miR-132在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究

楊波，李勝澤，郭蘇陽，馬珊珊，張慶松，李玉芝

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性癌癥中最常見的一種，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第五大常見原因[1]。全世界每年有約23萬名婦女被確診，其中15萬人最終病死，診斷5年后存活率約46%[2]，嚴(yán)重威脅女性生命安全。篩查和診斷困難、化療耐藥性及較高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性是EOC高病死率的主要因素[3]。因此，尋找卵巢癌新型治療手段或治療靶標(biāo)，降低患者病死率成為目前研究的熱點(diǎn)。沙敏等[4]研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-132(miR-132)可靶向調(diào)節(jié)高爾基體糖蛋白73抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。miR-132可靶向性別決定區(qū)Y-box 4 蛋白抑制肺癌細(xì)胞在體外的遷移和侵襲[5]。推測miR-132可能與腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲過程有關(guān)[6]。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-132在卵巢癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且過表達(dá)miR-132可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[7]，但其與卵巢癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不清楚。因此本研究通過檢測miR-132在人卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平，并以miR-132相對表達(dá)水平較低的卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，觀察過表達(dá)miR-132對卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移的影響，并進(jìn)一步探討可能的作用機(jī)制，以期為尋找有效生物靶標(biāo)治療卵巢癌提供一定理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)組織標(biāo)本和細(xì)胞系: 收集2018年10月—2020年2月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦瘤科手術(shù)切除的卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標(biāo)本36份，均經(jīng)病理診斷確診，置于-80℃保存。術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療。人正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司)、卵巢癌SKOV3細(xì)胞(購自上海瑞鹿生物技術(shù)有限公司)。(2)試藥及試劑：實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物及miR-132慢病毒構(gòu)建及包裝均由上海吉瑪生物公司設(shè)計(jì)合成；qRT-PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；Trizol試劑購自美國Sigma公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；熒光素酶報(bào)告載體由上漢恒生物公司提供；小鼠抗人單克隆絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體均購自美國abcam公司；辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司。(3)儀器設(shè)備：電泳儀購自美國Bio-Rad公司，qRT-PCR儀購自美國ABI公司，酶標(biāo)儀購自奧地利CliniBio公司，凝膠成像儀購自南京創(chuàng)睿儀器儀表有限公司。

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測卵巢癌組織中miR-132相對表達(dá)水平：從卵巢癌病理組織切下約100 mg置于研缽中加入液氮研磨至細(xì)粉，移至裝有1 ml的Trizol離心管中，提取總RNA，根據(jù)引物合成軟件Premier 6.0設(shè)計(jì)引物序列，見表1，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA合成cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書配20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min、95℃變性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)，以U6為對照，采用2-△△Ct法分析miR-132相對表達(dá)水平。

表1 miR-132、U6的qRT-PCR引物序列

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組：選取miR-132相對表達(dá)水平最低的卵巢癌SKOV3細(xì)胞和正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞密度為1×106/ml，每孔200 μl接種于24孔板，正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)為正常對照組，卵巢癌SKOV3細(xì)胞分為空白對照組、LV-NC(陰性對照)組和LV-miR-132 mimic(模擬物)組，每組8個(gè)復(fù)孔，取2支EP管分別加入200 μl完全培養(yǎng)基備用，管中分別加入24 μl濃度為1×108TU/ml慢病毒和慢病毒空載體(轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI值為60)，均勻混合后各加入4 μl濃度為6 μg/ml 聚凝胺備用；將EP管中的慢病毒空載體和慢病毒液加入LV-NC組和LV-miR-132 mimic，空白對照組加入PBS 28 μl，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-132、MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平：應(yīng)用Trizol從上述各組細(xì)胞中提取總RNA，以qRT-PCR方法檢測各組細(xì)胞中miR-132、MAPK1相對表達(dá)水平，MAPK1以GAPDH為對照，其中MAPK1和GAPDH引物序列見表2。

