究報道。過繼細胞免疫治療是指提取并分離自體或異體免疫細胞，在進行體外修飾擴增后輸注至腫瘤患者體內(nèi)以增強患者機體免疫功能[35]。有研究者通過將過繼細胞免疫治療與微波消融相結合實現(xiàn)抗腫瘤效應。Yu等[15]對29例肝癌患者分別行微波消融和微波消融聯(lián)合免疫治療，對聯(lián)合免疫治療組患者分別在微波消融術后第9天、12天、15天、1個月和3個月進行雙側腹股溝淋巴結注射負載腫瘤裂解物的髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cells，MDC)、腹腔注射樹突狀淋巴細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞(dendritic cells-cytokine induced killer，DC-CIK)和靜脈注射細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)，結果表明，聯(lián)合免疫治療組患者外周血殺傷性T細胞亞群的比值(CD3+/CD8+和CD8+CD28+/CD3+CD16+CD56+)升高，而負性調(diào)節(jié)和輔助性T細胞亞群(CD4+CD8+，CD4+和CD4+CD25+)比例下降。免疫檢查點是免疫反應過程中具有抑制免疫反應作用的位點，阻滯該位點可激活T細胞的活性[35]。Xie等[9]采用微波消融聯(lián)合抗CTLA-4抗體(tremelimumab)治療16例晚期膽管癌患者，其中2例得到部分緩解，5例實現(xiàn)了疾病穩(wěn)定。微波消融聯(lián)合經(jīng)典免疫療法及免疫佐劑可促進機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應，在腫瘤患者的臨床治療中具有重大意義，但聯(lián)合免疫治療藥物的應用時機和劑量等序貫治療的策略需進一步研究。

2.基礎研究：Zhu等[36]依據(jù)實驗方法將乳腺癌模型小鼠分為對照組、微波消融組、抗PD-1抗體聯(lián)合抗CTLA-4抗體組、微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組分別進行處理，結果表明，微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組顯著延長小鼠生存期，同時小鼠外周血和腫瘤組織中的CD8+T細胞數(shù)量以及血漿中IFN-γ濃度明顯升高；治療后再對4組小鼠分別注射等量的乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)微波消融聯(lián)合抗PD-1抗體和抗CTLA-4抗體組明顯延遲了乳腺癌細胞的生長。Li等[23]依據(jù)實驗方法將乳腺癌模型小鼠分為對照組、微波消融組、免疫激活劑OK-432組、微波消融聯(lián)合OK-432組，結果表明微波消融聯(lián)合OK-432組小鼠的生存期得到顯著延長，腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD8+T細胞數(shù)量增加，消融后第25天對4組小鼠分別注射等量的乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)微波消融聯(lián)合OK-432組中83%(5/6)小鼠完全排斥外源性腫瘤，而其他組小鼠均出現(xiàn)新發(fā)體積不等的腫瘤。Wu等[37]采用微波消融和微波消融聯(lián)合細胞因子緩釋微球(cytokine sustained-release microspheres，cytoMPS)對肝癌模型小鼠進行實驗，結果表明聯(lián)合治療組CD4+與CD8+的比例以及CTL細胞對肝癌細胞的殺傷效應均明顯提高。Zhou等[38]聯(lián)合應用微波消融與甘露糖碳點材料對小鼠肝癌模型進行實驗研究，對小鼠肝癌模型進行微波消融處理后注入甘露糖碳點材料，能夠檢測到甘露糖碳點材料特異性攝取腫瘤相關抗原并呈遞給DC，產(chǎn)生抗腫瘤免疫效應。腫瘤主動特異性免疫治療(active specific immunotherapy,ASI)是采用經(jīng)過處理的腫瘤細胞或細胞裂解物制成疫苗，對腫瘤患者予以接種從而獲得免疫反應[39]。Yu等[7]采用微波消融處理大鼠和小鼠的骨肉瘤細胞懸液，并取消融后的腫瘤細胞及上清液接種至大鼠和小鼠體內(nèi)，二次接種同種骨肉瘤細胞后發(fā)現(xiàn)，血中IFN-γ和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)濃度升高并刺激CD8+T細胞生成，誘導有效的免疫反應抵抗骨肉瘤細胞的侵襲。建立并應用不同的腫瘤動物模型，可根據(jù)臨床需求對微波消融聯(lián)合不同免疫方法治療腫瘤的策略進行深入研究，有利于治療方法在臨床中得到安全有效的推廣和應用。

