肉及肉制品摻假鑒別技術(shù)研究進展

許文娟 趙 晗 孔彩霞 韓 芳 劉文鵬 丁葵英 田國寧 段效輝

1.濰坊海關 山東濰坊 261041 2.合肥海關 安徽合肥 230000 3.煙臺海關 山東煙臺 264000

近年來，人們對于肉類產(chǎn)品安全性的關注從化學有害物殘留、微生物超標擴展到廉價肉摻假問題[1]。“假肉門”、國外“僵尸肉”問題的曝光，使得人們對于肉類安全更加擔憂。肉類摻假問題不僅關乎食品安全、營養(yǎng)價值和經(jīng)濟貿(mào)易等問題，更會危害消費者的身體健康，尤其是對某種肉類產(chǎn)品過敏的人群。在清真認證肉類食品中，摻入豬肉還會涉及宗教信仰等問題，妨礙社會安定和諧[2～4]。此外，我國近年來肉類進出口貿(mào)易往來不斷擴大，《中華人民共和國進出口稅則》中，海關對不同種類的進出口肉也有不同的稅率要求。不論從社會穩(wěn)定、消費者身體健康，還是進出口貿(mào)易監(jiān)管方面，對肉及肉制品進行摻假成分鑒別具有重要意義。

由于肉類產(chǎn)品種類繁多、成分復雜，而且摻雜物質(zhì)種類多，外觀組成和理化性質(zhì)又很接近，通常很難用一般的化學方法判定真?zhèn)蝃5]。目前，已報道的食品摻假檢測方法多達15種以上，從傳統(tǒng)的感官鑒定到基于核酸的聚合酶鏈式反應(PCR)、基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫(ELISA)、基于特征肽段檢測的質(zhì)譜分析等[6，7]。

本文將對肉類摻假鑒別中研究較多的6種常用技術(shù)的應用進展進行介紹，便于相關工作者根據(jù)實際工作選擇適合的方法開展工作。

1 聚合酶鏈式反應(PCR)

聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)，是基于核酸的檢測手段，具體原理是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA片段為模板，以預先設計好的特異性引物為起點，經(jīng)過高溫變性、低溫復性、適溫延伸等操作步驟，循環(huán)多次以后，體外擴增產(chǎn)生與母鏈DNA模板片段互補的子鏈DNA片段的技術(shù)，主要又可分為熒光定量PCR、數(shù)字PCR技術(shù)等[8～10]。以核酸為基礎來鑒別肉及肉制品是否摻假，可以避免被檢對象由于加工過程出現(xiàn)的檢測誤差，穩(wěn)定性較高，靈敏度好。

PCR是目前肉類鑒別應用最廣泛和成熟的方法之一。劉岑杰[11](2015)等采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了肉制品中的鴨源性成分，該文獻建立的方法檢出限低至0.01%，因此靈敏度好，利用該方法對市售的牛肉片、羊肉串等肉類樣品進行盲樣檢測，結(jié)果各樣品均發(fā)現(xiàn)了鴨源性成分，為監(jiān)管部門維護食品市場安全提供了數(shù)據(jù)支持。金鷺[12](2020)等利用實時熒光定量PCR技術(shù)(rPCR)結(jié)合微滴式數(shù)字PCR技術(shù)(dd PCR)，基于rPCR定量檢測數(shù)據(jù)，采用dd PCR建立采集數(shù)據(jù)與羊肉質(zhì)量的數(shù)學關系，確立了羊肉含量的定量方法，該方法特異性好，檢出限最低為0.01 ng/μL，能夠?qū)孔畹蜑?%的羊肉進行準確定量。陳曉宇[13](2021)等采用實時熒光PCR技術(shù)對牛肉及其制品中摻假情況進行研究，所建立的方法靈敏度高且重復性好，通過對流通環(huán)節(jié)不同渠道、不同種類的牛肉樣品進行動物源性成分調(diào)查，發(fā)現(xiàn)市售牛肉及制品的摻假類別主要為豬、雞、鴨或大豆成分。

我國已將PCR檢測技術(shù)作為鑒定肉類的標準方法，且以實時熒光PCR為主。相繼出臺的國家標準、行業(yè)標準和地方標準，已經(jīng)可以開展幾乎所有動物源性成分的檢測，代表性的標準有GB/T 21104-2007《動物源性飼料中反芻動物源性成分(牛、羊、鹿)定性檢測方法PCR方法》、GB/T 38164-2019《常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法》、SN/T 2980-2011《動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實時熒光PCR檢測方法》DB15/T 2025-2020《牛和豬源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法》。

