Ⅰ型膠原蛋白生物膜在損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程中的作用

胡興峰，李青松，季 亮，張博偉

(貴陽市第四人民醫(yī)院骨三科，貴州 貴陽 550002)

肌腱是連接肌肉與骨，并傳遞由肌肉產(chǎn)生的力從而帶動(dòng)骨與關(guān)節(jié)活動(dòng)的單軸致密纖維結(jié)締組織[1]，在機(jī)體關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)中起著極為重要的作用。肌腱損傷后往往導(dǎo)致患肢功能障礙甚至勞動(dòng)力喪失，對(duì)患者生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

近年來，關(guān)于如何促進(jìn)損傷肌腱的再修復(fù)、提高肌腱愈合質(zhì)量并最終恢復(fù)患者肢體功能的分子生物學(xué)水平研究較多[2]。Wu等[3]發(fā)現(xiàn)，通過基因轉(zhuǎn)染方法可以有效提高肌腱愈合程度；Mao等[4]將血管內(nèi)皮生長因子轉(zhuǎn)染腺病毒載體后植入損傷肌腱，證實(shí)轉(zhuǎn)染的基因可以提高肌腱自然愈合的能力，加速肌腱細(xì)胞增殖，促進(jìn)肌腱愈合；還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植后可以被誘導(dǎo)向肌腱細(xì)胞分化，高表達(dá)肌腱標(biāo)志物及Ⅰ型膠原蛋白，顯著提高肌腱愈合質(zhì)量[5-6]。以上研究均能促進(jìn)肌腱愈合，但是都未能解決損傷肌腱術(shù)后粘連導(dǎo)致功能障礙的問題。因此，有研究嘗試在損傷肌腱周圍建立可降解的生物屏障以降低粘連發(fā)生率，取得較好效果[7]。目前報(bào)道的可用于防粘連的生物材料有五十余種[8]，且這些生物材料大多可被完全吸收，其作用機(jī)制是通過干擾肌腱外源性愈合，從而為損傷肌腱提供良好的生物屏障，達(dá)到預(yù)防粘連的效果[9]。然而可吸收醫(yī)用防粘連材料在預(yù)防肌腱粘連的同時(shí)，是否在損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程也有促進(jìn)作用，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究選擇Ⅰ型膠原蛋白生物膜(以下簡(jiǎn)稱生物膜)進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討生物膜在肌腱內(nèi)源性愈合過程中的作用，以期為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量220 g左右，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司。大鼠自由飲水、進(jìn)食，于溫度23～25 ℃動(dòng)物房12 h/12 h晝夜交替適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017年)。本研究經(jīng)貴陽市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要儀器與試劑 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(博訊，上海)，超凈工作臺(tái)(VS-1300，蘇州)，Ⅰ型膠原蛋白生物膜(無錫貝迪生物，江蘇)，倒置顯微鏡、照相系統(tǒng)(OLYMPUS，日本)，激光共聚焦熒光顯微鏡、切片機(jī)、展片機(jī)、烤片機(jī)(Leica，德國)，多聚甲醛(生工，上海)，蘇木素染液(南京建成，江蘇)，伊紅染液(碧云天，上海)，中性樹脂(國藥集團(tuán)，上海)。一抗：兔來源Anti Collagen I(博奧森，北京)，二抗：山羊抗兔Anti CY3(abcam，英國)。免疫熒光一抗稀釋液(碧云天，上海)，免疫熒光二抗稀釋液(碧云天，上海)，山羊血清(Hyclone，美國)，DAPI染色液(碧云天，上海)，抗熒光淬滅劑(碧云天，上海)。

1.2 大鼠損傷肌腱模型建立及分組

將16只大鼠分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。大鼠稱重，7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉生效后常規(guī)備皮，75%酒精棉球消毒；沿跟腱位置縱向切開顯露肌腱，切除腱鞘約1 cm，在腱性移行部至跟腱止點(diǎn)的中點(diǎn)處銳性橫斷。對(duì)照組在跟腱離斷后，采用改良Kessler法縫合，用無菌PBS沖洗2～3次；實(shí)驗(yàn)組在跟腱離斷，改良Kessler法縫合后，剪下2 cm×1 cm的生物膜包裹住跟腱縫合部位并使其與腱組織緊密貼合。2組大鼠術(shù)后局部注射青霉素抗感染，關(guān)閉手術(shù)切口，予以石膏外固定，隔日換藥1次。

1.3 取材

分別于治療后第1、2、3、4周取材，每組每次取2只大鼠，共4個(gè)樣本。解剖顯露手術(shù)區(qū)域，行大體觀察，包括傷口皮膚顏色、溫度、滲出及深部組織愈合情況等。進(jìn)一步解剖損傷處跟腱組織，觀察跟腱損傷處愈合及生物膜吸收情況。取損傷處肌腱組織，無菌PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，于4 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 HE染色觀察