四、微波消融治療腫瘤存在的問題與未來應用的展望

1.存在的問題：隨著微波消融在腫瘤治療中的廣泛應用，其免疫效應逐漸被重視并得到深入研究。有研究者指出，在消融過程中將腫瘤細胞控制于中低溫狀態(tài)即可發(fā)生腫瘤細胞控制性壞死，這是微波消融激發(fā)免疫效應的理想狀態(tài)，在這種狀態(tài)下部分腫瘤細胞即刻凋亡壞死，部分亞壞死狀態(tài)腫瘤細胞持續(xù)向壞死細胞轉歸，不斷釋放免疫原性分子，可產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的免疫效應[40]。

然而，微波消融手術操作在微波功率、消融時間和溫度控制等方面尚缺乏統(tǒng)一量化的標準，導致微波消融治療后腫瘤細胞狀態(tài)不穩(wěn)定，處于凋亡、壞死和亞壞死狀態(tài)的腫瘤細胞比例不同，所釋放的腫瘤免疫原性抗原差異較大，因此所調(diào)動免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應程度不一，無法對治療方法逆轉局部腫瘤免疫耐受的能力進行評估[12]。如果把熱療技術作為活化機體抗腫瘤免疫反應的單一治療方式，所引發(fā)的抗腫瘤效應較弱[25,41]。不同種類腫瘤的腫瘤負荷差異較大，經(jīng)過微波消融激發(fā)的抗腫瘤免疫效應也無法得到準確的評估[26]。盡管對微波消融聯(lián)合免疫療法如化學治療、免疫檢查點抑制和細胞因子治療等[42]臨床前實驗建模的評估已經(jīng)實現(xiàn)，但如何更好地聯(lián)合使用兩種療法實現(xiàn)消融后抗腫瘤免疫效應最大化和持久化以及治療可能存在哪些不良反應等問題仍然需要進一步研究。

2.未來應用的展望：探索微波消融治療腫瘤激發(fā)機體抗腫瘤效應的免疫機制，聯(lián)合應用微波消融與其他治療方法，如免疫治療等，有利于提高腫瘤患者的臨床治療效果和推動微波消融在臨床治療中的規(guī)范應用。微波消融屬于熱應激，可引起與溫度變化相關的特異性分子變化。有研究結果表明，熱休克轉錄因子和熱休克蛋白均與腫瘤的局部復發(fā)和遠處轉移等有密切的聯(lián)系[43]。此外，盡管免疫治療如PD-1抑制劑的應用在許多惡性腫瘤的治療中取得了一定效果，但只有20%～30%患者從中獲益[44]。隨著惡性腫瘤轉移發(fā)生率不斷升高，采用微波消融治療轉移瘤，聯(lián)合應用微波消融和免疫療法增強免疫效應治療轉移及原發(fā)腫瘤，有望使更多腫瘤患者獲益。

與其他外科治療手段相比，微波消融治療具有基于熱刺激的非熱效應，可獲得基于局部治療的系統(tǒng)性反應，在獲得良好的近期臨床治療效果的同時，其遠期治療效果也應得到更多關注。在未來的研究中，采用微波消融結合生物材料以及聯(lián)合免疫檢查點抑制劑等增強機體抗腫瘤免疫效應的方法，殺傷原位腫瘤的同時對抗腫瘤的遠處轉移，將可能成為治療腫瘤特別是惡性轉移瘤的有效方法。微波消融激發(fā)的免疫效應存在巨大的臨床應用潛力，對其免疫效應產(chǎn)生機制的探索有利于推動微波消融及其聯(lián)合療法的臨床應用。