PCR技術(shù)適用于多物種的鑒定，且具有靈敏、高效、準確等顯著優(yōu)點，雖然實時熒光PCR技術(shù)彌補了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的易交叉污染以及假陽性結(jié)果的不足，但存在檢測成本高，且易受DNA降解、復雜基質(zhì)干擾檢測結(jié)果等缺點[14,15]。

2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)是一種基于抗原-抗體的特異性識別，與酶的高效催化相結(jié)合的分析方法，具有簡便性、敏感性和特異性的特點。目前，應用于肉類食品鑒定的ELISA方法主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法、間接競爭法等，這些技術(shù)是通過定性與定量分析肉類樣品中特異性抗原從而實現(xiàn)源性鑒別的。近年來，ELISA技術(shù)在動物源性成分鑒別方面得到了廣泛的應用[16]。Kang’ethe[17](1982)等便使用間接ELISA技術(shù)檢測馬肉與牛肉的種屬特異性抗體，并據(jù)此將二者分開。駱訓國[18](2010)等采用酶聯(lián)免疫法檢測豬肉成分，方法的檢測靈敏度高，最低能檢測出1%的摻入量。Rencova[19](2000)等基于多克隆抗體建立了間接競爭ELISA方法，用于鑒別經(jīng)過熱加工的家禽、袋鼠、馬、老鼠的肌肉組織，方法的準確性較好。

采用酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測肉類摻假最大的缺陷是目的蛋白經(jīng)過加熱過程會變性，無法通過抗體進行檢測，有研究發(fā)現(xiàn)動物肌肉中的肌紅蛋白(MMb)具有熱穩(wěn)定性，可以基于肌紅蛋白建立識別方法。侯瑾[20](2018)將羊肌紅蛋白作為特異性指標建立了ELISA方法，能夠準確的定量出混合生肉和混合熟肉中生羊肉、熟羊肉的含量。

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的優(yōu)點是特異性強、靈敏度高，但在蛋白質(zhì)變性上有明顯短板，如果蛋白質(zhì)發(fā)生變性，則ELISA技術(shù)會受到顯著影響，因為抗原抗體的識別過程特異性很強，抗原蛋白質(zhì)一旦變性失活，就會導致抗原-抗體無法有效識別[21,22]。

3 重組酶等溫擴增技術(shù)

重組酶等溫擴增技術(shù)是一種新型的體外核酸等溫擴增技術(shù)，目前主要有重組酶聚合酶擴增(RPA)與重組酶介導擴增(RAA)2項技術(shù)[23]。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，雖然二者均基于核酸檢測，但PCR技術(shù)對溫度要求高，需要反復摸索得到反應過程的退火溫度，且程序復雜，耗時長。而重組酶等溫擴增技術(shù)無需進行高溫循環(huán)，恒溫條件下反映20min即可實現(xiàn)靶基因的有效擴增，反應時間縮短了，還可用于結(jié)果的實時分析，特別適合對大量樣品進行現(xiàn)場鑒別[24]。我國已將該技術(shù)制定成檢驗檢疫行業(yè)標準方法，用于政府部門對動物源性成分的監(jiān)管。如SN/T 5227.1-2019《出口食品中雞源性成分快速檢測重組酶介導鏈替換核酸擴增法(RAA法)》、SN/T 5227.5-2019《出口食品中牛源性成分快速檢測重組酶介導鏈替換核酸擴增法(RAA法)》等。

郭燕華[25](2017)等基于牛源性線粒體細胞色素B基因設計了特異性的RPA方法，其靈敏度低至0.1ng/μL，可用于鑒定生鮮肉、加工肉制品中的牛源性成分。苗麗[26](2019)等以雞線粒體細胞色素B基因，設計出特異性引物以及exo探針，據(jù)此建立了RAA方法，可以實現(xiàn)對烏雞肉、高山雞肉、白羽雞肉、野雞肉、蘆花雞肉DNA的快速特異性擴增，而對牛肉、羊肉、豬肉的DNA均未擴增，該方法對雞源性成分的最低檢測限為0.1%(質(zhì)量分數(shù))。

