電針干預(yù)對早期MCAO大鼠步態(tài)的影響

李明哲,須燕玲,張英杰,鄭飛 ,汪文靜,徐鳴曙,單春雷

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;3.上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院,上海200431)

缺血性卒中,中醫(yī)學(xué)稱之為卒中,系由各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死,進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對應(yīng)的神經(jīng)功能缺失。在中國,卒中已超過惡性腫瘤居致死病因首位[1],卒中疾病負(fù)擔(dān)比過去30年增加,負(fù)擔(dān)最大的地區(qū)是在北部和中部地區(qū)[2]。缺血性卒中可引發(fā)多種復(fù)雜的病理變化,其治療一是抵抗腦細(xì)胞缺血損傷;二是保護(hù)腦細(xì)胞,促進(jìn)修復(fù)再生,如促進(jìn)神經(jīng)、血管的保護(hù)與再生[3]。隨著醫(yī)療的進(jìn)步、治療水平的提高,卒中的致死率降低,但其后遺癥的患者群體顯著增長,急需尋求簡、便、廉、效的治療手段。

目前,電針無法廣泛應(yīng)用于卒中患者的早期康復(fù)中,本課題組多年來一直關(guān)注卒中康復(fù),采用動物實(shí)驗(yàn)研究針刺中晚期干預(yù)MCAO大鼠,有一定的療效[4-5]。故本文用電針干預(yù)早期MCAO大鼠,以觀測其步態(tài)行為的變化,以期為今后的臨床研究提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

8周齡健康清潔級 SD大鼠 24只,雄性,體質(zhì)量180～220 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物房,許可證號為SYXK(滬)2013-0109。飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替,室內(nèi)溫度25℃,濕度50%～60%,自由攝取食物和水。實(shí)驗(yàn)過程對大鼠的各種干預(yù)手段均按照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。適應(yīng)性飼養(yǎng) 3 d后,將大鼠按體質(zhì)量采用SPSS24.0的隨機(jī)法進(jìn)行隨機(jī)分組,分為假手術(shù)組、模型組和電針組,每組 8只。同時將大鼠進(jìn)食量控制為80%,并開始大鼠步態(tài)訓(xùn)練。

1.2 模型制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[6]制備 MCAO模型大鼠。采用 R540增強(qiáng)型小動物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)在氣麻下采用頸內(nèi)動脈線栓法制備大鼠右側(cè)局灶性腦缺血模型,將大鼠取仰臥位固定于手術(shù)臺上,充分暴露右側(cè)頸區(qū),在右側(cè)CCA活結(jié)與死結(jié)之間(“Y”形交叉處下約3 mm處)作切口;將前端浸蠟的栓線(北京西儂科技有限公司,型號為 2636-A4)插入此切口,將線栓插至大腦前動脈近段,堵塞大腦中動脈起始端口。2 h后緩慢回抽魚線,剪去多余栓線,逐層縫合皮膚。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 假手術(shù)組(S)和模型組(M)

采用4%異氟烷、氧氣4 L/min誘導(dǎo)下麻醉1 min,并在2.5%異氟烷、氧氣0.5 L/min維持氣麻20 min,每次氣麻20 min,連續(xù)干預(yù)5 d。

1.3.2 電針組(EA)

造模后 1 d,采用氣麻下電針干預(yù),根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]取足三里(雙側(cè))、曲池(雙側(cè)),采用0.30 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB2024-94針灸針)進(jìn)行針刺。接通 G6805-Ⅱ低頻電子脈沖治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn)),連續(xù)脈沖波,刺激頻率 2 Hz,電流范圍為1.5～2 mA,每次干預(yù)20 min,連續(xù)干預(yù)5 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 大鼠體質(zhì)量

分別在大鼠步態(tài)訓(xùn)練造模前(B)、造模后1 d(D1)、造模后5 d(D5)、造模后7 d(D7)記錄各組大鼠體質(zhì)量變化。

1.4.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評分(Neurological Deficit Scores, NDS)

