馬鈴薯晉薯16 號(hào)愈傷組織再生體系的建立

牛瑜琦 孫 蕾 梅 超 王慧杰 宋倩娜 馮瑞云

（1 山西大學(xué)生物工程學(xué)院，太原 030006；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太原 030031）

山西是我國(guó)馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一，種植區(qū)域主要分布在山西北部、西北部的丘陵和山地，商品薯產(chǎn)量高，品質(zhì)優(yōu)良。由于種植地區(qū)多為貧困地區(qū)，在精準(zhǔn)扶貧力度持續(xù)增加的背景下，貧困適種地區(qū)的馬鈴薯種植面積呈增加態(tài)勢(shì)，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)已逐步成為當(dāng)?shù)丶t色支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。近年來(lái)，隨著人民生活水平提高，對(duì)馬鈴薯品質(zhì)的要求也相應(yīng)提高，科技人員在馬鈴薯的品質(zhì)、產(chǎn)量、抗病性及分子育種方面均取得較大進(jìn)展[3]。

晉薯16 號(hào)是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所在2006 年審定的馬鈴薯品種，產(chǎn)量高達(dá)2088kg/667m2，抗病性強(qiáng)，在山西北部、內(nèi)蒙古烏蒙、河北張家口地區(qū)推廣種植，2009-2011 年累計(jì)種植4 萬(wàn)hm2，推廣前景良好[4-6]。在推廣過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)晉薯16 號(hào)中抗PVX 和PVY，重感B5-1 晚疫病生理小種，為避免產(chǎn)量降低、抗性退化等問(wèn)題產(chǎn)生，需對(duì)品種進(jìn)一步改良，篩選并導(dǎo)入具有相關(guān)抗性如抗PVX、PVY 病毒基因、抗晚疫病基因等優(yōu)良基因，打破種間隔離的限制，提高品種抗生物與非生物脅迫的能力，改良品種農(nóng)藝性狀[7-8]。朱英等[9]研究表明，高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是轉(zhuǎn)基因馬鈴薯育種獲得突變植株的前提。雖然針對(duì)馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較早，但由于不同品種基因型的差異[10-11]，遺傳轉(zhuǎn)化體系也不盡相同，因此需要建立適合晉薯16 號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化愈傷組織再生體系。

本研究通過(guò)對(duì)馬鈴薯外植體選擇、外植體表面消毒試劑濃度選擇、根的誘導(dǎo)條件、最佳愈傷組織誘導(dǎo)和分化的植物激素組合及濃度進(jìn)行研究，初步建立了馬鈴薯晉薯16 號(hào)再生體系，以期為馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化、品種優(yōu)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料本研究試驗(yàn)材料為馬鈴薯晉薯16 號(hào)的無(wú)菌脫毒苗，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 生化試劑激素（6-BA、NAA、GA3等）及MS 培養(yǎng)基等其他常用的生化試劑購(gòu)自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗繁殖培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件MS 培養(yǎng)基干粉40g，加蒸餾水定容至1L，攪拌加熱至完全溶解，使用1mol/L NaOH 調(diào)整pH 值至5.8～6.0，121℃高壓滅菌20min 后冷卻備用。

在馬鈴薯分子實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)間進(jìn)行無(wú)菌苗繁殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度2000～2500lx。白天采用日光燈帶與紅藍(lán)光燈帶同時(shí)補(bǔ)光。

1.2.2 外植體表面消毒取生長(zhǎng)4 周的晉薯16 號(hào)無(wú)腋芽脫毒苗莖段，用以下方法進(jìn)行消毒：75%的酒精浸泡30s，1.5%、2%和2.5%的次氯酸鈉依次浸泡60s，無(wú)菌水清洗3 遍后用濾紙吸干外植體表面液體，置于MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每皿20 個(gè)莖段，共3 皿，5d 后統(tǒng)計(jì)污染數(shù)量。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（CIM）及培養(yǎng)條件MS培養(yǎng)基加不同濃度組合的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和TMT（特美?。AA 設(shè)置3 個(gè)濃度，分別為0.3mg/L、0.5mg/L 和1.0mg/L；6-BA設(shè)置3 個(gè)濃度，分別為1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；TMT 為200mg/L。培養(yǎng)條件和無(wú)菌苗繁殖培養(yǎng)相同。