重組酶等溫擴增技術(shù)檢測速度快且不受場地限制，是一種較具推廣性的現(xiàn)場快速檢測方法，但同其他技術(shù)一樣，也易受多種因素干擾，如技術(shù)本身的酶活性、引物探針的設計，以及前處理、反應溫度等外在的操作因素[27]。此外，該方法反應體系固定、試劑成本較高，均限制了其實用性。

4 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜(MS)方法是基于肉類蛋白或多肽而進行的特異性檢測，相較于DNA，肉制品蛋白質(zhì)的氨基酸序列在加工過程中更穩(wěn)定[28]。早期基于質(zhì)譜的肉類摻假鑒別主要采用凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行蛋白質(zhì)鑒定，隨著靶向蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，基于串聯(lián)質(zhì)譜的特異肽段檢測已成為質(zhì)譜技術(shù)鑒別肉類摻假的主要方法。根據(jù)不同來源的肉類產(chǎn)品中特異性蛋白質(zhì)的差別，在串聯(lián)質(zhì)譜平臺建立多反應監(jiān)測(MRM)方法，一次性同時檢測多個特征肽，從而識別多個物種。利用MRM觸發(fā)的增強離子掃描方式可以進一步確認目標蛋白質(zhì)/肽序列，從而有效地去除假陽性，增強檢測結(jié)果的可靠性[29，30]。

Sarah[31](2016)等利用LC-QTOF-MS技術(shù)對冷凍和煮熟豬肉中的特異性肽進行鑒別，建立了多反應監(jiān)測方法，發(fā)現(xiàn)7種豬肉樣品中均檢測出同種特異性肽，為豬源性成分檢測提供了數(shù)據(jù)支持。李瑩瑩[32](2016)等研究了5種常見肉中種屬特征性肽，基于識別出的特征性肽段，利用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對羊肉和鴨肉混合樣品特征性多肽進行定性和定量分析，構(gòu)建的定量離子對線性關系良好，檢出限為0.5%。古淑青[33](2018)等采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜對羊肉、鴨肉、雞肉、豬肉的特征性肽段進行了定性和MRM定量分析，該方法對摻假鴨肉最低檢出限為0.25%、摻入豬肉檢出限為0.17%、雞肉為0.10%。

質(zhì)譜技術(shù)進行肉類摻假檢測，結(jié)果不易受外界干擾，更準確、可靠性強。但該方法前處理過程繁瑣、儀器成本較高，無法滿足快速檢測的需求，限制了其推廣應用。

5 近紅外光譜技術(shù)

隨著化學計量學的發(fā)展，近紅外光譜技術(shù)(NIR)近年來快速發(fā)展起來。采用該技術(shù)無需對樣品進行前處理，根據(jù)不同化合物在特定紅外波長(780～2 526nm)的吸收情況，直接上樣便可進行定性分析，速度快、效率高、成本低、測試重現(xiàn)性好、測量方便，成為食品分析領域的一種新選擇[34]。不同種類肉制品在近紅外波段的吸收響應情況不同，將大量采集的NIR數(shù)據(jù)與多種數(shù)學模型結(jié)合處理，可成功用于肉及肉制品的摻假鑒別。

白京[35](2019)等利用近紅外光譜技術(shù)對解凍牛肉漢堡餅中的豬肉摻假進行判別分析，并應用偏最小二乘法定量了肥瘦不同的解凍牛肉漢堡餅中的摻假豬肉比例，所建立的判別模型準確性高。孫乃旭[36](2020)將計算機圖像處理技術(shù)與NIR結(jié)合檢測熟兔肉中豬肉的摻假比例，結(jié)果表明偏最小二乘判別分析和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡2種判別模型準確度均很高，證明該方法可有效區(qū)分兔肉和豬肉。張玉華[37](2015)等采用近紅外光譜結(jié)合多種數(shù)學處理方法，建立了牛肉和羊肉中摻雜其它種類肉的鑒別模型，建立的各種模型的準確度均達到90%以上，可有效鑒別牛肉、羊肉中的常見摻假肉。

近紅外光譜技術(shù)進行肉類摻假鑒別，其建模過程需要大量的數(shù)據(jù)積累，化學計量學也對使用者有一定的理論水平要求。但該技術(shù)可以實現(xiàn)肉類摻假鑒別的無損檢測，檢測速度快，將成為以后研究和應用的重點。

6 電子鼻技術(shù)