將組織分別浸泡在75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ和100%乙醇Ⅱ中10 min進(jìn)行脫水。將脫水后的組織分別浸泡在1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min進(jìn)行透明。將透明處理的組織浸泡于融化的石蠟中3 h，進(jìn)行包埋。用切片機(jī)將石蠟塊中的組織切成5 μm薄片，并將其緊貼平鋪于防脫玻片上，置于55 ℃烤片機(jī)上。將石蠟切片分別浸泡于1,2-二甲苯、1,3-二甲苯、1,4-二甲苯中10 min脫蠟，隨后浸泡于100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇、75%乙醇中5 min。雙蒸水清洗3次，每次2 min。切片蘇木素染色10 min，自來水沖洗多余染色液約5 min，蒸餾水再洗滌1遍(數(shù)秒即可)。若蘇木素著色過深則可用1%鹽酸酒精脫去細(xì)胞質(zhì)中多余的蘇木素染色液。伊紅染色30 s，自來水沖洗多余染液約3 min，蒸餾水再洗滌1遍。中性樹脂封片。用光學(xué)顯微鏡觀察炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原纖維的分化情況，并進(jìn)行分析。

1.5 免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)

切片、脫蠟、復(fù)水同HE染色，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，于微波爐內(nèi)加熱，使容器內(nèi)液體溫度保持在92～98 ℃，保持10～15 min。取出容器，室溫冷卻10～20 min。PBS清洗，蒸餾水清洗，PBS浸泡5 min。在切片組織上滴加山羊血清，室溫封閉60 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張切片組織滴加足夠量的一抗Collagen I(1∶100)并放入濕盒，于4 ℃孵育過夜；取出濕盒，室溫復(fù)溫30 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干切片上多余液體后滴加熒光二抗CY3(1∶800)，濕盒中于37 ℃孵育60 min(注：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都在暗處進(jìn)行)。PBS浸洗3次，每次3 min。滴加DAPI避光孵育15 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBS浸洗4次，每次5 min以洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干切片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。每6孔板中隨機(jī)選擇2孔，每孔5個(gè)視野進(jìn)行拍照，并用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。每個(gè)高倍視野下計(jì)算能夠表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白特性的細(xì)胞比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 損傷肌腱標(biāo)本大體觀察

治療后1周，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)切口利用血管鉗鈍性分離顯露深層組織，皮膚和周圍組織可見水腫，肌腱修復(fù)區(qū)域愈合不牢，輕輕牽拉即可見組織分離，生物膜清晰可辨，并且較易與肌腱組織分開；對(duì)照組亦可見周圍組織水腫，肌腱斷端接觸良好。治療后2周，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)切口愈合良好，需銳性切開顯露，手術(shù)區(qū)域組織水腫表現(xiàn)不明顯，生物膜與肌腱組織及肌腱斷端聯(lián)系緊密；對(duì)照組可見損傷肌腱處與周圍組織輕微粘連，但輕微鈍性分離即可分開。治療后3周，實(shí)驗(yàn)組手術(shù)切口愈合，生物膜與肌腱組織聯(lián)系致密，不能將其完整分開，并且生物膜出現(xiàn)液化降解現(xiàn)象，肌腱損傷處與周圍組織界限清楚，肌腱活動(dòng)較好；對(duì)照組損傷肌腱處可見與周圍組織形成粘連帶。治療后4周，實(shí)驗(yàn)組見生物膜被降解吸收，損傷肌腱組織與周圍組織有明顯界限，肌腱活動(dòng)不受限制；對(duì)照組肌腱損傷處與周圍組織粘連帶更加明顯，肌腱活動(dòng)較差。

2.2 損傷肌腱修復(fù)后組織學(xué)觀察

治療后1周，2組損傷肌腱組織周圍出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞和少量嗜中性粒細(xì)胞，未見巨噬細(xì)胞，少量成纖維細(xì)胞聚集。隨著時(shí)間延長，到第3～4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)區(qū)生物膜外大量成纖維細(xì)胞聚集和瘢痕組織形成，膜內(nèi)肌腱細(xì)胞膠原纖維沉積呈線性排列，方向一致，較為整齊，并見肌腱細(xì)胞長入生物膜內(nèi)(圖1)；而對(duì)照組損傷肌腱組織周圍可見大量成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管向正常肌腱細(xì)胞浸潤，與肌腱細(xì)胞融合，可見極少量嗜酸性粒細(xì)胞，膠原纖維排列紊亂，肌腱外源性愈合優(yōu)勢(shì)明顯(圖2)。

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

2.3 免疫熒光檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，2組成熟新生肌腱細(xì)胞多表達(dá)Ⅰ型膠原，核被染成藍(lán)色熒光，顯微鏡下觀察可見熒光足夠亮，并能實(shí)現(xiàn)照片曝光；隨著治療時(shí)間延長，2組Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)均增加，熒光能夠穩(wěn)定較長時(shí)間，且實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，膠原纖維排列更加有序(圖3、4)。

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

a：治療后1周；b：治療后2周；c：治療后3周；d：治療后4周

2.4 Ⅰ型膠原蛋白特性的細(xì)胞比例

治療后2組表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白特性的細(xì)胞比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 Ⅰ型膠原蛋白特性的細(xì)胞比例