造模完成后2 h,待大鼠清醒后采用Bederson評分進(jìn)行NDS,0分為未見行為缺陷;1分為肢屈曲,即提尾懸空試驗(yàn)陽性;2分為側(cè)推抵抗力下降,即側(cè)向推力試驗(yàn)陽性,伴前肢屈曲,無轉(zhuǎn)圈行為;3分同2級行為,伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。評分為2分及以上表明模型大鼠大腦中動脈阻塞成功,即清醒后出現(xiàn)左前肢屈曲,站立不穩(wěn),前進(jìn)時向左側(cè)傾斜。記錄B、造模后2 h(2 h)、D1、D5、D7的NDS。

1.4.3 腦血流

測定右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)域血流值,當(dāng)所示數(shù)值平穩(wěn)時開始記錄,每次記錄時間＞3 min,并記錄B、2 h、D1、D5、D7時的血流變化值及平均血流速度,血流灌注單位為PU。

1.4.4 步態(tài)分析

采用荷蘭Noldus公司Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行大鼠步態(tài)訓(xùn)練。將大鼠飼養(yǎng)在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性生活3 d,然后每日16:00—20:00對大鼠進(jìn)行步態(tài)訓(xùn)練,以大鼠順利通過整個玻璃板為1次,每日訓(xùn)練5次,每次不少于10步,共連續(xù)訓(xùn)練10 d。分別記錄B、D1、D5、D7時大鼠的四足步態(tài)數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用重復(fù)測量方差分析,LSD檢驗(yàn)比較組間差異,對學(xué)生化殘差的分析,以 Mauchly’s檢驗(yàn)是否滿足球形假設(shè),有交互作用,分析各因素的單獨(dú)效應(yīng);無交互作用時,分析各因素的主效應(yīng),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組不同時間體質(zhì)量比較

體質(zhì)量組別和時間無交互作用(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);M組、EA組D1時體質(zhì)量較B顯著下降(P＜0.05);S組、EA組的體質(zhì)量D5、D7與B及D1比較顯著上升(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與S組比較,M組在D1、D5、D7時體質(zhì)量顯著下降(P＜0.05);與M組比較,EA組D5、D7體質(zhì)量顯著上升(P＜0.05)。詳見圖1。

圖1 3組不同時間體質(zhì)量比較(±s,g)

2.2 3組不同時間NDS比較

NDS組別和時間無交互作用(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);M組2 h、D1、D5的NDS較B顯著上升(P＜0.05);EA組各時間點(diǎn)NDS比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),EA組D5、D7較2 h顯著下降(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與S組比較,M組各時間點(diǎn)NDS顯著增加(P＜0.05);與 M組比較,EA組 NDS在 D5時顯著減少(P＜0.05)。詳見圖2。

圖2 3組不同時間NDS比較( ±s,分)

2.3 3組不同時間腦血流量比較

腦血流量組別和時間無交互作用(P＞0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與S組比較,M組腦血流量在 D1、D5、D7時顯著下降(P＜0.05);與 M組比較,EA組腦血流量在D1和D5時上升(P＜0.05)。不同時間腦血流量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與 B時比較,各組其他時間點(diǎn)腦血流量顯著下降(P＜0.05);與2 h和D1時比較,各組D5和D7時間點(diǎn)腦血流量顯著下降(P＜0.05)。詳見圖3。

圖3 3組不同時間腦血流量比較( ±s,PU)

2.4 3組平均血流速度比較

平均血流速度組別與時間有交互作用(P＜0.05)。組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與S組比較,M組D1和D5時平均血流速度顯著下降(P＜0.05);與M組比較,EA組與 D5時平均血流速度顯著上升(P＜0.05)。不同時間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與B時比較,S組D5、D7時平均血流速度顯著下降(P＜0.05),M組其他時間點(diǎn)顯著下降(P＜0.05),EA組D1、D7顯著下降(P＜0.05);與D1時比較,S組D5、D7平均血流速度顯著下降(P＜0.05),EA組D5顯著上升(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3組平均血流速度比較 (±s,PU)

表1 3組平均血流速度比較 (±s,PU)