1.2.4 愈傷組織分化培養(yǎng)基（CDM）及培養(yǎng)條件MS 培養(yǎng)基加不同濃度組合的6-BA、GA3（赤霉素）、ZT（玉米素）和TMT。6-BA 設(shè)置3 個(gè)濃度，分別為1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；GA3設(shè)置5 個(gè)濃度，分別為0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L 和2.5mg/L；ZT 為1.0mg/L；TMT 為200mg/L。培養(yǎng)條件和無(wú)菌苗繁殖培養(yǎng)相同。

1.2.5 不同外植體的篩選選擇健壯晉薯16 號(hào)無(wú)菌苗，培養(yǎng)基使用激素配比為NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+TMT 200mg/L 的CIM 培養(yǎng)基，在馬鈴薯分子實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)間進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，10d 后轉(zhuǎn)入激素配比為ZT 1.0mg/L+GA31.0mg/L+TMT 200mg/L 的CDM 培養(yǎng)基，每10d 更換CDM 培養(yǎng)基，隨時(shí)觀(guān)察分化情況。培養(yǎng)溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度2000～2500lx。

采取不同外植體培養(yǎng)：（1）莖段：取1cm 長(zhǎng)無(wú)腋芽莖段，置于CIM 培養(yǎng)基上；（2）葉片：取邊長(zhǎng)約0.5cm 并留部分葉柄的葉片，置于CIM 培養(yǎng)基上。

1.2.6 根的誘導(dǎo)選用1cm 左右?guī)б秆康那o段，分別接入含有30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的MS 培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)不定根。每皿20 個(gè)莖段，每個(gè)濃度3 皿，分3 個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強(qiáng)度2000～2500lx，隨時(shí)觀(guān)察不同培養(yǎng)基上根的生長(zhǎng)情況，30d 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率、根分化率的計(jì)算方法見(jiàn)以下公式。試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析使用Microsoft Excel 和SPSS 18 完成。

愈傷組織誘導(dǎo)率=出現(xiàn)愈傷外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%

芽分化率=分化出不定芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%

根分化率=出現(xiàn)不定根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%

污染率=污染的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的篩選理論上任何外植體在合適的條件下均可脫分化形成愈傷組織，但在實(shí)踐中，外植體不同，愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的效果不同。試驗(yàn)選取晉薯16 號(hào)無(wú)菌苗健壯的葉片及無(wú)腋芽莖段為外植體，進(jìn)行愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)階段，莖段產(chǎn)生較多的愈傷組織，顏色淡綠色，質(zhì)地緊密；不定芽誘導(dǎo)階段，莖段產(chǎn)生不定芽比葉片速度快且數(shù)量多。莖段和葉片的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為60%和25%，因此莖段可作為最佳外植體。

2.2 不同濃度次氯酸鈉消毒效果消毒的原則是殺死材料上附著的微生物又不傷害外植體的活細(xì)胞。試驗(yàn)使用3 種濃度次氯酸鈉對(duì)外植體表面進(jìn)行消毒，結(jié)果表明，1.5%次氯酸鈉不能有效殺滅外植體上的微生物，外植體顏色淡綠，但污染率20%～30%；2%次氯酸鈉可殺滅多數(shù)微生物，外植體兩端有輕微變白現(xiàn)象，并不影響后期愈傷組織誘導(dǎo)及分化；2.5%次氯酸鈉可有效殺菌，但因濃度高，外植體細(xì)胞受損嚴(yán)重，外植體兩端出現(xiàn)白化死亡現(xiàn)象。因此可選擇使用2%的次氯酸鈉對(duì)晉薯16 號(hào)莖段外部消毒。

2.3 不同激素及濃度組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率及質(zhì)量的影響愈傷組織指在無(wú)菌條件下將外植體某一部分置于適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，加入濃度配比適合的植物激素，經(jīng)誘導(dǎo)期、分裂期及形成期3 個(gè)階段形成的一團(tuán)不定型組織（由薄壁細(xì)胞組成）。因此愈傷組織的誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)質(zhì)量主要受培養(yǎng)條件、植物激素的組合及濃度配比的影響。

晉薯16 號(hào)莖段接種到含NAA 和6-BA 的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d 左右，莖段兩端切口處開(kāi)始膨大，5d 左右出現(xiàn)愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)70%以上。愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷組織形成質(zhì)量因2 種激素配比濃度不同出現(xiàn)差異。