3 討論

肌腱損傷在創(chuàng)傷外科較為常見，損傷后肌腱愈合的質(zhì)量直接影響到患者的肢體功能，肌腱愈合是由內(nèi)源性和外源性共同作用的一個(gè)復(fù)雜過程[10]。其中，內(nèi)源性愈合主要依靠肌腱細(xì)胞的增殖來完成修復(fù)，其修復(fù)過程屬于同源性修復(fù)[11]；而外源性愈合則是通過周圍組織的成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生完成修復(fù)，其修復(fù)過程屬于非同源性修復(fù)，這也是外源性愈合最終導(dǎo)致肌腱粘連的原因[12]。

國內(nèi)外學(xué)者嘗試應(yīng)用各種生物或者非生物材料作為損傷肌腱修復(fù)的物理屏障，預(yù)防肌腱術(shù)后粘連，這些材料大致可分為兩大類，即以羊膜、膠原蛋白、殼聚糖為代表的天然生物材料類和以聚合物為代表的人工合成類。白江博等[13]發(fā)現(xiàn)新鮮羊膜對(duì)于早期肌腱修復(fù)更具有優(yōu)勢(shì)；然而Lepp?nen等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，利用同種異體羊膜移植并不能有效提高肌腱的一期愈合效果，但也指出這可能與技術(shù)因素有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過靜電紡絲技術(shù)制備的電紡聚乳酸—羥基乙酸共聚物/Ⅰ型膠原—聚己內(nèi)酯雙層膜具有組織相容性好、無毒等優(yōu)點(diǎn)，可通過電紡聚乳酸—羥基乙酸共聚物抑制成纖維細(xì)胞生長、Ⅰ型膠原—聚己內(nèi)酯促進(jìn)肌腱細(xì)胞黏附存活，有效預(yù)防肌腱斷裂后腱周粘連的發(fā)生[15]；另有研究報(bào)道這種多層電紡生物膜不但在預(yù)防肌腱粘連方面有優(yōu)勢(shì)，而且具有抗炎作用[16-17]。Yousefi等[18]利用納米技術(shù)制備了一種新型納米氧化鋅(ZnO)納米殼聚糖材料用于促進(jìn)損傷肌腱修復(fù)，8周后材料被完全吸收，肌腱周圍無炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，粘連少。這些新型材料在肌腱愈合預(yù)防粘連方面均有良好的效果。本研究選用的生物膜是由2～3周歲黃牛跟腱經(jīng)化學(xué)提取合成的高純度的具有三維空間結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組損傷肌腱與周圍組織界限清楚，極少粘連，肌腱愈合質(zhì)量明顯高于對(duì)照組。說明使用Ⅰ型膠原蛋白生物膜能夠有效阻止損傷肌腱的外源性愈合過程，并且生物膜能夠充分被吸收，生物相容性好，可有效預(yù)防其術(shù)后粘連的發(fā)生。

膠原蛋白具有低免疫原性、高生物相容性和高組織降解性等特點(diǎn)[19]，是目前的研究熱點(diǎn)。查朱青等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型牛膠原蛋白生物膜不僅可以有效減少粘連，還可以增強(qiáng)損傷肌腱愈合的生物力學(xué)特性；單海民等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型牛膠原蛋白生物膜安全有效，且在預(yù)防肌腱術(shù)后粘連方面有優(yōu)勢(shì)。近年來，膠原蛋白更是被作為一種天然的生物資源而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域生物材料的制作[22]。Müller等[23]認(rèn)為Ⅰ型膠原蛋白海綿可促進(jìn)損傷肌腱愈合，但未闡明具體機(jī)制；Rieu等[24]認(rèn)為在組織工程方面，膠原蛋白支架在損傷肌腱修復(fù)及預(yù)防術(shù)后粘連上具有廣闊的應(yīng)用前景。肌腱損傷的愈合過程是多因素共同作用的結(jié)果，隨著研究的深入，不僅有新的治療方法報(bào)道，研究者們也從以往的單純阻止肌腱外源性愈合過程到現(xiàn)在如何同時(shí)促進(jìn)損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程方向發(fā)展，更加關(guān)注于肌腱愈合的質(zhì)量和肢體的功能恢復(fù)[25]。本研究選擇Ⅰ型膠原蛋白生物膜進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步驗(yàn)證了生物膜對(duì)損傷肌腱內(nèi)源性愈合起到了促進(jìn)作用。免疫熒光檢測(cè)能夠?qū)‰靸?nèi)源性愈合過程中起主要作用的Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行標(biāo)記追蹤，直觀反映出生物膜在損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程中起到的作用。本研究免疫熒光結(jié)果表明，2組Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)均增加，熒光能夠穩(wěn)定較長時(shí)間，且實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，膠原纖維排列更加有序，這為以后對(duì)生物膜促進(jìn)損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程的具體作用機(jī)制的研究提供新的方向。

綜上所述，Ⅰ型膠原蛋白生物膜材料在損傷肌腱內(nèi)源性愈合過程中有明顯促進(jìn)作用。