表2 MAPK1、GAPDH的qRT-PCR引物序列

1.2.4 Transwell法檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲率：上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，常規(guī)消化離心，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/ml，取200 μl加入Transwell小室的上室中，24孔板下室加入完全培養(yǎng)基 500 μl，培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，擦拭Matrigel和上室殘留細(xì)胞，置于新的24孔板中，4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄固定液，0.2%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗，風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并記錄穿膜細(xì)胞數(shù)(著色為紫色)。侵襲率=實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞平均數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞平均數(shù)×100%。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞的遷移率：上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，行各組細(xì)胞消化、離心后調(diào)整密度為2.5×105個(gè)/ml，每孔2 ml接種于六孔板中，第2天用無菌500 μl槍頭垂直孔板背后的橫線，制造細(xì)胞劃痕，確保每個(gè)孔內(nèi)劃痕寬度一致，PBS清洗3次，洗去劃下的細(xì)胞，12、24、48 h取樣拍照，對各組細(xì)胞分析，細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕區(qū)域?qū)挾?拍照時(shí)間劃痕區(qū)域?qū)挾?/0 h劃痕區(qū)域?qū)挾取?00%。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞與MAPK1的靶向關(guān)系：分別構(gòu)建含有MAPK1的野生型和突變型3′-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(MAPK1-Wt和MAPK1-Mut)。收集卵巢癌SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/孔，接種于24孔板中，miR-132 mimic或NC分別與MAPK1-Wt質(zhì)粒和MAPK1-Mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞，每組8個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明對熒光素酶活性進(jìn)行測定。

1.2.7 Western-blot檢測卵巢癌SKOV3細(xì)胞中MAPK1、遷移與侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)： 上述細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h，分別收集各組細(xì)胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中處理，提取蛋白，BCA法測定各組蛋白的濃度，加入蛋白上樣緩沖液(體積為蛋白樣品液的4倍)，沸水浴加熱3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝膠配方表制備10%分離膠和5%濃縮膠，以每泳道30 μg蛋白上樣，蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白marker切膠，轉(zhuǎn)膜，對抗體MAPK1、MMP-9、MMP-2、GAPDH均按照1∶500的比例稀釋后4℃孵育過夜，放搖床1.5 h，TBST清洗，加入辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育并放搖床2 h，TBST清洗后，參考ECL發(fā)光液說明書對條帶孵育、曝光、顯影。Image J對條帶灰度值分析。

ATB混合料碾壓應(yīng)遵循“緊跟慢壓、高頻低幅”原則，壓路機(jī)應(yīng)緊跟攤鋪機(jī)后進(jìn)行碾壓，避免混合料熱量散失過多，初壓使用13T雙鋼輪振動(dòng)壓路機(jī)靜壓2遍；復(fù)壓采用13T振動(dòng)壓路機(jī)振動(dòng)碾壓3～4遍，碾壓溫度控制為100～110℃；終壓使用11T鋼輪壓路機(jī)靜壓2～3遍以消除輪印，碾壓溫度不低于80℃。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組織與癌旁組織中miR-132相對表達(dá)水平比較 癌旁組織miR-132相對表達(dá)水平為(1.02±0.12)，高于卵巢癌組織的(0.50±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/P=19.166/0.000)。

2.2 各組細(xì)胞miR-132、MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，空白對照組miR-132相對表達(dá)水平顯著降低，MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組miR-132相對表達(dá)水平顯著升高，MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而空白對照組與LV-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組細(xì)胞中miR-132、MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.3 各組SKOV3細(xì)胞侵襲能力比較 與空白對照組細(xì)胞侵襲率(81.00±8.20)%、LV-NC組(73.56±7.77)%比較，LV-miR-132 mimic組(38.86±6.86)%顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F/P=19.166/0.000)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 各組SKOV3細(xì)胞侵襲能力比較 (結(jié)晶紫染色，×200)

2.4 各組SKOV3細(xì)胞遷移能力比較 與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細(xì)胞遷移率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、表4。

圖2 各組卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移率比較

表4 各組卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移率比較

2.5 各組SKOV3細(xì)胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較 與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細(xì)胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而空白對照組、LV-NC組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、表5。

圖3 各組細(xì)胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白免疫印跡圖

表5 各組細(xì)胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)比較

2.6 miR-132與MAPK1的靶向關(guān)系 應(yīng)用microrna.org數(shù)據(jù)庫預(yù)測MAPK1 3′-UTR與miR-132存在結(jié)合位點(diǎn)。而與miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組比較，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組熒光素酶相對活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-132 NC+MAPK1-Mut 3′-UTR組、miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR組熒光素酶相對活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組比較，miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR組熒光素酶相對活性顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-132與MAPK1靶向關(guān)系

3 討 論

卵巢癌是女性中僅次于乳腺癌、腸癌、肺癌和子宮內(nèi)膜癌的第五大常見癌癥，是婦科惡性腫瘤死亡的主要原因之一[8]。卵巢惡性腫瘤中上皮性卵巢癌約占85%。由于其表現(xiàn)隱蔽，往往直到晚期才被診斷，導(dǎo)致高病死率。在過去20年中，發(fā)病率和病死率一直相當(dāng)穩(wěn)定，盡管近年在外科手術(shù)治療方面已取得較大進(jìn)展，但由于多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至晚期，導(dǎo)致較高的病死率[9]。因此尋找預(yù)測卵巢癌分子標(biāo)志物并對其生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究，將有助于提高卵巢癌診斷和治療水平，具有重要的臨床意義。