由表1 可知，愈傷組織質(zhì)量及誘導(dǎo)率受NAA和6-BA 影響，6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L、6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L、6-BA 2.5mg/L+NAA 1.0mg/L這3 組誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，質(zhì)地緊密有光澤，愈傷組織量多且顏色呈黃綠色，莖段無(wú)白色不定根出現(xiàn)，誘導(dǎo)率可達(dá)87%以上。CIM5 愈傷組織邊緣無(wú)褐變，后期在組織分化培養(yǎng)中表現(xiàn)也較好，CIM7 和CIM8 愈傷組織后期褐變嚴(yán)重，所以CIM5 為愈傷誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。培養(yǎng)10d 后觀(guān)察，由于培養(yǎng)基中水分、養(yǎng)分的損耗及代謝時(shí)有毒物質(zhì)的積累，愈傷組織塊生長(zhǎng)速度漸緩，兩端出現(xiàn)較輕的褐化現(xiàn)象，此時(shí)需及時(shí)轉(zhuǎn)移到CDM 培養(yǎng)基中，否則褐化現(xiàn)象將加劇直至莖段死亡。

表1 MS 添加不同濃度NAA、6-BA 對(duì)晉薯16 號(hào)愈傷組織的影響

2.4 不同激素及濃度組合對(duì)愈傷組織分化率影響

由表2 可知，激素6-BA、GA3和ZT 的組合有利于晉薯16 號(hào)不定芽的產(chǎn)生，組合6-BA 2.5mg/L+GA31.5mg/L+ZT 1.0mg/L、6-BA 1.0mg/L+GA31.0mg/L+ZT 1.0mg/L 和6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L芽分化率普遍比較高，可達(dá)23%以上，CDM5 的芽分化率最高，達(dá)32.6%，分化速度較快，兩周左右可以觀(guān)察到較多叢生芽。隨著GA3濃度提高褐化率也提高，添加ZT 對(duì)褐化情況有一定抑制作用，愈傷組織量多且質(zhì)地緊密，分化的速度快。本組實(shí)驗(yàn)中培育出的叢生芽質(zhì)量好、數(shù)量多、容易擴(kuò)繁，擴(kuò)繁后的試管苗也比較健壯，說(shuō)明反式玉米素核苷對(duì)馬鈴薯愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽有促進(jìn)作用。

表2 MS 添加不同激素組合及濃度對(duì)晉薯16 號(hào)愈傷組織分化的影響

2.5 蔗糖對(duì)晉薯16 號(hào)生根的影響使用馬鈴薯晉薯16 號(hào)帶腋芽的莖段為外植體，在添加了30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培育5～6 周后，觀(guān)察生根情況。由圖1 可知，隨著蔗糖濃度的增加，生根率呈先增加后降低的趨勢(shì)；蔗糖濃度為50g/L時(shí)，生根率最高，為81.3%；蔗糖濃度繼續(xù)增加，生根率下降。因此，蔗糖濃度為50g/L 為晉薯16 號(hào)生根最適宜的濃度。

圖1 蔗糖濃度對(duì)晉薯16 號(hào)根誘導(dǎo)的影響

3 討論與結(jié)論

在馬鈴薯再生體系外植體的選擇上，馬鈴薯莖段、葉片及莖尖通過(guò)組織誘導(dǎo)及分化形成再生植株的再生率較高[6，12]，被認(rèn)為是經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)得到再生植株很好的材料。不同基因型外植體對(duì)不同的誘導(dǎo)劑敏感程度不同，對(duì)于馬鈴薯來(lái)說(shuō)，常用的生長(zhǎng)素是NAA 和2，4-D，細(xì)胞分裂素是6-BA，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS[13-15]。

本試驗(yàn)以馬鈴薯品種晉薯16 號(hào)為外植體，建立了無(wú)菌外植體通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)及分化途徑的植物離體組織培養(yǎng)體系。愈傷組織誘導(dǎo)通過(guò)激素6-BA和NAA 的組合產(chǎn)生，誘導(dǎo)愈傷組織分化叢生芽通過(guò)激素6-BA、GA3和ZT 的組合產(chǎn)生，得出晉薯16 號(hào)外植體莖段使用濃度為2%的次氯酸鈉消毒效果較好，愈傷誘導(dǎo)外植體選擇莖段較好，晉薯16 號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L為佳，愈傷組織分化培養(yǎng)基以組合MS+6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L 為佳，根的誘導(dǎo)使用50g/L 蔗糖。

本研究對(duì)山西主要種植品種晉薯16 號(hào)高效再生體系進(jìn)行了建立優(yōu)化，為后續(xù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷轉(zhuǎn)化體系的創(chuàng)建提供重要的基礎(chǔ)和指導(dǎo)，對(duì)晉薯16號(hào)的品種改良具有重要意義。