電子鼻是一種智能仿生設備，是基于目標物的揮發(fā)性成分，采用氣體傳感器建立響應曲線快速識別氣味組成的電子系統(tǒng)。與普通的化學儀器如色譜儀、光譜儀等不同，電子鼻無需對檢測對象進行預處理，即可得到樣品中揮發(fā)成分的整體信息，即“指紋數(shù)據(jù)”，而非被測樣品各種成分的定性和定量結(jié)果。電子鼻不但能對不同樣品的氣味信息進行對比分析，還可通過采集標準樣品的指紋圖譜建立數(shù)據(jù)庫，繼而利用統(tǒng)計分析方法對樣品未知成分進行定性和定量分析[38,39]。

不同肉類揮發(fā)性成分組成有所不同，不同時期、含有不同有害成分的肉類，在特定條件下?lián)]發(fā)出的氣體組成也不同。基于此，用電子鼻系統(tǒng)進行肉類的新鮮度、有害物質(zhì)及摻假檢測，是完全可行的。Tian[40](2013)等在碎羊肉樣品中分別摻入0%、20%、40%、60%、80%和100%豬肉，采用10種不同的MOS傳感器組成的德國Airsense公司的PEN2型電子鼻對其進行了鑒別，識別模型準確率為97%，此研究對監(jiān)管食品欺詐具有重要意義。賈洪鋒[41](2011)等研究了電子鼻對牦牛肉、牛肉中豬肉摻假識別的可行性，結(jié)果表明不同種類的肉在電子鼻儀器上有不同的特征響應圖譜，電子鼻響應信號和豬肉摻假比例的相關性達0.976。國外研究者[42](2011)采用電子鼻檢測了清真香腸中是否摻入豬肉，從以牛肉、羊肉、雞肉為原料的香腸中挑出摻有豬肉的香腸，并將檢測結(jié)果與頂空氣相色譜結(jié)果對比，表明采用電子鼻可以有效識別出非清真的香腸。田曉靜[43](2013)等采用電子鼻分析摻入雞肉的羊肉糜，結(jié)果基于主成分分析和偏最小二乘回歸建立的數(shù)學模型，可以有效預測混入羊肉中的雞肉糜比例，證明電子鼻在羊肉摻假鑒別中的可行性。

電子鼻技術(shù)用于肉類摻假鑒別具有快速、無損的顯著優(yōu)勢，不斷完善的傳感器技術(shù)及化學計量學方法使得該技術(shù)準確性和穩(wěn)定性日趨成熟，且該儀器易于便攜化，將更好的適用于現(xiàn)場檢測。

7 展望

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們對食品質(zhì)量的要求越來越高。肉及肉制品是人類的重要食物來源，經(jīng)濟價值相對較高，因此摻假現(xiàn)象屢禁不止。研究準確、可靠、快速的肉類真假鑒別方法，對于食品安全、經(jīng)濟貿(mào)易發(fā)展、社會穩(wěn)定都具有重要意義。

目前，用于肉類摻假鑒別的技術(shù)有十幾種，不同技術(shù)原理不同，特點各異，使用者可根據(jù)實際需求選擇合適的方法?；诘鞍椎臋z測方法，由于蛋白遇高溫會變性，影響特異性蛋白的識別，因此不適合深加工肉制品的鑒別，限制了其使用范圍。基于核酸的檢測技術(shù)，DNA不易受外界因素影響，穩(wěn)定性較高，但試劑盒成本高，且操作復雜。近紅外光譜、電子鼻技術(shù)都是代表性的基于物種特定指紋信息的快速鑒別技術(shù)，具有無損、快速的優(yōu)點，能滿足肉類安全檢測的新要求。但這些技術(shù)模型建立的過程需要大量數(shù)據(jù)，基礎工作量大，對化學計量學的要求高。

未來，對于食品安全檢測領域，在準確可靠的前提下，快速、無損、低成本的現(xiàn)場鑒別技術(shù)，將是各行業(yè)的共同需求。肉類鑒別方面，在現(xiàn)有的研究基礎上，降低試劑盒成本、建立不同種類肉的特異性蛋白數(shù)據(jù)庫、全球范圍內(nèi)采集足夠多的肉類光譜和電子鼻等指紋信息、找到更優(yōu)化的統(tǒng)計學方法，建立靠譜的數(shù)學模型，將是研究者繼續(xù)努力的方向。另外，隨著科技水平的發(fā)展，會有更多的新型技術(shù)用于肉類食品的成分鑒別[44,45]。