注:與同組B比較1)P＜0.05;與同組D1比較2)P＜0.05;與S組比較3)P＜0.05;與M組比較4)P＜0.05

組別 n B 2 h D1 D5 D7 S 組 8 102.80±41.98 99.75±59.76 89.42±16.95 55.08±12.941)2) 48.73±24.021)2)M 組 8 129.28±45.93 65.55±37.441) 29.68±20.201)3) 43.47±6.561)3) 34.67±14.261)EA 組 8 100.82±32.51 64.35±28.32 30.07±18.741)3) 67.32±25.502)4) 60.12±29.351)

2.5 3組干預(yù)前后步態(tài)分析結(jié)果比較

時間參數(shù)(平均速度)、空間參數(shù)(最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度、支撐相、步長)組別和時間有交互作用(P＜0.05),組別和不同時間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與S組比較,M組在D1時右前最大接觸面積、壓印面積均值、壓印寬度均值、支撐相均值顯著增加(P＜0.05),平均速度、右前步長均值顯著降低(P＜0.05);與M組比較,EA組在D5、D7時右前最大接觸面積、壓印面積均值、壓印寬度均值、支撐相均值顯著降低(P＜0.05),平均速度、右前步長均值顯著增加(P＜0.05)。詳見圖4。

圖4 步態(tài)分析結(jié)果

3 討論

近年來,卒中的康復(fù)干預(yù)主要集中在慢性康復(fù)期,研究顯示,DAPT能夠促進(jìn)移植的NSCs向神經(jīng)元分化,對腦缺血大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后有神經(jīng)保護(hù)作用[8],血府逐瘀丸對慢性腦缺血大鼠腦部NOX表達(dá)起保護(hù)腦缺血的作用[9],梔子苷可以透過血腦屏障,推測黃芩苷、梔子苷(7:3)配伍可能通過抑制興奮性氨基酸的釋放而發(fā)揮腦保護(hù)作用[10]。事實(shí)上康復(fù)的早期介入尤為重要,已有研究顯示早期的主動性的康復(fù)治療方式能使卒中患者的運(yùn)動功能得到改善[11-13]。

以往研究中,多采用激光多普勒血流儀(laser doppler flowmetery, LDF)測定缺血再灌注大鼠局部腦血流量以判斷MCAO模型大鼠是否制作成功,而連續(xù)的血流監(jiān)測也開始用于MCAO模型大鼠的研究中,如丹燈通腦膠囊、眼針、EA均可提高缺血早期梗死側(cè)局部腦血流量或腦血流速度、增加健側(cè)對梗死側(cè)的血流代償[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)M組的血流量在D1、D5、D7時顯著下降(P＜0.05);說明腦缺血后會造成腦血流量減少,而與M組比較,EA組腦血流量在D1和D5時上升(P＜0.05),說明早期的電針干預(yù)可以增加腦部的血流量,改善腦部因缺血缺氧造成的損傷。平均血流速度中,S組D5、D7時較B及D1時顯著下降(P＜0.05),說明連續(xù)的氣麻下監(jiān)測對正常大鼠的腦血流也會產(chǎn)生一定的影響;與S組比較,M組D1和D5時平均血流速度顯著下降(P＜0.05),說明模型組的血流速度是持續(xù)下降的,腦損傷不可逆,而因?yàn)樵缙诘碾娽樃深A(yù),EA組的平均血流速度上升,腦損傷可能得到了一定程度的修復(fù),說明干預(yù)電針起到腦保護(hù)作用,從而可能減少運(yùn)動功能損傷。

行為學(xué)變化是神經(jīng)功能的直觀體現(xiàn),步態(tài)是構(gòu)成大鼠行進(jìn)行為的基本要素,步態(tài)指標(biāo)多種多樣,主要分為時間特征參數(shù)、空間特征參數(shù)以及時空特征參數(shù),其中時間特征指標(biāo)包括步態(tài)周期、支撐相、擺動相以及支撐系數(shù)等[17]。運(yùn)動學(xué)測量的本質(zhì)是對動物行進(jìn)行為的定量和詳細(xì)描述,CatWalk是一種評估運(yùn)動行為的方法,較其他行為學(xué)檢測手段而言具有明顯的優(yōu)勢,它可實(shí)時捕捉及自動化分析大鼠的日常動作,經(jīng)過步態(tài)訓(xùn)練,形成步態(tài)模式,避免了人為觀察導(dǎo)致的干擾因素,更為客觀評價(jià)大鼠的行為學(xué)變化,如評估切口痛模型早期機(jī)械性痛覺超敏[18],且運(yùn)動訓(xùn)練本身對運(yùn)動功能康復(fù)也是有作用的[19],這樣的動物行為學(xué)研究和臨床研究也更切合。