微小RNAs(microRNA，miRNAs)是一種小的非編碼RNA分子[10]，它可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，目前，已知的人類miRNAs有1 000多個(gè)，控制著50%以上哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)編碼基因，miRNAs表達(dá)異常與不同疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，已成為近年研究熱點(diǎn)。miRNAs可通過靶向關(guān)鍵蛋白編碼基因，參與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，如miR-628-5p可通過靶向下調(diào)成纖維細(xì)胞生長因子受體2的表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，顯著抑制腫瘤生長并降低其致瘤性[11]；miR-338-3p通過靶向Runx2顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。miR-132存在于人類染色體17p13，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、炎性反應(yīng)、和血管生長密切相關(guān)[13]，但其對上皮性卵巢癌的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響目前還未有明確闡述。本研究結(jié)果顯示，卵巢癌組織中miR-132相對表達(dá)水平較癌旁組織顯著降低，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-132相對表達(dá)水平較正常卵巢上皮細(xì)胞(IOSE80)顯著降低，表明miR-132在卵巢癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與以往研究一致[7]，表明其在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的調(diào)控作用。本研究進(jìn)一步采用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-132過表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示，與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細(xì)胞中miR-132相對表達(dá)水平顯著升高，提示miR-132過表達(dá)SKOV3細(xì)胞系建立成功。

由于卵巢癌細(xì)胞的侵襲性生長特征，使得腫瘤完全切除存在較大困難，腫瘤易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者病死率較高[14-15]，因而抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是卵巢癌的重要治療方向。本研究通過Transwell法及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測miR-132對卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果顯示，SKOV3細(xì)胞經(jīng)LV-miR-132 mimic慢病毒轉(zhuǎn)染后，其侵襲率、遷移率均顯著降低，表明miR-132可調(diào)控卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲和遷移過程，上調(diào)其表達(dá)可顯著抑制卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤細(xì)胞在侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，可離開原發(fā)灶，透過基底膜進(jìn)入血管，繼而移出血管或淋巴管形成微小轉(zhuǎn)移灶，再進(jìn)一步增殖進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移腫瘤。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的第一道屏障，腫瘤細(xì)胞可通過產(chǎn)生蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，其中MMP-2、MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)，并分解Ⅳ型膠原蛋白，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和黏附能力，在腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移過程中具有重要作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組、LV-NC組比較，LV-miR-132 mimic組細(xì)胞MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低，表明miR-132過表達(dá)可下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲和遷移。

MAPK1屬于MAPK激酶家族，可通過激活MAPK信號通路，促進(jìn)MMP-13、含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-4(ADAMTS-4)等細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝因子表達(dá)，抑制Ⅱ型膠原等合成代謝蛋白表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)受損，與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)[17-19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1在不同類型的癌癥中表達(dá)異常，F(xiàn)lum等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-217-5p可靶向MAPK1抑制大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明miR-508通過靶向MAPK1抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[21]。Li[22]等研究發(fā)現(xiàn)，miR-329-3p過表達(dá)可靶向抑制MAPK1從而抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，He等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-132-3P靶向抑制MAPK1抑制大腸癌發(fā)生發(fā)展。另有研究表明，miR-132過表達(dá)可調(diào)控ERK1/2對NP細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中MAPK1 mRNA相對表達(dá)水平較正常卵巢上皮細(xì)胞顯著升高，以LV-miR-132 mimic慢病毒轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后，其細(xì)胞中MAPK1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均降低，表明MAPK1在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-132可下調(diào)MAPK1表達(dá)，推測miR-132可能通過靶向下調(diào)MAPK1表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲。本研究基于TargetScan、microRNA.org、miRbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-132與MAPK1存在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR組的熒光素酶相對活性低于miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組，而將MAPK1 3′突變后，其熒光素酶相對活性與miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR組相比無明顯變化，表明miR-132能夠直接靶向下調(diào)MAPK1的表達(dá)，進(jìn)而影響MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，降低卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲能力。

綜上所述，上調(diào)miR-132可能通過靶向MAPK1抑制卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲，為闡述卵巢癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、識別和鑒定腫瘤標(biāo)志物、開展腫瘤靶向治療提供了新理論依據(jù)。本研究的不足之處在于沒有敲除或沉默miR-132以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-132在卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲中的作用，將在以后的研究進(jìn)一步完善驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

楊波：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；李勝澤：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；郭蘇陽、馬珊珊：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；張慶松：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；李玉芝：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