大鼠的步態(tài)行為是各個肢體共同協(xié)調(diào)運(yùn)動行為的結(jié)果,不同的動物模型,步態(tài)行為異常表現(xiàn)往往不一樣,但主要關(guān)注各足的步寬、步行周期、支撐時長、擺動時長、足跡平均面積、平均強(qiáng)度等[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),M組大鼠D1時右前最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度增加,EA組明顯下降,這3個參數(shù)有可能作為評價(jià)EA或其他干預(yù)手段是否起效的指標(biāo),表明了存在步態(tài)代償?shù)那闆r,即兩側(cè)肢體的支撐系數(shù)均增大(如拖行步態(tài)),以減小患肢承受的壓力。步速是步態(tài)時空特征指標(biāo),它影響著步態(tài)周期,是步態(tài)分析中的時間參數(shù),本研究發(fā)現(xiàn),M組大鼠D1、D5和D7時平均速度均值降低,EA組D5、D7時升高。M組大鼠D1、D5和D7時步長均值降低,EA組D5、D7時升高。M組大鼠支撐相D1、D5和D7升高,EA組D5、D7時下降。

針刺治療卒中后運(yùn)動功能障礙歷史悠久,電針能夠改善局灶性腦缺血后大腦神經(jīng)元的損傷,對神經(jīng)功能的恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用[21];促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù),可能與血管新生抑制因子 ES、TSP-1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)[22]。本研究選擇雙側(cè)曲池、足三里1.5～2 mA的刺激強(qiáng)度、進(jìn)行電針干預(yù),以起到自下而上的腦功能調(diào)節(jié)作用。研究顯示電針曲池、足三里可促進(jìn)腦缺血大鼠皮質(zhì) BDNF的合成和分泌,上調(diào)SYN的表達(dá),可能在調(diào)控腦可塑性方面發(fā)揮重要作用[23];可改善腦缺血大鼠的神經(jīng)缺損癥狀,作用機(jī)制可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)[24]。足三里穴屬于足陽明經(jīng),曲池穴屬于手陽明大腸經(jīng),兩穴均是本經(jīng)的“合穴”,經(jīng)氣由此匯聚,陽明經(jīng)多氣多血,對卒中后肢體活動不利尤為適宜,兩穴合用具有調(diào)和陰陽、益氣養(yǎng)血之效。

本研究的創(chuàng)新之處在于對步態(tài)行為的無干擾的標(biāo)準(zhǔn)化步態(tài)訓(xùn)練方式,使其形成一種行為模式,故在MCAO模型的早期-D1就可進(jìn)行步態(tài)測試,得到最真實(shí)有效數(shù)據(jù),而這在臨床中是很難實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)了在步態(tài)功能檢測中有意義的參數(shù),從而可以更好地了解腦神經(jīng)功能,將腦神經(jīng)功能劃分得更細(xì)微,為臨床提供更好的向?qū)А?/p>

綜上所述,大鼠腦缺血發(fā)生后步態(tài)行為中最大接觸面積、壓印面積、壓印寬度、壓印長度等參數(shù)持續(xù)上升,可能與腦缺血后運(yùn)動功能障礙有直接關(guān)系,腦缺血不僅損傷動物的運(yùn)動功能,而且會造成認(rèn)知障礙,電針干預(yù)不僅對運(yùn)動功能有促進(jìn)作用,對認(rèn)知功能也有作用,但本研究沒有涉及,所以在今后的研究中都應(yīng)該繼續(xù)深入研究,以進(jìn)一步闡明其意義,為臨床研究提供更多的依據(jù)。